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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.55 No.4 pp.1-9
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2021.55.4.1

CRISPR/Cas9 Gene Editing Technology and Its Applications in Pigs

Kwang-Keun Cho*, Seo-Yeong Park
Department of Animal Resources Technology, Gyeonsang National University, Jinju, 52725, Korea
* Corresponding author: Kwang-Keun Cho Tel: +82-55-772-3286 Fax: +82--55-772-3689 Email: chotwo2@gnu.ac.kr
June 11, 2021 ; July 20, 2021 ; August 9, 2021

Abstract


The emerging CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas (CRISPR-associated protein) 9 gene editing technology is rapidly changing the traditional approach to biomedical research and animal industry such as organ transplantation. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and infectious gastroenteritis virus (TGEV) are lethal viruses that cause major economic losses to pig production. The double gene knockout (DKO) pigs against these viral receptor proteins CD163 and pAPN showed resistance to PRRSV and TEGV, and there were no differences in meat production and reproductive performance traits compared to wild-type (WT) pigs. These results show that breeding by viral resistance genetic modification can be achieved by applying CRISPR-Cas9 mediated gene editing technology to economic animal pigs, providing a breeding starting point for the production of disease-resistant pigs. Interspecies blastocyst complementation enables organ-specific enrichment of xenogenic pluripotent stem cell derivatives. CRISPR-Cas9-mediated zygote gene editing was used to create a mouse host incapable of pancreatogenesis, nephrogenesis, hepatogenesis and vasculogenesis. Chimera was created by combining this host with a blastocyst complementation platform. In addition, using fibroblasts from ungulates such as pigs and cows, genome-edited cloned embryos were produced. Primary cultured fibroblasts were used for generating cloned embryos as the host embryos for blastocyst complementation. The combination of CRISPR/Cas9 gene editing technology and an interspecies blastocyst complementation platform strategy is particularly useful for generating genetically modified pigs. Therefore, this review paper introduces CRISPR/Cas9 gene editing technology, interspecies blastocyst complementation platform, disease resistance pigs, and human-pig chimera production for xenotransplantation purposes.



CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술과 돼지에서 응용

조광근*, 박서영
경상국립대학교 생명과학대학 동물소재공학과

초록


새롭게 부상하는 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas (CRISPR-associated protein) 9 유전자 편집 기술은 장기 이식(organ transplantation)과 같은 생의학 연구(biomedical research)와 동물 산업에 대한 전통적인 접근 방식을 빠르게 변화시키고 있다. 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PRRSV)와 전염성 위장염 바이러스 (transmissible gastroenteritis coronavirus; TGEV)는 돼지 산업에 막대한 경제적 손실을 초래하는 치명적인 바이러스이다. 바이러스의 숙주 수용체 단백질 CD163과 pAPN에 대한 이중 유전자 녹아웃(double knock-out; DKO) 돼지는 PRRSV와 TEGV에 내성을 나타내었으며, 정상(wild-type; WT) 돼지와 비교할 때 성장과 생식 특성의 차이가 없었다. 이러한 결과는 경제 동물 돼지에 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집 기술을 적용하여 바이러스 저항성 유전자 변형에 의한 품종 개량이 달성될 수 있다는 것을 보여주며, 질병 저항성 돼지 생산을 위한 육종 시작점을 제공한다. 종간 배반포 보완(interspecies blastocyst complementation)은 이종 만능 줄기세포 유도체(xenogenic pluripotent stem cell derivatives)의 장기 특이적 생산(organ-specific enrichment)을 가능하게 한다. CRISPR-Cas9 매개 접합자 유전자 편집(CRISPR-Cas9-mediated zygote gene editing) 을 이용하여 췌장 생성(pancreatogenesis), 신장 생성(nephrogenesis), 간 생성(hepatogenesis) 및 혈관 생성(vasculogenesis)이 불가능 생쥐 숙주를 만들었으며, 이러한 숙주와 배반포 보완 플랫폼을 결합하여 키메라를 만들었다. 또한 돼지와 소 같은 유제류(ungulate)의 섬유아세포(fibroblasts)를 이용하여 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집과 체세포 핵 치환(somatic cell nuclear transfer) 과정을 거쳐 복제 배아(genome-edited cloned embryos) 를 생산하였다. 복제 배아의 1차 배양 섬유아세포(primary cultured fibroblasts)를 재복제하여 배반포 보완을 위한 숙주 배아로 이용하였다. CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술과 종간 배반포 보완 플랫폼 전략의 조합은 유전자 변형 돼지를 생산하는 데 유용하다. 본 논문에서는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술과 배반포 보완 플랫폼, 질병 저항성(disease resistance) 돼지, 이종장기이식(xenotransplantation) 목적의 키메라 생산을 소개하고자 한다.



    서론

    돼지는 농업과 생체의학(biomedicine)에서 큰 가능성을 가지고 있는 동물이다. 또한 돼지는 중요한 육류 공급원이며, 세계적으로 가장 일반적으로 소비되는 육류를 제공한다. 인간은 오랜 기간 동 안 선발 육종(selective breeding)을 통해 원하는 특성이 있는 돼지 를 생산해 왔다(Ruan et al., 2017). 그러나 선발 육종은 이제 형질 전환(random transgenesis)이나 유전자 녹아웃(knockouts) 또는 녹인(knockins)을 포함한 유전자 변형(genetic modification)을 통해 실질적으로 혁신되고 가속화되고 있다(Gaj et al., 2013). 이 러한 혁신적인 유전자 변형 방법으로 육류 생산(meat production) 증가(Rao et al., 2016)와 지방 침착(fat deposition) 감소(Zheng et al., 2017) 또는 질병 저항성(disease resistance) 향상(Yang et al., 2018) 등과 같은 중요한 경제적 특성을 가진 돼지가 생산되 어 귀중한 육종 소재로 사용되고 있다. 생체의학 연구에서 돼지는 다른 동물에 비해 중요한 동물 모델로 이용된다. 설치류 모델 (rodent model)과 비교할 때 돼지는 신체/장기 크기(body/organ size), 수명(lifespan), 해부학(anatomy), 생리학(physiology) 및 신진대사 프로필(metabolic profile) 측면에서 인간과 매우 높은 유사성을 공유하고 있다. 돼지는 원숭이와 같은 영장류(non-human primate)에 비해 저렴하고 배아 조작 기술이 잘 개발되어 있 어 이종장기이식(xenotransplantation) 중 발생하는 이식 거부 (transplant rejection) 반응이 최소화된 장기를 제공할 수 있다 (Hryhorowicz et al., 2017).

    박테리아가 진화 과정에서 다른 생명체와 생존 경쟁을 위해 만든 방어 무기가 오늘날 인간의 질병 치료를 위해 사용하고 있는 항생제 (antibiotics) 이며(Wells, 1952), 박테리아 내부로 침입하는 박테리 오파지 DNA를 제거하기 위하여 만든 무기가 유전공학을 탄생할 수 있게 한 제한 효소(restriction enzyme)이다(Luria & Human, 1952;Arber, 1965;Kelly & Smith, 1970;Danna & Nathans, 1971). 박테리아의 생존 전략이 더욱 진화하여 한번 침입한 박테리 오파지 DNA를 제거하고 DNA 일부를 염색체에 저장한 후 박테리 오파지가 다시 침입하면 저장된 DNA에 근거하여 박테리오파지를 제거하는 무기가 적응 면역(adaptive immune), CRISPR/Cas system이다(Ishino et al. 1987). 게놈 편집(genome editing) 기능이 있는 기존 nuclease 중 CRISPR-Cas system은 ZFN (zinc-finger nuclease)이나 TALEN (transcription activator-like effector nuclease) 보다 설계(design)의 단순성이나 다목적성(versatility) 부 분에서 우수하다(Gupta & Musunuru, 2014). 2013년까지 포유류 세포 게놈을 조작하기 위한 CRISPR/Cas9 system의 이용 가능성 이 실험적으로 검증되었으며, Cas9 effector complex의 결정 구조 는 2014년에 밝혀졌다(Hsu et al., 2014). 세균(bacteria)과 고세균 (archaea)에서 발견된 세 가지 CRISPR/Cas system (I–III) 중에서 Streptococcus thermophilusStreptococcus pyogenes에서 유래 한 type II system이 게놈 공학(genome engineering) 목적으로 가장 적합하다(Sontheimer & Barrangou, 2015). 따라서 본 논문에 서는 CRISPR/Cas system Ⅱ의 작용 기전과 돼지를 대상으로 하는 연구를 소개하고자 한다.

    1. CRISPR/Cas9 system

    CRISPR/Cas system은 대장균의 iap (alkaline phosphatase isozyme conversion enzyme) 유전자 서열 규명으로 처음 알려지 게 되었으며, 짧고 반복적인 DNA 염기 서열(길이 20~40bp, “repeats”라고 함)에 비반복적 서열(nonrepetitive sequence, “spacer”라고 함)이 끼어들어 있는 구조로 되어 있다(Ishino, 1987). 그 후 이러한 반복적인 서열이 많은 박테리아와 고세균에 존재한다는 사실이 발견되었고, 특히 spacer가 plasmid나 transposon, bacteriophage와 같은 외인성 이동유전요소(exogenous mobile genetic element)에 존재하는 유전자 서열과 같다는 사실 도 발견되었다(Bolotin et al., 2005;Mojica et al., 2005). 이러한 CRISPR array는 endonuclease와 helicase family 또는 다른 nucleic acid binding protein과 유사한 Cas 유전자와 연관되어 있다 (Makarova et al., 2006). 새로운 spacer 서열은 bacteriophage 감염 후 CRISPR array에 자연적으로 획득되며, 이후 같은 bacter iophage의 재감염이 일어나면 DNA 서열 특이적 내성을 가지는 원핵생물의 적응 면역 기전(adaptive immunity mechanism)이 나 타난다(Staals et al., 2013). 현재 CRISPR/Cas system에 의한 RNA 유도 간섭(RNA-directed interference) 기전은 대부분 밝혀 졌다(Rath et al., 2015). CRISPR 매개 간섭(CRISPR-mediated interference)은 spacer 획득(spacer acquisition), crRNA 전사 및 성숙(crRNA transcription과 maturation) 및 표적 식별 및 절단 (target identification과 cleavage)의 과정으로 일어난다(Plagens et al., 2015).

    1단계(phase 1) 면역/획득에서 ① 외부에서 박테리아로 들어가 는 bacteriophage의 핵산(foreign nucleic acids)은 Cas1과 Cas2 에 의하여 CRISPR locus에 삽입될 수 있는 짧은 spacer 크기 서열(short, spacer-sized sequence)로 식별, 처리되어 ② 박테리아 의 CRISPR locus 반복 서열(repeat sequence) 내로 들어간다 (Fig. 1 ①-)(Ghorbani et al., 2021). 2단계(phase 2) 방어와 저항에서 ③ 똑같은 bacteriophage의 재침투가 일어날 때 CRISPR locus에서 pre-crRNA와 tracerRNA (trans-activating crRNA)가 전사되어 ④ pre-crRNA는 guide RNA(gRNA)로 가 공된다. ⑤ gRNA는 ribonucleoprotein Cas9과 결합하여 ⑥ gRNA와 상보성을 가지는 bacteriophage의 표적 핵산(target nucleic acid)을 식별하여 절단한다(Fig. 1 ③-).

    2. Cas9-mediated crRNA maturation

    CRISPR array는 먼저 하나의 긴 pre-crRNA 전사체로 만들어 진 후, 표적 특이적인 개별 crRNA로 가공된다. 하나의 성숙된 spacer 특이 crRNA (spacer-specific crRNA)는 CRISPR-Cas locus 내에서 전사되는 tracrRNA 그리고 Cas9 단백질과 함께 복합 체를 형성한다. tracrRNA는 multiple stem-loop 구조로 되어 있으 며, CRISPR repeat 서열과 부분적으로 상보적인 서열을 가지고 있어서 crRNA와 결합할 수 있다(Chylinski et al., 2013). RNase III (dsRNA endonuclease)는 tracrRNA:crRNA duplex의 dsRNA 구조를 인식하고 절단한다(Deltcheva et al., 2011). tracrRNA:crRNA duplex는 Cas9에 단단히 결합하여 RNA:Cas9 복합체를 형성한 후 crRNA spacer와 상보성을 가진 표적을 식별 하고 절단한다(Fonfara et al., 2014).

    3. Cas9 target interference

    Cas9은 2개의 옆 즉 큰 α-helical lobe와 작은 nuclease lobe로 구성되며, 중앙에 표적 DNA를 배치하기 위해 2개의 옆이 조개 모양(clam-like shape)을 형성한다(Fonfara et al., 2014). Cas9은 자신의 염색체를 표적으로 삼지 않도록 DNA의 표적 영역에 인접 한 PAM motif (protospacer adjacent motif; NGG 또는 NAG)를 인식한다(Gasiunas et al., 2012). 표적 서열의 PAM-proximal region이 spacer와 완벽한 상보성을 갖는 경우, RNA:DNA heteroduplex를 형성한다(Nishimasu et al., 2014). Cas9 nuclease lobe 의 HNH endonuclease domain은 PAM의 상류에서 RNA 3개 nucleotide에 결합된 DNA 가닥을 절단하는 반면, 비상보성 가닥 은 Cas9 nuclease lobe의 RuvC domain에 의해 절단된다 (Nishimasu et al., 2014). 이러한 활성 부위는 마그네슘 2가 이온 을 우선하여 사용하지만, 칼슘에 의해 활성이 억제된다(Anders et al., 2014).

    4. Spacer acquisition

    CRISPR-Cas system (Type II)은 적응 면역(adaptive immune) 을 위해 모든 구성 요소(Cas1, Cas2, Cas9, Csn2 및 tracrRNA)와 복합체를 형성한다(Wei et al., 2015). 외부 핵산이 침입하면 CRISPR–Cas system은 spacer (protospacer)로 통합될 것에 인접한 PAM 서열을 식별한다(Heler et al., 2015). Spacer는 chromosomal array 삽입된 후 DNA 중합 효소에 의해 복구되어 염색체 내 새로운 반복 spacer가 생성되며, 향후 외부 침입으로부 터 자신을 보호하기 위한 crRNA로 전사된다(Nunez et al., 2015).

    유전자 편집을 목적으로 표적 세포에 유전자 변형을 도입하고 자 할 때 먼저 Cas9 유전자와 Cas9 유도를 위한 gRNA (crRNA 와 tracrRNA) 유전자가 포함된 vector를 설계한다(Fig. 2). 포유 류 세포나 배아에 vector를 도입(transfection 또는 transduction) 시키면, Cas9 유전자는 핵에서 전사되어 세포질로 나와 활성 단 백질로 번역된다. 또한 gRNA 유전자도 핵에서 전사되어 세포질 로 나와 Cas9 단백질과 결합하여 ribonucleic-protein effector complex를 형성하고 다시 핵으로 내재화(internalize)된다. crRNA의 20개 염기 서열은 PAM 서열에 인접한 표적 유전자 서열과의 상보성을 기반으로 Cas9을 유도한다. 표적 세포의 DNA는 NHEJ (non-homologous end joining) 기전으로 indel (insertions or deletion)이 발생하여 유전자의 기능이 상실되며 (knockdown/knockout), 외래 donor DNA가 존재하면 HDR (homology directed recombination) 기전이 일어나 유전자의 기 능을 얻게 된다(knockin)(Sánchez-Rivera & Jacks, 2015). 표적 세포가 포유류 세포일 때 일반적으로 태아 섬유아세포(fetal fibroblast) 를 사용하며, 태아 섬유아세포에서 표적 유전자 편집 확 인과 접합자(zygote)와 체세포 핵 치환(somatic cell nuclear transfer), 대리모 착상 과정을 거쳐 표적 유전자가 편집된 동물을 생산한다. 표적 세포로 배아가 사용되었을 때는 목표 유전자 편 집 확인 후 바로 대리모에 착상시킨다(Zhou, 2015).

    5. CRISPR/Cas9 편집 기술을 이용한 PRRSV 저항성 돼지 육종

    돼지 생식기/호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PRRSV)는 전염성이 높은 RNA 바 이러스로서 양돈 산업에 미치는 상위 질병 중의 하나이며, porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV), swine acute diarrhea syndrome coronavirus (SADS-CoV)와 함께 Coronaviridae 과(family)에 속해 있다(Saif & Jung, 2020). 생식 장애(reproductive disorders)와 호흡 기능장 애(respiratory dysfunction)를 일으키는 이 바이러스는 대식세포 의 표면에 있는 3개의 수용체 즉 HS (heparin sulphate), Sn (sialoadhesin) 및 CD163과 결합하여 감염된다(Van Gorp et al., 2010). 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV)가 감염되면 구토와 심한 설사, 탈수 증상을 나타내며, 14일 미만의 자돈에서는 사망률 100%에 이른다. 이 바이러스는 소장 상피세포의 pAPN 단백질과 융합하여 감염된다(Burkard et al., 2017;Whitworth et al., 2019).

    Xu et al. (2020)은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 CD163과 pAPN 세포막 수용체 단백질 유전자 2개를 동시에 제거 (double-gene-knockout; DKO)하여 PRRSV와 TGEV에 저항성 있는 돼지를 만들었다(Fig. 3). CD163과 pAPN 유전자를 목표로 하는 sgRNA (single-guide RNA) delivery plasmids vector (pX330-CD163과 pX330-pAPN)를 만들어 Large White 돼지의 태아 섬유아세포(pig fetal fibroblasts)에 형질 주입(transfection) 시켰으며, 두 개의 유전자가 돌연변이 된 것을 확인하였다. 그리고 접합자와 체세포 핵치환, 대리모 착상 과정을 거쳐 두 개의 유전자가 돌연변이 된 돼지를 만들었으며, 1차 복제된 돼지의 섬유아세포를 이용하여 2차 복제 돼지를 만들었다. CD163 유전자는 8개의 염기 가 제거(deletion)되었으며, pAPN 유전자는 5개의 염기와 26개의 염기가 각각 제거되어 아미노산의 틀 이동 돌연변이가 발생하였다. 폐와 간, 비장 그리고 십이지장(duodenum)과 공장(jejunum), 회장 (ileum)에서 CD163과 pAPN의 단백질이 발현되지 않았다. 수용체 단백질 CD163와 pAPN 유전자 녹아웃 돼지는 PRRSV와 TGEV 에 완전한 저항성을 나타내었으며, 육류 생산과 생식 능력 특성은 일반 돼지(WT)와 차이가 없었다.

    6. 종간 배반포 보완 플랫폼 구축을 통한 인간-돼지 키메라 생성

    만능 줄기세포(pluripotent stem cells; PSC)를 이용한 키메라 생성은 무작위적이며 사용되는 숙주 배반포와 공여자 세포주에 따 라 다르다. 특정 장기에서 키메라를 선택적으로 풍부하게 생성하기 위해, 장기의 발달에 중요한 유전자를 비활성화시켜 숙주 배반포를 만드는 배반포 보완(blastocyst complementation) 전략이 개발되 었다(Chen et al., 1993). 종간 배반포 보완 플랫폼(interspecies blastocyst complementation platform) 구축은 이종 만능 줄기세 포 유도체(xenogenic pluripotent stem cell derivatives)가 장기 특이적으로 생산되는 것을 가능하게 한다(De Los Angeles et al., 2018). 또한 종간 배반포 보완을 통한 장기 생성은 전 세계 장기 기증자의 심각한 부족을 해결하는 데 도움이 될 수 있다. CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 숙주 동물(돼지)의 특정 장기(췌장, 신장, 심장 등) 발달을 무력화하면 인간 만능 줄기 세포(donor human PS cells)가 숙주와 경쟁을 최소화하면서 표적 장기를 만들 수 있게 할 수 있다(Fig. 4). 이러한 종간 배반포 보완 플랫폼 구축을 위해 첫째, 돼지 또는 양과 같은 동물의 숙주 배아를 대상으로 CRISPR/Cas9 편집 기술을 이용하여 표적 장기 형성을 비활성화시킨다. 둘째, 인간 이종 키메라 가능 만능 줄기세포 (human xenogenic chimera-competent pluripotent stem cells) 를 다음과 같이 만든다. 1) 체세포를 재프로그래밍 하여 인간 유도 만능 줄기세포(iPSCs)를 만들어, 2) 인간 iPSCs를 키메라 가능 상태(chimera-competent state)로 전환한다. 인간 이종 PSCs를 숙 주 동물 배아의 배반포에 주입(blastocyst injection) 하여 생성된 키메라를 가임신 대리모(pseudopregnant foster mother)에게 옮 긴다. 키메라 배아는 자궁에서 발달하여 인간-돼지 또는 인간-양 키메라가 된다. 인간-돼지 키메라는 돼지의 체내에서 면역 반응이 없는 인간의 장기를 만들어 환자에게 이식하는 것이 가능할 수 있다. 특히 숙주로서 돼지는 무균 관리를 통한 대량 생산이 가능하 고 장기의 크기가 인간과 가장 가까운 장점을 가지고 있다(Zhou et al., 2015).

    Wu et al. (2017)은 CRISPR-Cas9 매개 접합체 게놈 편집 (CRISPR-Cas9-mediated zygote genome editing)을 기반으로 다양한 배반포 보완 플랫폼을 구축하였다. 생쥐의 Pdx1 유전자는 췌장의 발달에 중요한 역할을 하며, Nkx2.5 유전자는 심장 발달에 중요한 역할을 하고, 그리고 Pax6 유전자는 전사 인자로서 눈과 코, 뇌의 성장에 중요한 역할을 한다. 생쥐 접합자에서 Pdx1 유전 자를 제거하면 췌장이 만들어지지 않아 출생 후 며칠 내에 죽게 된다. 생쥐 접합자의 Pdx1 유전자를 목표로 하는 Cas9/sgRNA와 쥐의 PSCs를 동시에 배반포에 주입하면 생쥐의 췌장은 발달이 무력화되지만, 쥐의 PSCs 보완으로 쥐-생쥐 키메라(rat-mouse chimera)가 만들어진다. 이렇게 만들어진 쥐-생쥐 키메라는 췌장 에서 α-amylase를 발현하여 혈중 포도당 농도를 정상으로 유지하 였다. 유전자 편집으로 장기 발달이 무력화된 생쥐(gene-edited organogenesis disabled mice)의 여러 조직에서 쥐 만능 줄기세포 유도체의 생성이 증가하였지만, 배반포 보완 플랫폼을 이용하지 않은 돼지에게서는 쥐-돼지 키메라가 생성되지 않았다. 배반포 보 완 플랫폼을 이용하지 않은 돼지와 소에서 착상 전 배반포(pre-implantation blastocysts)에 Naive hPSCs를 주입하면 강력하게 생 착(engraft)되었지만 착상 후 돼지 배아(post-implantation pig embryos)에 주입하면 제한적으로 생착되었다. 그러나 intermediate hPSC type은 착상 후 돼지 배아에서 높은 수준으로 키메 라가 생성되었으며, 분화된 자손을 생성하였다.

    Matsunari et al. (2020)은 돼지에서 체세포 복제와 배반포 보완 기술을 결합해 동종 간 췌장, 신장, 간 및 혈관 키메라를 만들었다. 접합자 유전자 편집으로 인하여 모자이크 돌연변이(mosaic mutations) 가 일어나는 것을 방지하기 위하여 돼지 섬유아세포 유전자 편집으로 특정 장기 발달을 억제시켰다(Vilarino et al., 2017). 이 렇게 만들어진 섬유아세포를 접합자에 체세포 핵치환(somatic cell nuclear transfer) 한 후 대리모에 이식하여 PDX1-KO 태아를 만 들었다. 체세포 복제된 태아로부터 분리한 섬유아세포를 1차 배양 (primary cultured fibroblasts) 하여 다시 핵치환 복제 과정을 거쳐 배반포 보완을 위한 숙주 배아로 사용하였다. 이처럼 체세포 복제 기술을 이용하여 췌장 형성, 신장 형성, 간 형성 및 혈관 형성을 포함하여 돼지의 장기 발생 억제에 대한 배반포 보완 개념 연구 (proof-of-concept)를 하였다. 이러한 결과는 유전자가 편집된 복 제 배아에 이종 만능 줄기세포를 보완하면 돼지의 생체 내 이종 장기 생성이 가능하다는 것을 시사한다. 돼지와 소 같은 유제류에 서 종간 배반포 보완 플랫폼 구축을 이용한 장기 키메라를 만들 수 있다는 것은 궁극적으로 장기 기증자의 전 세계적 부족 문제를 해결하기 위해 이식 가능한 인간 조직 및 장기를 이종 생성할 가능 성이 크다는 것을 시사한다.

    7. 유전자 편집 기술의 전망

    미생물학 연구 분야의 확장과 함께 기존의 유전자 편집 방법을 능가하는 단순성, 다양성 및 정확성을 가지는 CRISPR/Cas9이라 는 새로운 유전자 편집 기술이 탄생하여 동물 산업과 장기 이식 분야의 급속한 발전을 가져오고 있다. 돼지는 생물 의학 연구에서 중요한 농업 자원과 동물 모델 역할을 한다. 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)와 전염성 위장염 바이러스(TGEV)는 돼지 생산에 막대한 경제적 손실을 초래하는 감염성이 높고 치명적 인 바이러스이다. 이러한 바이러스 수용체 단백질 CD163 및 pAPN에 대한 이중 유전자 녹아웃(DKO) 돼지는 PRRSV와 TEGV에 동시에 내성이 있으며, 정상(WT) 돼지와 비교할 때 동일 한 성장과 생식 특성을 유지하면서 pocine delta coronavirus (PDCoV) 에 대한 감수성도 감소했다. 이러한 결과는 경제 동물에 CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술을 적용하여 두 가지 주요 바이러 스에 대한 동시 내성을 달성할 수 있다는 것을 보여주며, 질병 저항 성 돼지 생성을 위한 육종 시작점을 제공한다.

    종간 배반포 보완(interspecies blastocyst complementation)은 이종 만능 줄기세포 유도체(xenogenic pluripotent stem cell derivatives) 의 장기 특이적 생성을 가능하게 한다. CRISPR-Cas9 매개 접합자 유전자 편집(CRISPR-Cas9-mediated zygote gene editing)으로 췌장, 신장, 간 및 혈관 형성 불가능 생쥐 숙주와 배반포 보완 플랫폼을 구축을 결합하여 쥐-생쥐 키메라를 만들 수 있다. 또한 돼지, 소와 같은 유제류의 섬유아세포를 이용하여 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집과 접합자 체세포 핵 치환 과정을 거쳐 특정 장기 형성이 불가능한 복제 동물(태아)을 생산할 수 있 다. 이러한 복제 동물의 체세포 핵은 접합자 핵 치환으로 배반포 보완을 위한 숙주 접합자로 이용할 수 있다. 복제 기술의 사용은 유전자 모자이크 편집이 되지 않은 숙주 접합자를 대량 생산할 수 있는 장점이 있다.

    결론적으로, 이러한 결과는 최근 개발된 유전자 편집 기술을 사용하여 육류 생산, 사료 소화율 및 질병 저항성이 향상된 동물을 생산할 수 있고, 장기 기증자의 전 세계적 부족 문제를 해결하기 위해 이식 가능한 인간 조직 및 장기를 이종 생성할 가능성을 높여 준다.

    감사의 글

    이 논문은 2020~2021년도 경상국립대학교 대학 회계 연구비 지원에 의하여 연구되었음.

    Figures

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    Bacterial CRISPR-Cas9 systems behave as an adaptive immune response against invading bacteriophages (Ghorbani et al., 2021) (This article is published open access under a CC BY licence).

    Following infection (Phase 1), Cas1 and Cas2 mediate incorporation of short sequences of the viral genome as spacers within the bacterial CRISPR locus. At re-exposure (Phase 2), the CRISPR locus gets expressed as pre-crRNA, along with tracrRNA. The pre-crRNA is processed to yield guide RNAs (gRNAs) which bind the ribonucleoprotein Cas9 and target this complex to complementary sequences of the infiltrating bacteriophage genome, prompting its Cas9-mediated cleavage. Reprinted from‘CRISPR-Cas9 Adaptive Immune System of Streptococcus pyogenes Against Bacteriophages’, by BioRender.com (2021). Retrieved from https://app.biorender.com/biorendertemplates.

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    CRISPR/Cas9 mechanism of action (Chira et al., 2017) (This article is published open access under a CC BY licence).

    The original bacterial CRISPR/Cas9 design has been translated into an engineered instrument for genome editing purposes and is capable of introducing specific modifications in the target cell. In this regard, the vector comprising the crRNA and tracrRNA that together constitute the RNA molecule for Cas9 guidance (gRNA) is introduced in the desired cell, where it passes the cytoplasmic milieu toward the nucleus. After delivery to the nucleus, the Cas9 gene encoded by the experimental vector is transcribed and exported into the cytoplasm for translation of Cas9 nuclease. After synthesis of the active protein, the gRNA, transcribed by its own promoter, interacts with the Cas9 nuclease, resulting in the ribonucleic-protein effector complex that is internalized back into the nucleus. The cleavage of the double-stranded genomic DNA takes place in a guided manner, where the crRNA sequence of gRNA directs Cas9 toward the specific locus, based on sequence complementarity, which is positioned adjacent to the PAM. When cleaved, the continuity of the host DNA can be restored through NHEJ, where the hanging ends join together, creating small indels, or through HDR in the presence of a donor DNA.

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    Generation of CD163 and pAPN DKO pigs by CRISPR/Cas9 (Xu et al., 2020) (This article is published open access under a CC BY licence).

    (A) Schematic overview of the generation process for DKO cloned pigs. (B) Genetic maps of the CD163 (top) and pAPN (bottom) genes with the location and sequences of the sgRNAs. Exons, white boxes; sgRNA protospacer sequences, green; and PAM sequences, red. (C) Four F0 generation cloned pigs (1085#, 1143#, 1144#, 1145#) aged 1-month-old and a surrogate. (D) Sanger sequencing confirmation of DKO genotypes for three F0 cloned piglets (1143#, 1144#, 1145#). sgRNA protospacer sequences, green; PAM sequences, red; predicted amino acid sequences resulting from frameshift mutations, yellow.

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    Interspecies blastocyst complementation (De Los Angeles et al., 2018) (This article is published open access under a CC BY licence).

    Organ generation via interspecies blastocyst complementation could help to solve the severe shortage of organ donors worldwide. The genetic modification of host animals to disable organ development may enable donor human PS cells or progenitors to populate the targeted organ with minimal competition from the host. First, embryos of large animal hosts such as pigs or sheep are edited using CRISPR/Cas9 to disable formation of a target organ. Second, human xenogenic chimera-competent pluripotent stem cells are generated – first by: 1) reprogramming somatic cells to generate conventional human induced pluripotent stem cells (iPSCs) followed by 2) converting conventional human iPSCs to a chimera-competent state. Human xenogenic PS cells are then introduced into host animal embryos by blastocyst injection and the resulting chimeric embryo is transferred into a pseudopregnant foster mother. The chimeric embryo is allowed to develop in utero and if the method is successful, human-pig or human-sheep chimeras are born.

    Tables

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