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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.55 No.2 pp.1-7
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2020.55.2.1

Identification and Pathogenicity of Diaporthe spp. from Blueberry Leaf in Gangwon Province

Byung-Ju Cho1, Hyo-Won Choi2, Dae-Ho Kim1, Jong-Kyu Lee1*
1Tree Pathology and Mycology Laboratory, College of Forest and Environmental Sciences, Kangwon National University, Chuncheon, 24341, Republic of Korea
2Crop Protection Division, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Wanju, 55365, Republic of Korea
*Corresponding author: Jong-Kyu Lee Tel: +82-32-250-8364 Fax: +82-32-259-5617 Email: jongklee@kangwon.ac.kr
March 9, 2021 ; March 23, 2021 ; March 25, 2021

Abstract


The genus Diaporthe is one of the important fungal pathogens in the world. 5 isolates were obtained from blueberry leaves in Chuncheon and Gosung during a survey on blueberry disease. From the results identification using morphology and molecular characteristics, they were identified as Diaportheamygdali, D. eres, D. nobilis, D. phaseolorum and Diaporthe sp. Diaportheamygdali, D. nobilis and D. phaseolorum developed lesion of 5~10mm in diameter when inoculated onto leaves with wounds. And D. eres and Diaporthe sp. developed over than 10mm and less than 5mm lesion, repectively. But didn’t develop onto leaves without wounds and fruit with/without wounds. Fungal growth at various temperatures showed that D. eres, D. nobilis, D. phaseolorum, and Diaporthe sp. had the highest growth rates at 25℃, while D. amygdali grew better at 30℃. All strains showed 80% or higher inhibited growth in all concentrations of oxine-copper, benomyl, fluzinam, and prochloraz manganese complex. They also showed 80% or higher inhibited growth in 250 and 500 ppm of captan, 250 and 500 ppm of mancozeb, and 500ppm of dithianon.



강원도지역 블루베리 잎에서 분리한 Diaporthe spp.의 동정과 병원성 검정

조병주1, 최효원2, 김대호1, 이종규1*
1강원대학교 산림환경보호학과
2국립농업과학원

초록


Diaporthe속은 전세계적으로 중요한 곰팡이 병원균 중 하나이다. 블루베리에 발생하는 병에 관한연구 결과 강원도 춘천시와 고성시의 블루베리 농가에서 5균주의 Diaporthe속을 분리하였다. 이들의 형태적 특징과 분자생물학적 특징을 조사한결과 Diaportheamygdali, D. eres, D. nobilis, D. phaseolorum, Diaporthe sp.로 동정되었다. 병원성 검정결과 Diaportheamygdali, D. nobilis, D. phaseolorum 은 상처를 낸 잎에서 5~10mm의 병반을 형성하였다. Diaporthe eres는 상처낸 잎에서 10mm 이상의 병반을 형성하였고 Diaporthe sp.는 상처를 낸 잎에서 5mm 이하의 병반을 형성하였다. 하지만 상처를 내지 않은 잎과 과실에서는 병반을 확인할 수 없었다. 온도 생장특성은 D. eres, D. nobilis, D. phaseolorum, Diaporthe sp.는 25℃에서 D. amygdali는 30℃에서 가장 높은 생장을 보였다. 모든 분리균들은 oxine-copper, benomyl, fluzinam, prochloraz manganese complex에서 80%이상 의 생장저해율을 보였고 captan과 mancozeb는 250ppm, 500ppm에서 dithianon는 500ppm에서 80%이상의 생장저해율을 보였다.



    서론

    블루베리는 진달래과 산앵두나무속에 속하는 관목성 식물로 북 아메리카가 원산지로 알려져 있다 (Martín-Gómez et al., 2020). 전세계적으로 약 400여종이 있으며 국내에서는 highbush blueberry (Vaccinium corymbosum)가 주로 재배되고 있다. 전 세계적 으로 재배면적이 증가하고 있고 국내에서도 급격히 증가하여 과수 산업에서 중요한 과종이 되었다 (Cheon et al., 2020). 또한 블루베 리에 함유되어 있는 phenolic acids, tannins, stilbenes, lignans, flavonoids 등 다양한 페놀 화합물들은 항산화 작용, 항균활성, 콜 레스테롤 감소, 항암예방 등에 도움이 된다고 알려져 있다 (Jeong et al., 2020).

    블루베리에 발생하는 병원균에 의한 피해로는 Diaporthe, Botryosphaeria, Phytophthora, Armillaria, Colletotrichum, Alternaria, Microsphaera 등에 의한 미이라병, 가지마름, 궤양병, 잎점무늬병, 과실썩음병, 탄저병, 잎녹병, 흰가루병 등이 보고되어 있다(Caruso & Ramsdell, 1995;Polashock et al., 2017). Diaporthe (Phomopsis)는 주요 진균병 중 하나로 가지마름병, 잎 점무늬병, 과실썩음병, 궤양병 등을 일으키는 병원균으로 전세계적 으로 분포하면 기주범위가 넓은 병원균이다(Gao et al., 2017). 블루베리에서는 Diaporthe vaccinii에 의한 궤양병이 주요 병원균 으로 알려져 있고 그 밖에 Diaporthe s p p.에 의한 가지마름병, 줄기 궤양병, 과실썩음병에 의해 경제적인 피해를 입고 있다(Elfar et al., 2013). 국내의 경우 Diaporthe vaccinii에 의한 피해만 보고 되어 있다(NIHSS, 2011).

    국내에서 블루베리의 재배가 증가하고 있음에도 불구하고 국내 블루베리에서 발생하는 병에 대한 조사는 미미한 실정이기 때문에 국내 블루베리에 발생하는 병을 조사하였다. 블루베리의 병든 잎에 서 분리된 병원균을 동정 결과 다양한 Diaporthe 속이 분리되어 본 논문에서 분리된 Diaporthe속 분리균들의 형태적특성과 분자생 물학적특성, 생육특성 및 블루베리의 잎과 과실에서의 병원성 확인 결과를 소개하고자 한다. 또한 병방제에 도움이 되고자 기존에 사용 중인 항진균제를 이용한 병원균의 생육억제 결과를 기술하였다.

    재료 및 방법

    1. 시료채집과 병원균 분리

    블루베리의 병원균을 연구하기 위해 2017년 6월과 8월에 춘천의 블루베리 농장 2곳(37°57'59.9"N 127°44'09.6"E, 37°56'46.0"N 127°41'56.9"E)과 고성의 블루베리 농장 2곳(38°22'56.5"N 128°27'05.6"E, 38°27'19.7"N 128°27'05.9"E) (Table 1)에서 각각 56개와 61개의 잎에서 갈색, 황색, 적색 등으로 변색된 병반을 확인 하고 이를 채집하였다. 채집한 시료는 약 3.0×5.0mm의 크기로 잘라 서 1% NaOCl에서 60초간 표면살균하여 WA (water agar)배지 치상 후 25℃에서 3일간 암배양하였다. 배양 후 생장한 균사는 PDA (potato dextrose agar) 배지에 계대배양하였고 충분히 생장한 분리 균들은 4℃에 보관하며 실험에 사용하였다.

    2. 분리균의 형태적 특징과 분자생물학적 특징

    분리균들의 생장특성을 알아보기 위해 PDA에 계대배양하여 10-35℃ 범위에서 6개의 다른 온도 조건으로 5일간 암배양 하고 균사의 생장량을 측정하였다. 형태적 특징을 확인하기 위해 PDA 배지에서 25℃, 7일간 배양한 균주를 사용하였다. 분자생물학적 특징을 확인하기 위해 Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega)를 사용하여 DNA를 추출하였고 Gomes et al. (2013) 의 실험방법에 따라 rDNA-ITS (internal transcribed spacer), CAL (calmodulin), HIS (histone H3), TEF1 (translation elon- gation factor 1-alpha), TUB (beta-tubulin) 영역을 증폭하였다. 증폭된 DNA는 BIONICS Co. (http://www.bionicsro.co.kr)에 의뢰하여 염기서열을 해독하였다.

    3. 병원성 검정

    분리균의 병원성을 검정하기 위해 건강한 블루베리(duke)의 잎 과 과실을 사용하였다. 블루베리의 잎과 과실은 상처가 있는 그룹 과 상처가 없는 그룹으로 구분하여 분리균을 접종하였다. 분리균을 PDA에 접종하여 25℃에서 14일간 광/암 교차 배양하여 포자를 수확하였고 1×106/ml 농도로 희석하여 각각의 블루베리 시료에 접종하였다. 접종된 블루베리 시료는 25℃에서 5일간 암배양한 뒤 잎에 형성된 병반의 크기를 측정하여 병원성을 확인하였다.

    4. 약제에 대한 균사 생장 검정

    국내 블루베리에 사용하는 7개의 주요 항진균제(Captan, Mancozeb, Dithianon, Oxine-copper, Benomyl, Prochloraz managanese complex, Fluzinam)를 선발하여 약제 검정에 사용하 였다. 사전 실험을 통해 각각의 약제에 적당한 농도를 다음과 같이 선정하였다. Captan, mancozeb, dithianon - 15.6, 31.6, 62.5, 125, 250, and 500μg/mL; benomyl, prochloraz manganese complex, fluzinam - 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, and 100μg/mL; oxine- copper - 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125, and 250μg/mL. 선정된 농도의 약제를 멸균된 PDA 배지에 도말하고 분리균을 접종한 뒤 25℃에서 5일간 암배양 후 균사 생장량을 측정하였다.

    결과 및 고찰

    1. 병원균 분리와 동정

    블루베리에서 분리된 병원균 61균주 중 5균주가 Diaporthe로 동정되었다. 분리 지역은 춘천에서 4균주, 고성에서 1균주가 분리 되었다. 병원균 분리를 위해 6월과 8월에 시료를 채집하였는데 Diaporthe 균주들은 모두 8월에 분리가 되었다. 이는 춘천의 6월 평균기온은 18~29℃이고 습도는 4~41%이고 고성의 6월 평균기 온은 15~25℃이고 습도 6월 4~52%인 것으로 보아 온도는 생장에 적당하나 습도가 낮아 병발생에 비교적 불리한 조건이기 때문인 것으로 생각된다. 반면, 7,8월의 평균온도는 춘천이 21~30℃, 고성 이 20~28℃이고 습도는 춘천이 43~83%, 고성이 54~92%여서 8 월에 주로 분리된 것으로 생각된다. 또한 블루베리 잎의 시료만 분리한 이유는 병이 발생하는 시기 이전에 수확을 하기 때문에 과실 시료는 채집을 할 수 없었다.

    분리균의 분자생물학적 위치를 확인하기 위해 rDNA-ITS, CAL, HIS, TEF1, TUB등 5개의 영역을 분석한 결과를 Gomes et al. (2013)의 결과와 비교하였다(Fig. 1). 그 결과 다양한 Diaporthe 종들 중 CH025 균주는 D. amygdali CBS 126679와 가장 높은 상동성을 보이며 하나의 그룹을 형성하였다(Fig. 1). 그 리고 CH027, CH081, CH105 균주는 각각 D. eres CBS 101742, D. phaseolorum CBS 113425, D. nobilis CBS 113470과 하나의 그룹을 형성하였다. 하지만 GO055 균주의 경우 Diaporthe s p . CBS 458.78 균주와 같은 그룹을 형성하긴 하였지만 비교적 낮은 상동성을 보였다.

    형태적 특징은 조사결과 CH052균주는 타원형이며 4.88~6.99× 1.56~2.45um의 분생포자를 형성하였고, CH027, GO055균주는 원 통형 분생포자를 형성하였고 크기는 각각 4.79~7.08×1.62~2.66um, 5.61~7.72×1.96~2.83um였다. CH105균주는 분생포자를 형성하 지 않았고, CH081균주는 타원형~원통형, 5.35~9.79×1.56~2.69um 의 분생포자를 형성하였다(Table 1).

    분리균의 형태적 특징과 분자생물학적 특징을 조사한 결과 5균 주는 각각 D. amygdali, D. eres, D. nobilis, D. phaseolorum, Diaporthe s p .로 동정되었다. 고성에서 분리된 1균주(Diaporthe sp.)를 제외한 모든 균주는 춘천에서 분리되었다. 또한 D. amygdali, D. eres, D. nobilis 종들은 기존에 국내 블루베리에서는 보고되 지 않은 종이었다. 기존에 보고된 블루베리의 주요 Diaporthe 종은 줄기 궤양병을 일으키는 Diaporthe vaccinii로 알려져 있지만 본 연구에서는 분리되지 않았다. 하지만 D. eres등 다양한 다른 Diaporthe 종들도 블루베리의 가지마름, 줄기궤양, 과실썩음을 유 발하는 것으로 보고되었다. 그리고 D. nobilis는 수확 후 과실썩음 병을 유발하는 것으로 보고되었다(Gajanayake et al., 2020). D. phaseolorum 는 블루베리에서 발생한 줄기 궤양에서 분리되었다 (Dil et al., 2013). Diaporthe amygdali는 블루베리에서의 분리는 보고되지 않았지만 배, 복숭아, 호두, 아몬드에서 가지궤양병이나 마름병을 일으키는 것으로 보고 되어있다(León et al., 2020). 비록 본 실험에서는 블루베리 잎에서만 분리가 되었지만 충분히 다른 부위로 전위 될 수 있기 때문에 분리한 Diaporthe 종들은 모두 블루베리 농가에 피해를 입힐 수 있을 것으로 생각된다.

    2. 병원균 생장온도

    다양한 온도에서의 생장량 조사 결과 D. eres, D. nobilis, D. phaseolorum, Diaporthe s p . 균주들은 25℃에서 가장 높은 생장을 보였고 D. amygdali는 30℃에서 가장 높은 생장을 보였다. 생장 적정 온도는 D. amygdali, D. nobilis, Diaporthe s p .는 20-30℃에 서 D. eres, D. phaseolorum는 20-25℃로 조사되었다(Table 1).

    3. 병원성 검정

    블루베리에서 분리한 병원균의 병원성 검정결과 상처를 낸 잎에 서만 병이 발생되고 상처가 없는 잎과 과육에서는 병발생이 확인되 지 않았다. 분리된 Diaporthe 균주들 중 D. eres에 의해 잎에 형성 된 병반이 11.5mm로 가장 큰 것으로 측정되었고 Diaporthe s p . 균주에 의해 형성된 병반은 4.8mm로 가장 작은 것으로 측정되었 다. 그리고 D. amygdali, D. nobilis, D. phaseolorum에 의한 병반 은 각각 9.7mm, 6.7mm, 7.7mm로 측정되었다(Table 2).

    4. 균사생장 억제

    블루베리의 병방제에 주로 사용되는 7개의 항진균제들의 균사 생자억제율 조사결과(Fig. 2) Captan의 경우 250ppm 이상에서 모든 분리균들에 대해 90%이상의 억제율을 보였고 Diaporthe s p . 의 경우 125ppm에서도 90% 이상의 생장 억제율을 보였다. Mancozeb의 경우 250ppm 이상에서 모든 분리균들에 대해 90% 이상의 억제율을 보였고 D. eresDiaporthe s p .는 62.5ppm이상 에서 90% 이상의 억제율을 보였으며 D. nobilis를 제외한 모든 균주들은 125ppm에서도 90% 이상의 억제율을 보였다. 또한 250ppm에서는 D. amygdali, D. nobilis, Diaporthe s p .의 생장을 100% 억제하였고 500ppm에서는 D. phaseolorum 균주가 99.9% 의 생장억제율을 보인 것을 제외하고는 모든 균주에 대해 100%의 생장억제율을 보였다. Dithianon의 경우 500ppm에서만 모든 분 리균들에 대해 90%이상의 억제율을 보였다. Oxine-copper에서는 모든 농도에서 90%이상의 억제율을 보였고 D. amygdali는 모든 농도에서 D. nobilis는 15.6ppm 이상의 농도에서 D. phaseolorum는 62.5ppm이상의 농도에서 Diaporthe s p .는 250ppm농도에 서 각각 100%의 억제율을 보였다. Prochloraz managanese complex는 D. amygdali균주가 3.1ppm에서 89.7%의 억제율을 보인 것을 제외하고 모든 농도에서 90% 이상의 억제율을 보였고 100ppm에서는 모든 균주들의 생장을 100% 억제하였다. 또한 6.3ppm이상의 농도에서는 D. eres의 생장을 100%억제하였고 12.5ppm이상에서는 D. phaseolorum를 25.0 ppm이상의 농도에 서는 D. nobilisDiaporthe s p .의 생장을 100% 억제하였다. Benomyl의 경우 모든 균주들이 실험에 사용된 모든 농도에서 100%의 생장억제율을 보였다. Fluzinam는 모든 농도에서 D. amygdali의 생장을 97.4% 이상 억제하였고 그 밖의 균주들에 대 해 100%의 억제율을 보였다. 비록 본 연구에서 분리된 Diaporthe 속 5균주들은 대부분 국내 블루베리에서 처음 보고되는 종들이지 만 기존에 주로 사용되는 항진균제 7종에 대한 생장 억제결과 모든 항진균제에서 억제효과를 확인하여 방제에 활용할 수 있을 것으로 판단된다.

    Figures

    JALS-55-2-1_F1.gif

    Phylogenetic tree of members of Diaporthe spp. based on the combined five loci rDNA-ITS, CAL, HIS, TEF1 and TUB. Combined data for the isolates were compared with those of other species of the Diaporthe from Gomes et al. (2013). The combined data were analyzed using Tamura-Nei parameter distance calculation model, and then used to construct the Neighbor-Joining (NJ) tree with MEGA ver. 7.0. Bootstrap analysis was performed with 1,000 replications.

    JALS-55-2-1_F2.gif

    Growth inhibition by seven anti-fungal agents typically used to control anthracnose on blueberry plants in Korea.

    Tables

    List of fungal isolates and their characteristics and isolation locations

    Pathogenicity assay on leaves and fruit with/without wounds

    References

    1. Caruso FL and Ramsdell DC. 1995. Compendium of blueberry and cranberry diseases. The American Phytopathology Society, St. Paul, MN. pp.9-134.
    2. Cheon MG , Lee YS , Kim YB , Prathibhani CKHM and Kim JG. 2020. Bush growth and fruit quality of ‘Duke’ blueberry influenced by nutrition supply periods in unheated plastic house. J. of Bio-Environment Control 29(4): 421-427.
    3. Dil T , Karakaya A and Oğuz AÇ. 2013. Blueberry fungal diseases in Rize, Turkey. In Proceedings of the 24th International Scientific-Expert-Conference of Agriculture and Food Industry. pp.409-413. Sarajevo, Bosnia and Herzegovina.
    4. Elfar K , Torres R , Diaz GA and Latorre BA 2013. Characterization of Diaporthe australafricana and Diaporthe spp. associated with stem canker of blueberry in Chile. Plant Disease 97(8): 1042-1050.
    5. Gajanayake AJ , Abeywickrama PD , Jayawardena RS , Camporesi E and Bundhun D. 2020. Pathogenic Diaporthe from Italy and the first report of D. foeniculina associated with Chenopodium sp. Plant Pathology & Quarantine 10(1): 172-197.
    6. Gao Y , Liu F , Duan W , Crous PW and Cai L. 2017. Diaporthe is paraphyletic. IMA Fungus 8(1): 153-187.
    7. Gomes RR , Glienke C , Videira SIR , Lombard L , Groenewald JZ and Crous PW. 2013. Diaporthe: A genus of endophytic, saprobic and plant pathogenic fungi. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fung. 31: 1.
    8. Jeong DY , Yang HJ , Jeong HJ , Shin DY , Lee HY and Park YM. 2020. Immunoregulatory activities of blueberry yeast fermented powder in immunosuppressed model. J. of the Korean Society of Food Science and Nutrition 49(5): 433-443.
    9. León M , Berbegal M , Rodríguez-Reina JM , Elena G , Abad-Campos P , Ramón-Albalat A , Olmo D , Vicent A , Luque J , Miarnau X , Agustí-Brisach C , Trapero A , Capote N , Arroyo FT , Avilés M , Gramaje D , Andrés-Sodupe M and Armengol J. 2020. Identification and characterization of Diaporthe spp. associated with twig cankers and shoot blight of almonds in Spain. Agronomy 10(8): 1062.
    10. Martín-Gómez J , Varo MÁ , Mérida J and Serratosa MP. 2020. Influence of drying processes on anthocyanin profiles, total phenolic compounds and antioxidant activities of blueberry (Vaccinium corymbosum). LWT 120: 108931.
    11. National Institute of Horticultural and Herbal Science.2011. Manual to organic cultivation of blueberry. p.45.
    12. Polashock JJ , Caruso FL , Averill AL , Schilder A and Press APS. 2017. Compendium of blueberry, cranberry, and lingonberry diseases and pests. APS Press, American Phytopathological Society.
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