서론

인간에서 포유동물의 primary cells의 대량 생산은 성공적인 세포 치료와 조직 공학적 측면에서 매우 중요하다. 많은 세포들 중 자가 위성세포(Satellite cell)와 근원세포(Myoblast)를 포함하 는 근육세포(Muscle derived cells)들은 사람의 허혈성 심근 손상 (Ischemia-damaged myocardium), 요실금(Urinary incontinence), 근이영양증(Muscular dystrophy) 등의 치료를 위해 이용되고 있 다(Pagani et al., 2003;Smaldone & Chancellor, 2008;Tedesco et al., 2010). 재생의학적 관점에서 앞서 언급된 질환들의 세포 교체 치료를 위해서는 다량의 세포 투여가 필수적이고, 따라서 많은 수 의 세포를 확보하는 것이 치료의 성공을 결정하는 주요한 요인이 다. 한편, 또 다른 관점에서 생명공학기술을 바탕으로 근육세포들 을 대량 배양 연구를 통해 동물복지 및 증가하는 고기 소비 및 가죽의 수요를 해결하려는 시도들이 진행되고 있다. 일반적으로 소 근원세포의 배양을 위해서는 소 태아 혈청(Fetal bovine serum; FBS) 또는 말 혈청(Horse serum) 등이 이용된다(Saini et al., 2018;Kolkmann et al., 2020). 그러나 동물에서 생산된 혈청은 지속가능 성과 재생성이 없고 공급량이 제한적일 뿐만 아니라 근육세포를 대량 배양하는 목적과도 상충한다.

혈청의 종류 중 가장 많은 비중을 차지하는 FBS의 경우 태아기 의 소로부터 얻어지며, 혈청 속에는 단백질, 전해질, 지방, 탄수화 물, 부착 인자, 호르몬, 효소 및 억제 인자 등 약 1,000개 이상의 성분을 포함하는 것으로 알려져 있다(Saini et al., 2018;Lawson & Purslow, 2000). 그러나 여전히 혈청 속에는 미확인 된 성분들 이 존재하며, 혈청의 배치 변화에 따라 혈청이 상이한 효능을 가질 수 있다는 문제점(Bjare, 1992)이 제기되었다. 게다가 최근 혈청의 급격한 가격상승은 상업적인 생산을 위한 대량 세포배양에 있어서 큰 제한사항으로 작용하고 있다. 세포배양에서 혈청의 사용은 잠재적 으로 다양한 교란 변수를 도입할 수 있다. 따라서 혈청을 포함하지 않는 세포 배양액(Serum free media)으로의 전환하거나 적어도 배양 액에서 FBS의 감소는 생명공학기술을 이용한 배양 고기(Cultured meat)의 생산이나 다른 목적의 세포의 대량 생산을 위해서는 해결해 야 필수적인 요소이다. 최근에는 이상의 문제점들을 개선하기 위해 Serum-free 또는, serum-replacements가 첨가된 배양액의 개발을 위 한 연구가 진행되고 있지만(Lindroos et al., 2009;Laitinen et al., 2016), 근육세포 배양에서 그 효과는 명확히 규명되지 않았다.

따라서, 본 연구에서는 경제성과 안정성을 고려한 세포배양기술 의 개발을 위해 혈청의 첨가 농도가 근육세포의 성장 및 세포사에 미치는 영향을 조사하였다.

재료 및 방법

1. 시약 및 배양액

실험에 사용된 성장배양배지(growth medium, GM)는 Skeletal Muscle Cell Basal Medium (PromoCell GmbH, Heidelberg Germany)에 Skeletal Muscle Cell Growth Medium Supplement Mix (50 ㎍/㎖ Fetuin, 10 ng/㎖ Epidermal Growth Factor, 1 ng/ ㎖ basic Fibroblast Growth Factor, 10 ㎍/㎖의 Insulin, 0.4 ㎍/㎖ Dexamethasone; PromoCell GmbH)를 혼합하여 사용하였으며 FBS (Heat inactivated fetal bovine serum, 10082-147, Lot 2075281, Invitrogen‐Gibco, USA)는 농도를 각각 5%, 10%, 20% 로 조절하여 실험에 사용되었다. 분화배양배지(Differentiation medium, DM)는 Skeletal Muscle Cell Differentiation Medium (PromoCell GmbH)에 Skeletal Muscle Cell Differentiation Medium Supplement Mix (10 ㎍/㎖ Insulin; PromoCell GmbH)를 혼합하 여 사용하였다.

2. 공시 재료

본 연구는 생후 5 주령의 수컷 마우스(SLC:ICR, Japan SLC Inc., Hamamatsu, Japan)를 사용하였다. 시료 채취 절차와 실험 과정은 국립축산과학원 동물실험윤리위원회에 의해 검토 및 승인 된 내용에 준하여 실시되었다(승인번호: NIAS20191555).

3. 근육세포의 분리 및 배양

근육 줄기세포의 분리 및 배양은 Wu et al. (2010)과 Pavyde et al. (2016)의 방법에 준하여 수행하였다. 근육세포는 마우스의 하 지골격근을 외과적으로 분리하고, Antibiotic-Antimycotic (100x, 15240-062, Invitrogen‐Gibco, USA)가 첨가된 PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline without Mg²⁺/Ca²⁺, 14190-144, Invitrogen- Gibco, USA)로 3회 수세 후 세절 하였다. 회수된 조직에 0.25% collagenase typeⅠ (STEMCELL technology, Vancouver, BC, Canada)을 첨가하고 37℃의 인큐베이터에서 1시간 동안 처리하였 다. 연화된 조직은 18 gage 주사기 바늘이 부착된 10 ㎖의 일회용 멸균 주사기를 이용하여 흡입과 방출을 반복하였다. 세포 현탁액은 100 ㎛와 40 ㎛의 cell strainers (Nylon mesh, 352360, 352340, BD Falcon, USA)를 이용하여 조직 절편을 제거하였다. 회수된 세포 현탁액은 500 x g force에서 10분간 원심분리하여 세포 pellet을 회수하고 1× Penicillin/Streptomycin (15070-063, Invitrogen‐ Gibco, USA)과 10% FBS가 첨가된 PBS로 2회 수세하고, 마지막 으로 GM으로 수세하였다. 근육세포 분리는 세포의 부착 속도와 성장 속도의 차이를 이용한 pre-plate methods에 의해 분리되었다. 세포는 collagen으로 코팅된 T-25 Flask (25 cm², 354484, Corning, USA)에 seeding (Pre-plate-0, pp0) 후 2시간 동안 배양되었다(Pre-plate-1, pp1). Fibroblast는 2시간 이내에 빠르게 부착하는 것으로 알려져 있다. 비 부착된 세포 현탁액은 원심분리 후 세포의 pellet만 회수하 여 collagen이 코팅된 T-25 flask에 18시간 동안 배양하였다(Preplate- 2, pp2). 비 부착된 세포 현탁액들은 다시 회수 후 세포의 pellet 만을 24시간 동안 배양하였다(pp3). 이 과정은 pp6까지 반복하였다. pp1부터 pp6단계까지의 모든 세포는 GM과 함께 배양되었다,

계대배양은 세포의 분화를 방지하기 위하여 60-70% confluence 에 도달하였을 때 수행하였다. 혈청의 농도가 근육세포의 성장에 미치는 효과를 검증하기 위해 3 passage의 세포들은 각기 다른 혈 청 농도(5, 10 및 20%)가 첨가된 세포 성장 배양액을 이용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2주간 배양되었다. 배양액들은 3일 간격으로 신선한 GM으로 교체되었다.

4. 세포의 성장 곡선 확인

혈청 농도에 따른 근육세포의 증식 능력을 확인하기 위하여 24 well plate에 1×10³ cells/well로 seeding 하였다. 배양액은 GM에 5, 10 및 20%의 혈청들이 각각 첨가된 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2주간 배양되었다. 각기 다른 혈청 농도 가 첨가된 세포들은 2일 간격으로 0.25% Trypsin-EDTA solution (25200-056, Invitrogen‐Gibco, NY, USA)을 사용하여 세포들을 회수하였다. 회수된 세포들은 2번의 세포 수세 과정을 거치고 혈구 계산기를 가지고 도립현미경(CKX53, Olympus, Shanghai, China) 을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 이 실험은 한 well 당 3번의 technical replicate로 평균값을 산정하고, 5 반복의 biological replicate를 수행하여 최저 값과 최고 값을 제외하고 통계처리를 수행하였다.

5. 면역 형광 염색

마우스의 골격근에서 유래된 세포의 생리학적 특성 규명을 위하 여 면역 형광 염색을 수행하였다. 분리된 세포들은 cover glass 위 에서 배양되었고 약 60% confluence 상태에서 10% Formalin solution (HT5011, Sigma-Aldrich, USA)으로 고정되었다. 3% Bovine serum albumin (BSA; A6003, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 PBS로 두 번 수세를 진행 후 PBS에 0.1% triton X100과 1% BSA가 들어 있는 배지로 15분간 처리하였다. 샘플들은 특정 단백질에 반응하도록 Monoclonal Anti-Myosin antibody (1:400, M4276, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 을 처리하고, 4℃에서 over night 하였다. 이차 항체로는 Goat anti- mouse IgM Alexa Fluor 488(1:400, A21042, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 암실에서 1시간 동안 반응하였다. 대조 염색으로는 1 ㎍/㎖ DAPI로 핵을 30분간 염색하였다. 염색이 완료 된 각 샘플들은 2번의 수세 과정을 거쳐 슬라이드 글라스 위에 Vectashield antifade mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)을 가지고 봉입 되었다. 각 샘플들은 공초점 레이저주사현미경(Leica TCS SP8 confocal microscope, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.

6. 근육세포의 체외 분화

5% 혈청이 함유된 GM을 사용하여 배양된 세포들은 각기 다른 혈청이 첨가된 GM에서 증식을 위하여 배양되었다. 배양된 세포들 은 회수되었고, 35 ㎜ dish 위에 1× 10⁶ cells/well로 seeding 하였 다. 24시간 경과 후 세포의 부착을 확인하고 동일한 DM으로 2주 간 분화를 유도하였다. 분화 배양액은 3일마다 교체되었고 mRNA 분석을 위하여 세포들은 일주일 간격으로 회수되었다.

7. Real time PCR을 이용한 유전자량 발현 분석

세포는 RNeasy mini kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용 하여 total RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 500 ng과 Omniscript Reverse Transcriptase (QIAGEN, Hilden, Germany), 10× RT buffer, dNTP mix, RNase inhibitor, oligo dT를 이용하여 37℃ 에서 60분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR은 StepOnePlus Real-Time PCR System (Agilent Technology, Santa Clara, USA)을 이용하여 SYBR Green master mix (Applied Biosystems, CA, USA)을 사용하여 수행하였으며, Specific gene 분석을 위해 사용된 primer sequence는 Table 1에 나타내었다. Housekeeping gene을 선별하기 위해 알려진 Gapdh, Hprt, Tbp 의 Ct (Cycle threshold) 값을 확인하고 가장 안정적인 발현량을 보인 유전자를 선별하여 다음 실험에 사용하였다. 유전자 발현의 상대적 정량은 ΔΔCt법을 이용하여 계산되었고, 실험 결과 값은 relative quantification (RQ)로 나타내었다.

8. 통계분석

본 연구에서 수행된 mRNA 발현 분석은 3회 반복하였으며 통 계프로그램은 Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, IBM)을 이용하여 One-way ANOVA에 의해 사후검증 후 다중비교 (Tukey's HSD)에 의해 평균 간 차이를 p<0.05의 수준에서 유의성 을 분석하였다. Fig. 2A와 Fig. 3A의 결과 값은 Mean±standard error of the mean (SEM)로 표시하였다.

결과 및 고찰

1. 세포들의 형태학적 특징 분석

Pre-plating 법에 의해 분리 및 배양된 세포들의 형태를 도립 현미경 아래에서 관찰하였다(Fig. 1). pp0 단계의 부착된 세포는 single cells, 골격근 미세 조직, myotubes가 혼재된 모습이 관찰되 었으며, pp1 단계의 부착된 세포들은 형태학적으로 크고 납작한 형태의 fibroblast like cells과 일부 긴 튜브 형태의 myocyte와 myoblast like cells이 확인되었다(Wu et al., 2010)(Fig. 1A). 한 편, pp4 단계에서는 작고 둥근 형태의 굴절성을 가진 myoblast와 satellite like cell이 다수 관찰되었다. pp6에 도달한 세포들은 선행 보고들과 유사하게 myoblast/satellite like cell의 빈도가 증가하였 지만, 여전히 myocyte로 추정되는 세포들이 다수 관찰되었다(Fig. 1B). Myosin heavy chains (MyHC)의 면역 염색은 pp2단계의 세포와 비교하여 pp4 단계에서 MyHC 양성 세포가 증가하는 것을 보여주었다(Fig. 1C)(Wu et al., 2010;Lavasani et al., 2013).

이상의 결과를 바탕으로 같은 개체의 ear fibroblast를 negative control로 실험의 pp1을 fibroblast like cells로, pp4이상의 세포를 Myoblast derived cells로 명명하였다. 그리고, 충분한 양의 세포 를 회수하기 위해 3차례 계대배양된 세포를 사용하여 후속 실험을 실시하였다.

2. 정량 PCR에 의한 reference genes의 검증

Actb, Gapdh 또는 18S rRNA는 세포와 조직에서 광범위하게 사용되는 Housekeeping으로 알려져 있으며, 배양 조건, 세포의 상태(증식, 분화)에 따라 상이한 발현양상을 보여준다(Hildyard & Wells, 2014;Hildyard et al., 2018). 따라서 우리는 적절한 internal reference gene을 선별하기 위해 Gapdh, Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (Hprt1) 및 TATA box binding protein (Tbp)의 Ct값을 모두 분석하였고, 일정한 발현량을 나타낸 Tbp를 internal reference gene으로 선발하여 real time PCR 분석 에 사용하였다(Fig. 2A).

3. Myogenesis 관련 유전자의 발현

세포의 부착 속도 차이를 이용하여 분리된 2가지 세포 타입에서 Myogenesis 관련 유전자의 정량 RNA을 실시하였다(Fig. 2B). Satellite cell의 전사 인자인 Pax3/Pax7 및 skeletal muscle lineage의 myogenic regulatory factors인 Myod/Myf5/Myog/Myf6의 발현량을 분석하였다(Bentzinger et al., 2012). Pax3/Pax7/Myf5/Myod1 (Fig. 2 Ba-d)의 발현량이 ear fibroblast와 비교하여 Myoblast derived cells에서 모두 3.5 배 이상 증가(p<0.05) 하였고, 특히 Myf5 (13.97 배)에서 높은 발현이 확인되었다. Pax7의 발현량이 fibroblast like cells과 Myoblast derived cells이 ear fibroblast보다 4배 이상 높게 나타난 반면, Myoblast derived cells은 fibroblast like cells보다 발현량이 적게 나타났다(p<0.05). 이러한 결과는 Myoblast derived cells은 충분한 수의 세포를 얻기 위해 계대 배양 3의 것을 사용함으로써 세포의 증식과 더불어 Pax7의 발현량이 감소하고, 동시에 pp1의 fibroblast like cells에 잔존 된 작은 골격근 조직들 속의 근위성세포 혹은 근 줄기세포들의 영향으로 추정되며 이러한 결 과는 선행 연구 결과들에 의해 지지된다(Ding et al., 2018). Myocyte 의 분화 조절 유전인(Bentzinger et al., 2012) Myog (Fig. 2Be)와 Myf6 (Fig. 2Bf)의 발현량이 ear fibroblast와 비교하여 Myoblast derived cells에서 각각 55.5배와 2.9배 증가하였다(p<0.05). Skeletal muscle cell의 수축에 관여하는 마이오신 단백질 합성에 관여하는 Myh1 (Fig. 2Bg)의 경우도 ear fibroblast와 비교하여 Myoblast derived cells에서 유의적으로(p<0.05) 높은 발현을 보였다. 비록 일부 근육 전사 인자의 발현이 fibroblast like cells에서 관찰되었 지만, 이것은 잔존해 있던 일부 satellite/myoblast cells에 의하여 반영된 결과로 추정되었다.

따라서 Pre-plating 법에 의해 회수된 Myoblast derived cells은 근세포 성숙 및 발달에 관여하는 유전자가 정상적으로 잘 발현됨을 확인할 수 있었고 이 결과를 바탕으로 다음 실험을 진행하였다.

4. 혈청 농도에 따른 Myoblast derived cells의 체외 증식 능력 분석

체외 세포 배양은 성장인자들과 필수 미량성분들을 함유한 혈청 에 의존적인 방식으로 배양되고 특히 myoblast의 체외 배양은 10-30%로 더 많은 혈청 요구량이 알려져 있다(Kolkmann et al., 2020). 그러나 혈청의 사용은 사람들의 인식 변화에 따른 동물복지 의 역행 및 배치 변이, 채취 과정 중 세균 및 박테리아 감염의 위험, 등의 단점을 가지고 있다(Gstraunthaler et al., 2013;Fang et al., 2017). 이 실험에서는 저 혈청 기반의 배양액을 사용하여 혈청의 감소가 관례적으로 사용되는 혈청 농도를 대체할 수 있는지를 분석 하였다(Fig. 3A). 5% FBS에서 배양된 세포는 10% 혹은 20% FBS 가 첨가된 배양액보다 유의적으로(p<0.05) 낮은 성장 능력을 day 6일부터 보였다. 배양의 10일부터 20% FBS군은 10% FBS군과 비교하여 유의적으로(p<0.05) 증가된 세포 수가 확인되었다. 따라 서 단기간의 세포 배양에는 5% 이상의 혈청의 농도가 큰 영향을 미치지 못하지만, 일주일 이상의 장기간의 세포 배양에는 10% 이 상의 FBS 첨가가 세포의 증식에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3Ba).

5. 혈청의 농도에 따른 Myoblast derived cells의 증식 관련 유전자 들의 발현

Myoblast derived cell은 GM에서 2주간 배양되었고 1주일마 다 세포 성장 및 세포사에 관련된 유전자들의 발현량이 분석되었다 (Fig. 4). 5, 10 및 20%의 FBS를 포함하는 GM과 1주일 동안 배양 한 경우, Cdkn1a는 FBS의 첨가농도의 차이에 의한 발현량의 변화는 나타나지 않았다. 하지만, Myc는 20%의 FBS군이 5%와 10% FBS 첨가군과 비교하여 발현량이 증가하였으며(p<0.05), pro-apoptosis 에 관여하는 Bax의 경우, 5%와 10% FBS첨가군과 비교하여 20% 의 FBS군의 발현량이 감소하는 것으로 나타났다(p<0.05). 종양 억제 유전자인 Trp53은 Cdkn1a (p21)의 활성을 유도하고, 활성화 된 Cdkn1a는 세포 주기의 정지 및 세포사를 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한 Myc는 cyclins의 상향 조절, p21의 하향 조절을 통해 cell proliferation에 중요한 역할 중요한 인자로 알려져 있다(Takahashi et al., 2007;Varlakhanova et al., 2010). 본 실험의 결과에서도 성장배양 2주차의 20% FBS군에서만 Cdkn1a가 유의적인(p<0.05) 감소가 확인되었다. 이 결과는 혈청 내에 포함된 성장인자들이 세 포 내 수용체와 결합을 통해 proliferation-specific signaling pathway의 핵심조절자인 Myc의 활성에 기여한다는 선행 연구 결과와 도 일치한다(Oster et al., 2002;Schlosser et al., 2005). 따라서 본 연구의 결과는 고농도(20%)의 FBS 첨가가 Myoblast derived cell의 증식에 관여하는 유전자 경로를 활성화하고 세포사를 억제 할 수 있다는 것을 보여준다.

6. 혈청 농도에 의존적으로 배양된 Myoblast derived cells의 Myotube/Myofiber 분화 및 유전자 발현

각기 다른 농도(5, 10 및 20%)의 FBS를 포함하는 GM에서 배양 된 myoblast derived cells은 동일한 무 혈청 DM에서 2주간 분화 가 유도되었다(Fig. 3Bb). 그리고, DM으로 교체 후 myogenesis 관련 mRNA의 발현량 변화를 분석하였다(Fig. 5). 먼저, DM으로 교체 직전의 Myf5은 5% FBS군과 비교하여 10% FBS군의 발현 량이 감소(p<0.05)한 반면, 20% FBS군은 증가(p<0.05)하는 것으로 나타났다(Fig. 5C). Myf5는 Myogenic regulator protein으로 알려 져 있고, Myf5의 증가는 Satellite cell의 활성을 통한 Myogenesis 시작 및 muscle cell proliferation의 선행 조건이다(Cosgrove et al., 2009). 따라서 20% 혈청이 myoblast derived cells에서 Myf5 의 증가를 촉진함을 확인할 수 있었다. 한편, DM에서 1주간 배양 된 세포들은 DM으로 교체 전과 비교하여 Myf5와 Myod1의 발현량 이 유의적(p<0.05) 감소하였으며, 5% FBS GM에서 증식 배양 후 DM으로 배양된 실험군의 경우 Myf5 (GM:DM, 1:0.13)와 Myod1 (GM:DM, 1:0.12)의 발현량이 각각 7.6배, 8.3배 감소하였으며, 20% FBS GM에서 증식 배양 후 DM으로 배양된 실험군은 Myf5 (GM:DM, 1.93:0.41)와 Myod1 (GM:DM, 0.65:0.41)에서 각각 약 4.7배, 1.6배 발현량의 감소를 보여주었다. 10% FBS GM에서 증식 배양 후 DM으로 배양된 실험군은 Myf5와 Myod1의 발현량 이 약 2배 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 GM에서 20% FBS는 5% FBS 보다 Myoblast derived cells의 proliferation cell cycle의 탈출을 일시적으로 지연시킬 수 있음을 시사한다.

Myogenic regulatory factors (MRFs) 중 Myog와 Myf6는 myogenesis의 terminal differentiation에 관여하는 전사인자인 Myog 는 myofibril의 발달에 관여하고 Myf6는 adult skeletal muscle cell에서 높게 발현된다(Smith et al., 1994;Stern-Straeter et al., 2011;Bentzinger et al., 2012). DM조건 아래에서 GM 내 혈청 농도와 상관없이 분화 시간의 연장에 따라 의존적으로 Myog1와 Myf6 유전자의 유의적(p<0.05) 증가가 확인되었다. DM조건 1주 차에 5% FBS GM군과 비교하여 20% FBS GM군은 약 2배 증가 된 Myog1와 Myf6의 발현을 보였고, 2주 차에는 Myog1는 약 4배, Myf6는 1.8배의 유의적(p<0.05) 증가가 확인되었다. 성숙한 Myotube 에서 많이 발현되고 근육의 수축에 관여하는 Myh1의 경우 역시 20% FBS가 첨가된 GM 배양군의 발현량이 유의적으로(p<0.05) 증가하였다(Stern-Straeter et al., 2011).

이상의 결과들을 종합하여 보면 GM에서 고농도(20%) FBS의 첨 가는 저 농도(5%)의 FBS 첨가군보다 proliferation specific signaling pathway의 활성을 통해 골격근 세포들의 증식을 유도하고, DM 으로 전환될 경우에는 myogenic regulator factors (Myog1과 Myf6) 의 활성을 유도하여 성숙한 근섬유로 분화와 성숙을 촉진할 수 있다.