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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.54 No.5 pp.37-44
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2020.54.5.37

Comparison of Active Compounds for Each Supplement after Processing Methods of KIOM Polygonum multiflorum Thunberg Using Various Ingredient(s)

Yong-Goo Kim1, Se Jin Lee1, Han Sol Kim1, Ji Hye Lee1, Yuseong Chung1, Youngmin Kang1,2*
1Herbal Medicine Resources Center Korea Institute of Oriental Medicine, 111, Geonjae-ro, Naju-si, Jeollanam-do, 58245, Republic of Korea
2University of Science & Technology (UST), Korean Convergence Medicine Major, Campus of Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 34054, Republic of Korea
*Corresponding author: Young-Min Kang Tel: +82-61-338-7110 Fax: +82-61-338-7136 E-mail: ymkang@kiom.re.kr
September 10, 2020 September 29, 2020 October 9, 2020

Abstract


Polygonum multiflorum Thunb is a perennial plant and its tubers are used as medicinal material in Korean oriental medicine. P. multiflorum is used in the treatment of various diseases. If P. multiflorum is to be used as an herbal medicine, it is necessary to promote active ingredients or reduce the toxicity of plants, which requires processing methods. In this study, the content of active compound was verified through the treatment of various supplementary materials in the processing method of P. multiflorum and an experiment was conducted to verify the supplement suitable for the P. multiflorum processing method. The P. multiflorum used in the study used two types of P. multiflorum. The P. multiflorum of distribution products and KIOM's Polygonum multiflorum Thunb system developed through tissue culture research base on KIOM patents were used. The content of emodin in P. multiflorum was measured high in all (Black soybean juice, Rice water, Licorice and soybean juice, Rosemary extract) but the treatment area using sesame oil. In particular, KIOM's was found to contain higher emodin content (0.29 ug/mg) in Licorice and soybean juice than previously known Polygonum multiflorum Thunb supplement, black soybean juice. The results of this study are believed to be used as basic knowledge for standardization and modernization in P. multiflorum processing methods.



다양한 보료를 이용한 KIOM 하수오의 포제(製) 후 각 보료별 유효성분 함량 비교

김 용구1, 이 세진1, 김 한솔1, 이 지혜1, 정 유성1, 강 영민1,2*
1한국한의학연구원 한약자원연구센터
2과학기술연합대학원대학교(UST) 한의융합의학전공

초록


하수오(Polygonum multiflorum Thunb)는 다년생 덩굴성 식물로, 지하부인 뿌리(tuber)는 한의학에서 약재로 다양한 질병의 치료에 사용되고 있다. 하수오를 한약재로 사용하기 위하여 약용물질의 증진 또는 식물의 독성을 줄이기 위해 1차 가공 및 포제를 한다. 본 연구에서는 하수오 포제에 있어 다양한 보료처리를 통해 주요물질의 유효성분 함량을 확인 해 보고, 하수오 포제에 적합한 보료를 검증하는 실험을 진행하였다. 또한, 실험에 두 가지 타입의 하수오를 활용하여 기존 유통품 하수오와 조직배양 연구를 통해 개발된 KIOM 특허 기반 하수오를 비교하는 실험을 진행하였다. 하수오의 주요 지표물질인 emodin의 함량이 참깨추출물을 보료로 사용한 처리구를 제외한 나머지 보료 처리구(흑두즙, 쌀뜨물, 감두즙, 로즈마리추출 물)에서 KIOM품이 유통품보다 높게 측정되는 것을 확인하였다. 특히 KIOM품은 기존에 알려진 하수오 보료인 흑두즙보다 감두즙을 보료로 사용해 포제 하였을 때 0.29 ug/mg 더 높은 emodin의 함량이 확인 되었다. 본 연구결과를 통해 하수오의 약용자원으로 사용함에 있어 앞으로 KIOM하수오의 생산과 포제에 관련된 연구가 더 이루어 져야 할 것이며, 연구 결과는 하수오의 포제에 있어 표준화와 현대화를 위한 기초 지식 및 결과로 사용 될 것이라고 사료된다.



    Korea Institute of Oriental Medicine
    KSN1911420&KSN2012320)

    서론

    하수오(Polygonum multiflorum Thunb)는 마디풀과 닭의덩굴 속에 속하는 다년생 초본이고 전체에 털이 없는 것이 특징이다. 뿌리는 방추형 또는 덩어리이며 길이 5~15 cm, 지름 3~12 cm이 다. 줄기는 덩굴성이며 마디가 있으며, 심장형인 잎은 어긋나며 잎자루가 있다(본초감별도감). 하수오는 중국 하남, 귀주, 사천, 강 소, 호북 등지에 분포한다(Chan et al., 2003). 하수오는 재배지에 대한 조건이 까다롭지 않아 재배하기 비교적 쉬운 작물이다. 우량 종묘 생산을 위한 수경재배를 통한 증식 연구도 보고되어 있다(Lee et al., 2017). 예로부터 한의학에서는 하수오의 덩이뿌리(괴경)를 한약재로 사용해왔다. 하수오는 인체의 음혈(陰血)을 보양하고 풍 (風)을 없앨 뿐 아니라, 대변을 통하게 하고 해독하는 효능이 있어, 요통, 슬관절통, 이명, 어지러움, 변비, 피부소양증 등 다양한 질병의 치료에 사용되고 있다(Shin, 1997). 또한 다수의 실험연구를 통해 심장보호(Yim et al., 1998), 신경보호효과(Wang et al., 2006), 항 산화(Chiu et al., 2002) 및 항노화(Xiao et al., 1993), 항돌연변이 (Um et al., 2006), 관절염(Zhang et al., 1999), 피부개선(Li et al., 2003) 등과 같은 하수오의 현대약리적 효능이 보고되었다(Kim et al., 2020). 하수오를 포제하지 않고 생하수오(生何首烏)로서 사 용하면 해독하고 대변을 통하게 하는 효능에 치우치지만, 포제하여 제하수오(製何首烏)로 사용하게 되면 인체를 보양하는 효능이 더 강해지므로, 임상에서는 주로 제하수오(製何首烏)를 많이 사용되 는 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2020).

    하수오는 크게 민간에서 적하수오(약재명:적수오)와 백하수오 (약재명:백수오)로 구분되며 공통적으로 이들 뿌리에는 전분이 약 45% 정도 함유되어 있고 조지방 약 3% 함유되어 있다(Na et al., 2000). 하수오의 phytochemicals은 anthraquionone 화합물인 chrysophanol, rhein, physcion 및 emodin과 이들 화합물의 배당체 형 태인 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-0-α-glucoside 등이 함유되어 있다 특히 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-0-α-glucoside 화합물은 하수오의 성분 중 가장 많은 양이 함유되어 있다고 보고되어있다(Kim, 2008 & Na et al., 2000). 또한 하수오의 항산화 활성 등과 같은 여러 효능 외에도 chrysophanol, rhein, physcion 및 emodin과 이들 화합물 의 배당체 형태인 2,3,5,4’-tetrahydrox- ystilbene-2- 0-α-glucoside 등의 화합물로부터 기인하여 생성되는 효과는 콜레스테롤 감소(Choi et al., 2012), 혈당강하작용(Kim, 2008 & Choi et al., 2012), 멜라 닌 생성 억제에 의한 미백 개선효과(Seo et al., 2011), 항산화효과 (Kim et al., 2015), 식중독 미생물(황색포도상구균) 항균효과(Choi et al., 2016) 등 여러 가지 유용한 활성을 지니고 있다. 또한, 한약재 는 새로운 이용부위의 형태 및 기능성 탐색에 관한 고부가가치 기능 성 소재연구가 활발히 수행되고 있다(Choi et al., 2017).

    한약재는 단순 건조 또는 생품을 채취한 후 약재로서 사용 하지 만 대부분의 한약재는 포제라는 가공 과정을 거쳐 약재로 이용된다 (Oh et al., 2009). 포제란 한의학의 전통적 가공 기술로서 약물의 독성을 없애고 효능을 높여 조제, 제제, 보관 등의 목적으로 약재를 가공 처리하는 방법이다. 포제법은 약용부위 이외의 이물 등을 제거 하는 정선(淨選), 한약재를 써는 것을 의미하는 절제(切制), 가열, 건 조, 증식 등의 모든 가공 과정의 포자(炮炙)라는 세개의 큰 대분류로 나뉜다(Kim et al., 2019). 포제법은 인간이 오랫동안 복용해온 역사 적 경험을 통해 용출을 원활하게 하고, 독성을 낮추고 약효를 증가하 는 방향으로 발전했다. 현대에는 역사적 포제 지식을 과학적으로 입 증 하려는 많은 연구가 진행되고 있다. 또한 의약품용 한약재인 하수 오는 우수한약제조 및 품질관리기준인 hGMP를 충족해야 한다(Nam & Yang, 2011). 관능 및 정밀검사, 중금속 함량검사, 잔류오염물질 검사 등 식약처의 엄격한 품질검사를 통과하여 hGMP를 충족한 하 수오만 의약품용으로 유통될 수 있다(Lee et al., 2013).

    이렇듯 식품의 증숙, 숙성과 발효에 관한 연구는 많이 보고된 상태이지만, 하수오를 비롯한 한약재는 여러 가공공정을 거쳐 관련 된 연구를 수행한 경우가 매우 미흡한 상태이다. 그러므로 보료를 이용한 포제기술 기반 하수오의 유효성분 비교는 하수오 포제 연구 에서 반드시 필요한 연구이다. 유통 하수오와 KIOM 특허기반 하 수오를 대상으로 하여 여러 가지 보료를 이용한 포제 하수오 제조 후 성분변화 및 phytochemicals 함량 변화를 비교 분석하는 실험 결과를 통해 보료별 포제 효과를 연구하였다.

    재료 및 방법

    1. 재료 및 포제 하수오 제조

    본 실험에서 사용한 하수오는 유통품 하수오와 KIOM 하수오를 이용하였다. 유통품 하수오는 참들애바이오(경남 산청군) 에서 생 산한 시료를 사용하였으며, KIOM 하수오의 경우 충북농업기술원 에서 분양받은 종자유래 캘러스로부터 최적화된 재분화 조건 및 뿌리비대 조건(Kang et al., 2018, 특허:No. 10-1955009) 이 확립되 어 기내 조직배양을 통한 방법으로 생산된 종묘로부터 하수오의 약용 부위인 덩이뿌리(괴경) 를 사용하였다. 포제를 위한 보료는 흑두즙, 쌀뜨물, 감두즙(감초 및 콩 즙), 로즈마리추출물, 참깨추출물. 총 5가 지 보료를 실험에 사용하였다. 하수오 포제 실험에 사용한 보료 시료 는 유통품 하수오와 KIOM 하수오 30 g 을 흑두즙을 포함한 5가지 보료 20 ml에 침지시켜 100 ℃에서 1시간 처리 후 시료를 45 ℃ 에서 8시간 동안 건조처리 하였다. 포제 공정은 Fig. 1 에 나타내었다.

    2. LC 분석용 추출물 제조

    건조 처리가 끝난 포제 하수오(유통품, KIOM) 시료를 1차 증류 수에 침지시켜 원심분리기를 이용하여 200 rpm에서 2시간 처리하였 다. 각각의 시료 추출물들은 filter paper (ADVANTEC, 110 mm, Toyo Robni kaisha, Japan) 를 이용하여 여과하였다. 여과된 물질은 농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai, Japan) 를 활용하여 농축하였 다. 70% 에탄올을 사용하여 농축된 분석시료를 용해한 뒤 원심분리 기를 이용하여 상층 액으로 최종 분석시료의 농도를 20 mg/mL로 설정하여 실험을 진행하였다. HPLC 분석 전 여과처리를 위해 0.45 μm membrane filter (PALL Corporation, Ann Arbor, MI, USA) 를 이용하여 여과 처리 후 실험을 진행하였다. 추출 및 용해등에 이용 한 시약은 HPLC grade (J.T.Baker Inc., Phillipsburg, NJ, USA) 로 사용하였고, 0.2 μm membrane filter (PALL Corporation, Ann Arbor, MI, USA) 를 사용하였다. 다양한 보료 처리에 따른 LC 분석 실험 디자인을 위해 포제(보료) 처리를 진행한 하수오(유통품, KIOM) 에 고유 코드를 부여 하였다 (Table 1.).

    3. 유효성분 정량분석을 위한 HPLC 분석조건 - HPLC 분석조건

    하수오의 주요성분의 함량 분석을 위해 Table. 2 의 조건에 따라 HPLC system (Alliance HPLC, Waters Corporation, Manchester, UK) 을 이용하여 분석 실험을 진행 하였다. Column은 Phenomenex Luna C18(2) (250×4.6㎜, 5㎛)을 사용하였다, Column 온도는 40℃, 샘플온도 25℃ 조건에서 실험을 진행 하였으며, Mobile phase solvent A는 0.1% Trifluoroacetic acid, solvent B는 100% Actronitrile solvent를 이용하였다. 검량선의 경우 emodin, catechin, gallic acid, (-)-Epicatechin, EGCG, polydatin, protocatechuic acid 표준품 (Sigma Aldrich Co., Inc. FLUKA, TraceSELECT, USA) 7가지 를 사용하여 25, 50, 100, 150, 200 μg/mL 농도를 이용하여 함량분 석을 진행하였다. Mobile phase의 유속은 1.0 mL/min, 표준물질 주입량은 10 μL로 하였고 11개 시료 샘플의 주입량은 20 μL로 하였다. 총 분석시간은 95분으로 설정하였다. 190~400 nm에서 스 캔한 후 220 nm 파장대에서 UV 스펙트럼을 활용하여 측정하였다. HPLC 관련 실험은 반복 실험하여 함량의 평균값으로 비교하였다.

    결과 및 고찰

    1. 하수오 포제

    다섯가지 보료처리에 따른 하수오 유효성분의 비교를 위해서 시중에 유통되는 유통품 하수오와 한국한의학연구원에서 최적화 된 조직배양 조건으로 개발된 KIOM 하수오를 흑두즙(Original), 감두즙, 쌀뜨물, 로즈마리추출물, 참깨추출물을 이용하여 동일한 포제 공정 (Fig. 1) 을 거쳐 포제한 유통품 하수오와 KIOM 하수오 를 Fig. 2에 나타내었다.

    2. 하수오 포제에 사용된 보료의 성분분석

    포제공정에 사용된 5가지 보료인 흑두즙, 쌀뜨물, 감두즙, 로즈마리 추출물, 참깨추출물의 성분을 정확하게 확인하기 위하여 각 보료의 크로 마토그램 (Fig. 3) 을 확인하고 성분 분석한 결과, 흑두즙 (Fig. 3A) 에서는 protocatechuic acid, catechin, daidzin, daidzein, genistin, genistein 이 확인 되었다. 쌀뜨물 (Fig 3B) 에서는 liquiritigenin 이 확인되었으며, 3번째 보료인 감두즙 (Fig 3C) 에서는 흑두즙에 확 인된 catechin, daidzin, daidzein, genistin, genistein이 확인 되었 으며, 쌀뜨물에서 확인된 liquiritigenin이 확인되었고, 추가로 schaftoside, liquiritin, isovitexin, formononetion, glycyrrhizic acid를 확인 할 수 있었다. 4번째 보료인 로즈마리추출물 (Fig. 3D) 에서는 gallic acid, Protocatechuic acid, Syringin, Cryptochlorogenic acid, Cynaroside, hispidulin-7-O-glucoside, Agrimol B, Salvianolic acid A 가 확인되었고, 5번째 보료인 참깨추출물에서 Sesamin 과 Sesamolin 이 확인 되었다.

    3. 하수오 포제에 따른 성분 및 함량분석

    하수오의 성분은 크게 quinones, flavonoids, stilbeses, phospholipids 외 기타 5가지로 분류되어진다. quinones류에서는 emodin, chryysophanol, rhein, physcion등이 있으며, flavonoids 계열은 tricin, rutin, luteolin, quercetin, isoorientin, polygonflavanol A 등이 있다. stilbeses 계열은 2,3,5,40-tetrahydroxystilbene-2-O-(2″-O- β-D-fructofuranosyl)-β-D-glucopyranoside, resveratro, polydatin, rhaponticoside 등이 있으며, phospholipids로는 phosphatidyl, ethanolamine, copaene, eicosane, hexanoic acid, squalene 등이 있다. 그 밖에도 catechin, epicatechin, gallic acid 등 여러 가지 물질이 현재 밝혀져 있다(Lin et al., 2015).

    본 실험에서 유통품 하수오와 KIOM 하수오의 성분 분석을 실시 한 결과, emodin, catechin, gallic acid, (-)-Epicatechin, EGCG, polydatin, protocatechuic acid 7 가지의 물질을 확인 할 수 있었으며, (Fig. 4), 확인 된 물질을 바탕으로 기존 유통되는 하수오와 KIOM 하수오의 물질 함량을 비교분석한 결과, 하수오의 약리효과 물질중 하나인 emodin의 함량은 기준치(식품의약품안전처 고시 제2019-102 호) 에 적합한 결과를 보였으며, 유통품에서는 0.73 ug/mg 으로 흑두즙 포제에서 가장 높은 수치를 보였고, 쌀뜨물을 이용한 포제 처리 하수오의 경우 0.38 ug/mg 으로 가장 낮은 emodin 수치를 보였다. KIOM품의 경우 감두즙 포제 처리시 1.13 ug/mg 으로 가장 높은 수치를 보였고, 참깨추출물 포제 처리구에서 가장 낮은 수치를 보였다(Table. 3). 일반적으로 하수오 포제시 사용되는 포 제물질로 흑두즙 처리구를 유통품 하수오와 비교 하였을 때, KIOM품에서 유통품 하수오 보다 높은 emodin 함량을 보였으며, KIOM품의 경우 참깨추출물 처리구를 제외한 모든 처리구에서 유통품 하수오보다 높은 emodin 함량이 확인되었다. 특히 KIOM품 의 경우 감두즙 처리구에서 일반적으로 알려진 하수오 포제법에 사용 되는 흑두즙보다 높은 emodin 함량을 보였다. 감두즙 보료의 감초는 해독작용과 비위(脾胃)를 보(補)하는 것을 높여주거나, 특정 약효의 증강, 약재의 변질방지하고 보존하는 목적으로 이용된다는 문헌이 있다(Kim et al., 2002 & Lee et al., 2010). 본 연구에서 하수오 포제물질은 동일하지만 유통품과 KIOM 품의 유효물질의 차이를 보이는 이유는, 하수오 생산과정에서 최적화된 기내배양 시스템을 통해 개발된 KIOM품의 경우 기내배양 동안에 식물생장호르몬인 옥신과, 사이토키닌처리가 2차대사산물 증진에 영향을 주었을 것 으로 사료된다. 실제로 2차대사산물의 증진을 위해 생물학적, 비생 물학적 스트레스 처리하여 식물의 방어기작을 활성화시켜 2차대사 산물 증진 시키는 연구가 보고되어 있다(Komal et al., 2018).

    두번째로 Tannin류인 catechin 함량 비교결과는 emodin과 반대 로 대부분의 포제 처리구에서 유통품 하수오에서 catechin 함량이 높게 나타났다. 유통품 하수오의 경우 쌀뜨물과 감두즙 보료 처리에서 가장 높은 함량을 보였고, KIOM품의 경우 로즈마리 추출물을 보료로 사용한 처리구에서 0.82 ug/mg 으로 가장 높게 나타났다. gallic acid 의 경우 KIOM품 보료 처리구 모두에서 비슷한 함량을 보였으며, 유통품의 경우 로즈마리 추출물과 참깨 추출물 보료 처리구에서 나머지 3가지 보료 처리구 보다 높은 함량을 보였다.

    본 연구는 유통품 하수오와 KIOM품 하수오의 다양한 보료 처리 를 통한 하수오 유효성분을 비교하고자 실시하였다. 포제방법(시간, 온도 등) 은 동일하게 처리하였으며, 다섯 가지 보료를 동일한 포제 방법으로 포제하여, 추출물에서 유효성분의 함량을 비교하여 보았 을 때, 유통품 하수오 보다 KIOM 하수오(Kim et al., 2020) 에서 하수오 유효성분들 중에 하나인 emodin의 함량이 다섯가지 보료 처리 모두에서 비슷하거나 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한 일반 적으로 하수오의 포제처리에 사용되는 보료인 흑두즙의 경우 유통 품에서과 KIOM품에서 크게 차이가 나지 않았지만, 감두즙 보료 처리구에서 KIOM품이 1.13 ug/mg로 나타났다. 본 연구에 활용한 KIOM 특허 기반 하수오는 현재 기술이전 되어, 대량 생산을 진행 하고 있으며, 이러한 KIOM 하수오를 이용하면, 생산량 측면과 한약재로 사용하기 위한 포제 가공 처리 후 유효성분 함량도 일반 유통품과 비교했을때 높았다. 또한 최근 연구결과에서 골질환 관련 KIOM 하수오의 효능을 확인했다(Kim et al., 2020). 한약재의 포제 관련 연구는 인삼, 지황 등 임상에 자주 쓰이는 일부 약재로 집중되며, 포제과정에서 변화하는 유효 성분의 변화에만 국한되어 있다. 따라서, 포제의 과학적인 근거, 기술적인 측면에 대한 연구는 아직 미흡하다(Oh et al., 2009). 포제에 따라 변화하는 한약재의 물리적, 화학적 특성과 과학적, 객관적 근거에 대한 필요성은 증대되 고 있다. 포제공정의 표준화 및 최적화에 대한 이번 연구는 한약재 기초 자료 확보에 큰 의의가 있다. 본 연구 결과는 하수오 포제의 표준화 및 현대화를 위한 기초자료이며, 추후 보료 및 수치방법에 대한 이화학적 정량분석 및 효능에 관한 연구가 지속적으로 연구되 길 바란다.

    감사의 글

    이 논문은 지속가능한 한약표준자원활용기술개발(KSN1911420 & KSN2012320)의 지원을 받아 연구되었고, 오아시스 전통의학 정보포털 [https://oasis.kiom.re.kr/herblib]의 지식정보를 활용하 였고, 한국한의학연구원 한약자원연구센터 한약표준표본관(표본관 코드: KIOM)의 표본정보공유 시스템의 문헌 및 본초자료를 활용 하였기에, 관련 연구자들에게 감사를 표한다.

    Figure

    JALS-54-5-37_F1.gif

    Manufacturing process of Polygonum multiflorum Thunb.

    JALS-54-5-37_F2.gif

    Processing of commercial Hasuo and KIOM Hasuo using various ingredients. A. Commerical Ha-Su-O: C1-Black soybean juice: C2-Rice water: C3-Licorice and soybean juice: C4-Rosemary extract: C5-Sesame extract. B. KIOM Ha-Su-O: K1-Black soybean juice: K2-Rice water: K3-Licorice and soybean juice: K4-Rosemary extract: K5-Sesame extract.

    JALS-54-5-37_F3.gif

    Comparison of liquid chromatograph spectrometer (PDA 220 nm) results of various gredients. (A) Black soybean juice: (B) Rice water: (C) Licorice and soybean juice: (D) Rosemary extract: (E) Sesame extract.

    JALS-54-5-37_F4.gif

    Comparison of liquid chromatography spectrometer (PDA 220 nm) results of commercial Ha-Su-O and KIOM Ha-Su-O. (A) Commercial: (B) KIOM

    Table

    Various combination ingredients design used in the P. multiflorum LC/MS experiment

    HPLC condition for quantitative analysis

    Quantitative analysis in the two types of the samples(Commercial, KIOM) of P. multiflorum

    *ND means not detected.Contents = ((STD.Con. X Sam. Area)/(STD. Area X Sam. Con.)).

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