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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.54 No.5 pp.1-9
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2020.54.5.1

Research Trends on the Metabolic Engineering of Phenylpropanoid Compounds Based on the Gene-editing Technology

In-Ho Choi1, Yong-Wook Shin1, Shin-Woo Lee1, Yun-Hee Kim2*
1Department of Agronomy & Medicinal Plant Resources, Gyeongnam National University of Science & Technology, JinJu, 52725, South Korea
2Department of Biology Education, College of Education, IALS, Gyeongsang National University, Jinju,52828, South Korea
*Corresponding author: Yun-Hee Kim Tel: +82-55-772-2237 Fax: +82-55-772-2239 Email: cefle@gnu.ac.kr
July 23, 2020 August 31, 2020 October 15, 2020

Abstract


Recently the number of approved gene-edited crops for commercialization are gradually increased and, it led us to put intensive investment in the development of gene-edited crops to increase international competitiveness. Developed gene-editing technology has been rapidly applied to a plant metabolic engineering for the accumulation of a particular secondary metabolites. The major advantage is the possible exempt from the regulation under the current GMO laws since gene-editing technology is able to create “a trans-gene free crop” in the final products. In this review, we tried to examine the current research output in the field of metabolic engineering mainly on the phenylpropanoid pathway using CRISPR gene-editing technology. Several genes encoding a particular enzymes involved in the phenylpropanoid pathway have been targeted for the accumulation of particular secondary metabloites such as flavonoids, anthocyanin, soluble tannin, rosmarinic acid, etc. In addition, MYB genes, one of the master switching transcription factor in the phenylpropanoid pathway, have been extensively studied for the dissection of each gene function of extremely divergent MYB gene family and the mechanism of secondary cell wall formation with lignin, xylem and cellulose. We also discussed on the current bottlenecks and further research for the practical application of gene-editing technology on the plant metabolic engineering.



유전자교정기술을 이용한 식물의 phenylpropanoid 대사공학기술 개발 동향

최 인호1, 신 용욱1, 이 신우1, 김 윤희2*
11국립경남과학기술대학교 생명과학대학 농학・한약자원학부
2국립경상대학교 사범대학 생물교육과 (농업생명과학연구원)

초록


최근 급속하게 발전하고 있는 유전자교정기술은 식물이 생산하는 특정 이차 대사산물의 집적을 유도하기 위한 식물대사공학연구에 아주 유용하게 이용되고 있다. 특히 이들 기술 들을 이용하여 만든 유전자교정 작물 중에 일부는 외래 DNA 단편이 잔존 하지 않기 때문에 기존의 유전자변형작물의 안전 관리규정에 적용되지 않을 수 있다는 장점이 있다. 따라서 본 리뷰는 phenylpropanoid 대사과정에 의하여 합성되는 다양한 종류의 이차대사산물 을 집적시키기 위한 유전자교정 기술의 적용 연구결과 들을 조사하였다. 먼저, phenylpropanoid 생합성 대사과정에 관여하는 다양한 효소를 암호 하는 유전자들을 목표로 하여 식물의 종에 따라 특이하게 집적되는 flavonoids, anthocyanin, 수용성 tannins, 로즈마린산 등의 집적을 유도하거나 화색을 변경하는 등의 성공적인 연구결과들을 검토하였다. 또한, phenylpropanoid 대사과정의 조절에 최종조절 스위치 역할을 하는 수많은 종류의 MYB 전사인자를 암호 하는 유전자를 목표로 하여 CRISPR 유전자교정을 시도한 연구결과들로부터 식물의 이차세포벽 형성에 관여하는 lignin, 물관부, cellulose 등의 생합성 조절 기작을 이해하고 MYB family에 속하는 수많은 종류의 유전자에 대한 개별적인 기능 분석 연구결과들을 조사 분석하여, 문제점 및 향후 연구 방향 등을 검토하였다.



    Gyeongnam National University of Science and Technology

    서론

    유전자교정기술은 인위적으로 만든 핵산가수분해효소를 사용하 여 숙주 식물의 유전체내 목표유전자의 염기삽입, 결실, 치환 등이 가능하다. 하나 혹은 단 몇 개의 염기 돌연변이를 유발하여 목표유 전자의 발현을 막아버린 유전자교정 기술은 기존의 식물대사공학 기술보다 정교하고 시스템적으로 안전하다는 장점이 있다. 특히 돌 연변이를 유기하기 위하여 외부에서 공여체 DNA 단편을 주입할 필요가 없다. 따라서 최종 산물인 유전자교정식물에는 외래 DNA 가 전혀 잔존 하지 않기 때문에 자연상태에서 발생한 돌연변이에 의하여 창출된 식물과 구분이 안된다(Lee, 2019). 실제로 특정 지방 산의 집적에 관여하는 유전자를 목표로 하여 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 시스템을 이용하 여 고농도의 올레인산이 집적되도록 만든 Camelina는 guide RNA 또는 CRISPR 운반체의 어떠한 DNA 단편도 검출되지 않는다. 따 라서 이는 전통 교배 육종기술에 의하여 만든 것과 차이가 없으므 로 기존의 유전자변형(GM) 작물의 정의에 해당하지 않는다고 주 장하였다(ACRE, 2018).

    식물의 phenylpropanoid 대사과정은 phenylalanine ammonia- lyase (PAL; EC 4.3.1.5)의 촉매작용으로 phenylalanine의 탈 아미노 반응으로 시작하여 cinnamate 4-hydroxylase (C4H; EC 1.14.13.11)와 4-coumarate: CoA ligase (4CL; EC 6.2.1.12)의 촉매 반응으로 합성된 p-coumaroyl CoA를 중심으로 flavonoids, anthocyanin, stilbenes, 수용성 tannins (pentagalloylglucose), condensed tannins, coumarins, β-phenylethylamine alkaloid, phenolamines, suberin, lignin, lignans 등의 다양한 이차 대사 화합물 을 합성한다(Douce, 2005;Ewané et al., 2012). 이들 이차 대사 화합물들은 식물의 성장과 각종 생물적, 무 생물적 환경 스트레스 에 적응하기 위한 방어기능을 한다.

    식물의 꽃, 열매, 종자 등의 색깔을 지배하는 화합물은 flavonoids 로 chalcones, flavones, flavonols, flavandiols, anthocyanins, proanthocyanidins (condensed tannins) 등 6그룹으로 분류하나 일부 종에서 발견되는 aurones를 7번째 그룹으로 분류하기도 한다 (Winkel-Shirley, 2001;2006;Ferreyra et al., 2012). 현재까지 알려진 flavonoids 화합물들은 6,000종에 해당한다. 이러한 다양 한 flavonoid 화합물들은 coumaroyl CoA와 malonyl CoA의 축 합반응으로 chalcone 화합물의 기본 골격을 합성한 다음 이성화 반 응, 환원반응, 수화반응, 산화 반응 등과 당, methyl 그룹, acyl 그룹 등의 전이 반응을 통하여 종에 따라 각각 독특하고도 다양한 종류의 flavonoids 화합물을 생산한다(Bowles et al., 2005;Martense et al., 2010;Ferreyra et al., 2012). 또한, resveratrol과 viniferine 등 stilbenes 역시 p-coumaroyl CoA와 3분자의 malonyl CoA의 축합반응을 시작으로 합성된다(Douce, 2005;Ewané et al., 2012).

    또한, phenylpropanoid 대사과정의 첫 번째 반응인 phenylalanine의 탈아미노반응으로 합성된 cinnamic acid는 비교적 작은 분자인 caffeic acid, coumaric acid, ferulic acid, chlorogenic acid 등의 phenolpropenes 화합물의 합성과정에 필요한 기본 화합 물이다(Ewané et al., 2012). 이들은 gallic acid, 수용성 tannin (punicalagin α 와 β isomers) 등의 합성에 이용된다(Chang et al., 2019). Lignin은 p-coumaroyl CoA로부터 합성된 monolignols 들의 복잡한 중합체로서 물관부 세포와 섬유소로 된 2차 세포벽의 주요 구성물질이다. Rosmarinic acid 역시 p-coumaroyl CoA가 tyrosine의 탈아미노반응을 거쳐 합성된 4-hydroxyphenyllactic acid 와의 축합반응으로 만들어진 4-coumaroyl 4′-hydroxyphenyllactic acid로부터 합성된다(Petersen et al., 2009).

    식물의 phenylpropanoid 대사과정에 의하여 합성되는 수많은 종류의 이차 대사 화합물은 항노화, 항콜레스테롤, 항궤양, 항산화, 항바이러스 등 식물 유래 의약품을 포함하여 기능성 식품, 화장품, 천연염료 등 다양한 기능을 보유한 고부가 가치 화합물들로 알려져 있다. 따라서 최근 급속하게 발전되고 있는 유전자교정기술, 합성 생명공학기술 등을 이용하여 식물의 종마다 생산하는 특정 화합물 을 집적하는 식물시스템 그 자체를 이용하거나(Zhou et al., 2018), 식물의 세포, 뿌리배양 등의 시스템을 이용하는 기술(Hanania et al., 2017), 또는 대장균이나 효모의 배양 시스템을 이용한 식물 유래 이차 대사산물의 합성을 위한 연구결과들이 활발하게 보고되 고 있다(Wu et al., 2017;Chu et al., 2020).

    이에 본 논문은 CRISPR 시스템을 이용한 유전자교정기술을 적용하여 특정 phenylpropanoid 이차 대사 화합물의 집적을 유도 하거나 유전자의 기능을 밝히는 연구 현황을 조사하고, 문제점, 전망 등을 검토하였다.

    Phenylpropanoid 화합물의 생합성 대사과정에 관여하는 특정 효소를 암호 하는 유전자의 교정에 의한 대사공학기술 개발

    Flavonoid, anthocyanin 등 특정 이차 대사산물의 축적을 유도 하기 위하여 특정 화합물의 생합성 대사경로에 관여하는 반응을 촉매하는 효소를 암호 하는 유전자의 교정을 통하여 isofalvonoids, anthocyanin, polyacylated anthocyanin, 수용성 tannins, rosmarinic acid, lignocellulose 등의 집적을 위한 대사공학기술 연구 결과들을 Table 1에 요약하였다.

    Zhang et al. (2020)은 콩 (Glycine max L.)에서 flavanone-3- hydroxylase 효소를 암호 하는 두 종의 유전자 GmF3H1, GmF3H2 와 flavone synthase 효소를 암호 하는 GmFNSII-1 유전자에 대하 여 CRISPR 시스템을 이용하여 3가지 유전자에 대하여 동시에 유전자교정이 일어나도록 시도한 결과 44.4%에 달하는 성공률과 함께 후대에도 안정적으로 유전됨을 확인하였다. 특히 T3 세대 식 물의 잎에서 대조구 보다 isoflavone의 함량이 약 2배까지 증가하 였음을 확인하였으며, 이들 식물체에 soya bean mosaic virus (SMV)를 접종 시킨 결과 바이러스의 외피단백질의 함량이 1/3까 지 감소하여 isoflavone의 함량 증가로 인한 바이러스 내성이 증가 한 것을 확인하였다. 이와 유사하게 당근(Daucus carota L.)에서 최초로 F3H 유전자에 대한 CRISPR 시스템을 이용한 연구결과도 보고되었다(Klimek-Chodacka et al., 2018). 저자들은 F3H 유전 자의 교정에 의하여 anthocyanin의 생합성이 저해되어 자색이 사 라지는 캘러스가 발생하는 것을 확인하였으며, 이를 유전자교정 식 물체의 선발표지로서의 이용 가능성을 제시하였다. 후속 연구결과 에 의하면 자색인 anthocyanin의 합성이 저해되어 자색이 사라지는 캘러스의 세포 내 F3H 유전자에는 작은 결실뿐만 아니라 비교적 큰 DNA 단편(약 100 bp)이 결실된 돌연변이들을 확인하였다고 하였다(Klimek-Chodacka et al., 2019).

    Anthocyanin 색소는 화훼 식물의 꽃 색깔에 직접적으로 영향을 미치기 때문에 F3H 유전자의 돌연변이를 유도하여 화색을 변경시 키는 대사공학연구 또한 활발하게 진행되고 있다. 이는 이미 antisense RNA, RNAi, siRNA 기술 등에 의하여 입증된 기술들이다 (Tanaka et al., 2009;Nishihara & Nakatsuka, 2011). 다만, 유전 자교정기술을 적용하여 외래 DNA 단편이 최종 유전자교정 식물 체의 유전체 내에 잔존 하지 않는 화초를 개발하여 유전자변형작물 의 논란을 회피하기 위함이 목적이다. 최초로 유전자교정기술을 이 용하여 꽃의 화색 변경에 성공한 연구결과를 발표한 연구팀은 일본 의 Watanabe et al. (2017)이었다. 저자들은 우리나라의 나팔꽃에 해당하는 Japanese morning glory (Ipomoea [Pharbitis] nil.)의 dihydroflavonol-4-reductase 효소를 암호 하는 3종류의 DFR-A, DFR-B, DFR-C 유전자 중 DFR-B를 목표로 하여 CRISPR 시스템 에 의한 유전자교정을 시도한 결과 약 75%에 해당하는 선발식물체 가 anthocyanin의 합성이 저해되어 꽃의 색깔이 흰색에 가까웠으 며 단일 염기의 삽입 및 결실이 일어난 것을 확인하였다. 이어서 Nishihara et al. (2018)은 토레니아(Torenia fournieri L.)의 F3H 유전자에 CRISPR 시스템으로 유전자교정을 시도한 결과 80% 이상의 T0 식물체의 꽃 색깔이 거의 흰색 임을 확인하였으며, 전체 유전체의 염기서열 분석 기술로 삽입, 결실 및 치환의 돌연변이가 일어난 것을 확인하였다.

    Dalino et al. (2018)은 토마토의 DFR 유전자를 대상으로 CRISPR 시스템을 이용한 연구를 수행하는 과정에서 흥미롭게도 homology-directed repair (HDR)에 의한 SDN-3(site-directed nucleotide) 유전자교정 식물체의 생산 시스템을 확립하였다고 하 였다. SDN-3 유전자교정식물은 외래 공여체 DNA를 이용하여 비 교적 길이가 긴 DNA 단편이 삽입된 것으로, 아직 성공사례가 많지 않으며 추가적인 연구가 많이 필요하고 안전성 평가 또한 기존의 유전자변형식물의 시스템에 의하여 수행되어야 한다(Lee, 2019). 기본적인 전략은 1단계로 토마토의 DFR 유전자의 1,013 bp가 결실되어 안토시아닌이 축적되지 않아 자색 캘러스가 만들어지지 않는 형질전환체를 만든 다음 2단계로 돌연변이가 일어난 dfr 유전 자의 결실 부분을 회복할 수 있도록 상동성 양 말단 부분을 포함하 도록 디자인한 sgRNA를 도입하는 전략으로 시도한 결과 1 Kb에 해당하는 DNA 단편이 상동성 재조합에 의한 치환으로 anthocyanin의 합성 기능이 회복됨을 확인하였다.

    Tasaki et al. (2019)은 아실화된 anthocyanin (예, gentiodelpin) 의 영향으로 파란색 꽃이 피는 일본 용담(Gentian)(Gentiana scabra, Bunge)에서 anthocyanin의 아실화 반응에 관여하는 anthocyanin 5-O-glycosyltransferase, anthocyanin 3′-O-glycosyltransferase, anthocyanin 5/3′-aromatic acyltransferase 효소를 각각 암호 하는 유전자 Gt3′GT, Gt5GT, Gt5/3′AT를 목표로 유전자교정을 시도하였다. 그 결과 Gt5GT가 knock out된 계통들은 delphinidin 3G, Gt3′GT가 knock out계통들은 delphinidin 3G-5CafG를 각각 주요 색소로 축적 시켰다. 반면에 Gt5/3′AT가 knock out된 계통들 은 delphinidin 3G-5G-3′G와 delphinidin 3G-5G를 각각 1차 및 2차 색소로 축적 시켜 각각 연붉은 보라색, 어두운 분홍, 연보라색 을 나타내면서 본래의 진한 파란색은 사라짐을 확인하였다. 또한, delphinidin의 아실화와 glycosylation에 관여하는 각각의 유전자 기능을 동시에 확인할 수 있었다고 하였다.

    석류(Punica granatum L.)는 다양한 종류의 flavonoids와 수용 성 tannins (punicalagin α 와 β isomers)을 축적하는 것으로 알려 져 있다(Bar-Yaákov et al., 2019). Chang et al. (2019)은 phenylpropanod 대사 경로에 의하여 합성되는 gallic acid와 UDP-glucose를 기질로 하여 수용성 tannins(예, punicalagin)의 전구물질 인 β-glucogallin (galloylglucose ester 형태)의 합성에 관여하는 2종류의 UDP-dependent glycosyltransferases (UGTs) 효소를 암호 하는 유전자 PgUGT84A23PgUGT84A24를 목표로 하여 CRISPR 시스템을 이용하여 knock out을 시도하였다. 그 결과 2가지 유전자 모두가 knock out된 계통에서는 gallic acid 3-O- 및 4-O-glucosides (galloylglucose ethers)가 축적되고, 석류에서 가장 풍부한 수용성 탄닌 중의 하나인 punicalagin α 및 β isomers 는 감소함을 확인하였다. 그러나 하나의 유전자만 개별적으로 knock out시킨 계통과 대조구에서는 이러한 현상이 관찰되지 않아 향후 유전자교정기술을 이용한 추가적인 유전자기능분석 연구가 필요하다고 할 수 있다.

    Zhou et al. (2018)은 단삼(Salvia miltiorrhiza)의 rosmarinic acid synthase 효소를 암호 하는 유전자 SmRAS를 목표로 하여 제작한 sgRNA를 도입하여 유전자교정을 시도한 결과 rosmarinic acid와 lithospermic acid B를 포함한 phenolic acid 화합물들의 축 적이 감소하였으며 RAS 유전자의 발현 수준도 동시에 감소하였다. 그러나 rosmarinic acid의 전구 물질인 3,4-dihydroxyphenyllactic acid의 함량은 현저하게 증가하였다. Kui et al. (2017)은 난초 (Dendrobium officinale)의 CRISPR 시스템을 이용한 유전자교정 기술을 확립하기 위하여 lignin 생합성에 관여하는 C3H, C4H, 4CL, CCR, IRX 등의 유전자를 목표로 하여 디자인한 sgRNA를 도입한 결과 상당한 수준의 삽입, 결실 및 치환 등의 돌연변이가 일어났음을 확인하여 성공적인 유전자교정시스템을 확립하였다고 하였으며 향후 유전자교정 계통에 대한 표현형 분석 등의 추가적인 연구결과가 기대된다.

    Phenylpropanoid pathway를 조절하는 전사인자를 암호 하는 유전자(MYB)의 교정에 의한 대사공학기술 개발

    포플러에는 적어도 4종류의 MYB 전사인자 (PtrMYB2, PtrMYB3, PtrMYB20, PtrMYB21)가 알려져 있으며, 이들은 애기장대에서 2차 세포벽의 형성에 최종 스위치 조절 역할을 하는 MYB46 및 MYB83과 유사기능을 하는 그룹으로 포플러의 또 다른 최종 스위치 역할을 하는 PtrWNDs와 함께 작용하는 것으로 밝혀졌다(McCarthy et al., 2010;Zhong et al., 2011;Zhong et al., 2013). PtrWNDs는 식물의 2차 세포벽의 형성과정에 최종 스위치 역할을 하는 NAC전사 인자에 해당한다(Zhong et al., 2006;Zhong & Ye, 2007;Mitsuda et al., 2007). 포플러에는 PtrWNDs와 EgWND1과 같은 목재 형성 과 관련된 NAC 전사인자들이 알려져 있으며 이들은 애기장대의 2차 세포벽 형성에 관여하는 SND1, NST1/2, VND6/7등과 같은 NAC들과 같은 기능을 하는 유사 군들로 알려졌다(Zhong 2010a;2010b).

    R2R3MYB 전사인자 그룹은 lignin 생합성 대사 관련 유전자의 프로모터에 존재하는 AC 조절서열(AC-Ⅰ, ACCTACC; AC-Ⅱ, ACCAACC; AC-Ⅲ, ACCTAAC)에 직접 결합하여 lignin 생합 성의 양성적 또는 음성적 조절에 관여한다(Zhong & Ye, 2014;Vélez-Bermúdez et al., 2015). R2R3MYB 전사인자들은 종에 따라 수십에서 수백 종까지 다양하게 존재하여 lignin을 포함한 다양한 이차 대사산물의 생합성 대사과정의 복잡한 조절 기작에 관여한다. 예를 들면 포플러에는 PtrMYB28(Zhong & Ye, 2009), PtrMYB152(Li et al., 2014;Wang et al., 2014), PtoMYB92(Li et al., 2015) 등 양성적 활성인자로 작용하는 전사인자와 PdMYB221 (Tang et al., 2015), PtoMYB156(Yang et al., 2017)등의 억제인 자들이 보고되었다. 그리고 애기장대의 MYB4/7/32, 옥수수의 ZmMYB31/42, switchgrass의 PvMYB4와 같은 억제인자 기능 을 하는 R2R3MYB 전사인자들이 다양한 종으로부터 지속적으로 밝혀지고 있다(Jin et al., 2000;Preston et al., 2004;Sonbol et al., 2009;Fornale et al., 2010;Shen et al., 2012).

    속씨식물의 R2R3MYB 전사인자 중 적어도 4개의 소그룹(SG, subgroup) 즉 SG 4, 5, 6, 7은 flavonoid 생합성 대사경로의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다(Cheynier et al., 2013). 이들은 각각 작은 유전자군(gene family)을 이루고 있으며 애기장대의 경우 각 각 4개의 유전자로 구성되어 있으나, 우산이끼의 경우에는 단지 두 종류의 R2R3MYB orthologues (MpMyb02, MpMyb14)만 알 려져 있다(Albert et al., 2018). 일반적으로 SG6는 다른 subgroup 들과 비교하여 특이한 잔기를 갖고 있으며, 특이하게도 우산이끼의 MpMyb02와 MpMyb14는 SG6보다는 SG5 또는 7과 더욱 일치 하는 것으로 밝혀졌다(Bowman et al., 2017). 이러한 복잡한 기능 을 내포하고 있는 MYB전사인자는 phenylproponoid 생합성 대사 과정을 전반적으로 조절하는 인자이다. 따라서 이러한 최종조절 전 사인자의 유전자교정을 통한 대사공학기술 개발 역시 활발하게 진 행되고 있으며 현재까지 검색된 연구결과를 Table 2에 요약하였다.

    Wan et al. (2017)은 SG4에 속하는 R2R3MYB 전사인자를 암호 하는 PtrMYB57 유전자를 CRISPR 시스템을 이용하여 확보 한 knock out 포플라 변이체에서 anthocynin과 proanthocyanidin( PA)의 함량이 높아진 것을 확인하였다. 반면에 동 유전자를 과 발현시킨 형질전환체에서는 이들의 합성이 억제되었다. 나아가 일시적 발현 시스템을 이용하여 PtrMYB57은 bHLH131 (bHLH) 및 PtrTTG1 (WDR)과 함께 MBW 복합체(MYB-bHLH-WDR) 로 flavonoid 합성유전자의 프로모터에 결합하여 유전자들의 발현 을 억제함을 확인하였다. 따라서, PtrMYB57 전사인자는 포플러 의 anthocyanin과 PA의 생합성 대사과정에서 억제인자로 작용한 다는 사실을 확인하였다.

    Flavonoid 화합물들의 생합성에 필요한 기본 전구물질은 naringenin chalcone으로서 이는 general phenylpropanoid pathway 를 거쳐 만들어진 coumaroyl CoA와 malonyl CoA에 의하여 합성 된다. 이후 chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavone 3-hydroxylase (F3H), dihydroflavonol 4-reductase (DFR) 효소들의 단계적 촉매 반응을 거쳐 leucoanthocyanidin으로 전환된다 (Marles et al., 2003). 마지막 단계로 anthocyanin synthase (ANS) 에 의하여 anthocyanin과 다양한 PA들이 합성된다. Anthocyanidin reductase (ANR)와 leucoanthocyanidin reductase (LAR)는 PA 합성의 다른 분지 대사과정으로 cathechin, epicathechin을 각각 합성한다(Abrahams et al., 2003;Xie et al., 2003;Yuan et al., 2012). 이러한 anthocyanin의 생합성 대사과정은 R2R3MYB, 염기 성(basic) helix-loop-helix (bHLH)단백질, WD40 repeat(WDR) 단백질들이 모여 만들어진 MYB-bHLH-WDR(MBW) 복합체에 의하여 조절된다. 특히 MYB 단백질은 목표유전자의 조절서열을 탐색하여 결합하는데 가장 주요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다 (Cavallini et al., 2015;Cho et al., 2016). 하지만 MYB 유전자의 종류가 너무나 방대하고 이들이 관여하는 생합성 대사과정이 너무 복잡하여 정확한 작용기작은 아직 밝혀지지 않았다. 따라서 MYB 전사인자들에 대한 개별적인 기능 분석을 위한 유전자교정 기술은 향후 보다 활발하게 진행되어야 할 것이다.

    Wang et al. (2017)은 포플러에서 애기장대의 TT2-like 유전자 에 해당하는 MYB115 유전자를 분리하여 CRISPR 시스템을 이용 한 knock out 돌연변이체에서 PA의 함량이 현저하게 감소하였으 며 PA의 생합성 대사에 관련된 유전자들의 전사 수준 역시 감소하 였음을 확인하였다. 특히 MYB115는 포플러 TT8과 결합하는 것 을 확인하였으며, 이들 전사인자들을 포플라 TTG1과 함께 과 발현 시킨 결과 PA의 합성에 관여하는 ANR1과 LAR3 유전자의 발현 이 현저하게 증가하였다고 하였다. 흥미로운 사실은 PA가 증가된 형질전환체는 곰팡이 병원균(Dothiorella gregaria)에 저항성을 보인 반면에 PA가 감소한 knock out 유전자교정 식물체는 감수성 을 보였다. 이러한 연구결과는 100종 이상의 유전자군으로 구성된 MYB 전사인자의 복잡한 유전자 기능을 분석하기 위하여 유전자 교정 기술이 얼마나 유용하게 사용될 수 있는지에 대한 연구결과이 며 추후, 보다 많은 연구결과가 축적되면 이들 MYB 유전자군의 기능 분석과 함께 복잡한 flavonoid 및 anthocyanin 화합물의 생합 성 대사공학기술의 발판이 마련될 것이다.

    Yang et al. (2017)은 포플러에서 PtoMYB156을 암호 하는 유전자를 과 발현시킨 경우 phenol 화합물과 flavonoid 화합물의 감소와 함께 물관부 섬유소로 이루어진 2차 세포벽의 형성이 현저 하게 감소하였으며 이러한 결과는 phenylpropanoid 생합성 대사 과정에 관여하는 효소들을 암호 하는 유전자들(CESA17, C4H2 and GT43B)의 발현수준의 뚜렷한 감소와 일치하였다. 반면에 이 유전자들을 CRISPR 시스템으로 knock out 시킨 결과 lignin, xylan, cellulose등이 축적되는 것을 확인하여 PtoMYB156 전사인 자는 phenylpropanoid 생합성 대사과정을 억제하는 인자임을 확 인하였다.

    Albert et al. (2018)은 우산이끼(Marchantia polymorpha)의 MYB 전사인자(MpMyb14)의 기능 분석을 위하여 CRISPR 시스 템을 적용하여 knock out 돌여변이체를 확보한 후 전사체 및 대사 체 분석연구를 동시에 수행하였다. 그 결과 Mpmyb14 유전자의 돌연변이에 의하여 knock out된 계통은 적색이 사라지게 되었음을 확인하였으며 이는 riccionidin A 등을 포함한 flavone 화합물의 생합성이 저해된 결과임을 확인하였다. 이러한 연구결과는 진화론 적으로 육상식물 중 수생식물과 가장 가까운 근연종으로 알려진 우산이끼가 애기장대, 옥수수, 콩 등에 비하여 현저하게 적은 단지 2종의 MYB 유전자만 존재하는지에 대한 진화론적 의문점을 밝히 는 단서를 제공하고 있다.

    Xu et al. (2019)은 당근의 DcMYB113-like 유전자와 DcPDS에 대하여 CRISPR 시스템을 이용하여 knock out을 시도하였다. 그 결과, 오랜지색 당근(Daucus carota, cv. Kurodagosun)의 DcPDS 유전자를 knock out 시킨 경우, albino 표현형이 나타난 것을 확인 하였다. 그리고 자주색 당근(Daucus carota, cv. Deep purple)의 DcMYB113-like 유전자를 knock out 시킨 경우, 자주색이 사라진 것을 확인하였다. 이들에 대한 염기서열분석 결과를 비교하여 본 결과 삽입, 결실, 치환 등이 일어난 것을 확인하였으며 DcMYB113-like 유전자는 phenylpropanoid 대사과정을 거쳐 자주색을 갖는 flavonoid 화합물의 생합성 대사를 촉진하는 활성인자임을 확인하였다.

    이상의 연구결과들을 종합하여 보면, 유전자 교정기술을 이용한 식물의 phenylpropanoid 생합성 대사공학기술은 아직 시작 단계 수준으로 콩, 당근, 토마토, 포플라, 석류, 화훼작물 등 일부 작물에 한정되어 있다. 화훼작물과 같이 표현형을 쉽게 구분할 수 있는 작물에 대한 연구결과들이 일부 성공적인 것으로 보고되었으나, 우리나라와 아시아권에서 중요하게 취급되는 약용작물을 이용한 연구결과는 단삼에 관한 단 1건의 연구결과만 조사되었다. 따라서. 약용작물의 대사공학기술의 활성화를 위한 투자와 연구역량을 극 대화할 수 있는 컨소시엄 구성 등이 필요한 것으로 조사되었다. 또한, 아직은 유전자교정기술을 이용한 유전자의 기능 분석연구에 치중되어 있으며, 특히 phenylpropanoid 대사과정의 전반적인 조 절 역할을 하는 MYB 전사인자의 경우에는 다양한 그룹과 수 백 종에 달하는 다양한 유전자로 구성된 유전자군으로 존재하기 때문 에 앞으로 상당한 기간에 걸쳐 이들의 기능 분석 연구가 선행되어 야 할 것으로 조사되었다.

    감사의 글

    이 논문은 2020년도 경남과학기술대학교 교원 연구활성화 지원 사업의 예산지원으로 수행되었음

    Figure

    Table

    List of metabolic engineering for the accumulation of a specific phytochemicals through the gene editing of genes involved in their biosynthetic pathways

    List of metabolic engineering for the phenylpropanoid pathway through the gene editing of MYB gene family encoding transcription factor involved in the regulation for the accumulation of diverse phenylpropanoid compounds

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