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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.54 No.4 pp.75-83
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2020.54.4.75

Development of a New Microsatellite Markers for Individual Identification and Paternity Evaluation in Hanwoo

Hye-Ran Kim1†, Ji-Woong Lee3†, Min-Jung Go2, Jong-Eun Park2, Min-Ji Kim1, Youl-Chang Baek1, Seol-Hwa Park1, Da-Jeong Lim2, Sung-Dae Lee1, Bong-Hwan Choi2*
1Animal Nutrition and Physiology Team, National institute of
Animal Science, R.D.A, Wanju, 55365, Korea
2Animal Genomics and Bioinformatics Division, National institute
of Animal Science, R.D.A, Wanju, 55365, Korea
3Devision of Animal Science, Institute of Agricultural Science
and Technology, Chonnam National University, Gwangju, 61186,
Korea

These authors contributed equally to this work.


*Corresponding author: Bong-Hwan Choi Tel:
+82-63-238-7304 Fax: +82-63-238-7347 E-mail:
bhchoi@korea.kr
May 4, 2020 June 29, 2020 July 20, 2020

Abstract


The generally used eleven Di-nucleotide repeat microsatellite markers cause
‘stutter', which makes it difficult to estimate the accurate allele size. This
study was conducted to solve this problem and to propose new thirteen
microsatellite markers (BTRC6_01, BTRC19_02, BTRC11_03, BTRC16_05, BTRC9_07,
BPC19_08, BTEC17_09, BPC21_10, BTEC4_11, BPC7_12, BPC1_13, BHXC29_14, BPC1_15)
composed of tri-, tetra-, penta-, and hexa-nucleotide repeat microsatellite loci
as genetic parameters for Hanwoo discrimination and genetic diversity analysis.
After testing on 1530 cattle with 13 tested microsatellite loci, a total of 61
alleles were detected and the mean number of alleles per locus was 4.69. The
Polymorphism Information Contents (PIC) ranged from
0.25(BTRC9_07) to 0.59(BTEC17_09). Since BHXC29_14, BPC1_13, BTEC17_09,
BTRC16_05, BTRC19_02, and BTRC6_01 were highly
informative(PIC>0.5) and the rest of the loci were reasonably
informative (PIC>0.25), the thirteen loci are considered to
have enough polymorphism for bovine identification. Heterozygosity and
FIS (inbreeding coefficient) value in all cattle population
of 2 local brand Hanwoo (Yeongam Hanwoo;YH and Jangheung;JH) and 7 breeds of
European cattle (Brown Swiss;BS, Limousin;LM, Angus;AG, Simmental;SM,
Hereford;HF, Charolais;CH and Holstein;HT) were calculated to identify genetic
diversity and characteristics of Hanwoo. The expected heterozygosity of Hanwoo
was 0.532(YH) and 0.545(JH), compared to 0.451(BS)~0.605(AG). Phylogenetic
analysis among Hanwoo and 7 breeds of European cattle was conducted by
estimating Nei's genetic distance based on specific allele frequencies. Among
other European breeds, SM showed the closest genetic distance (0.1848) to
Hanwoo.



한우 개체식별 및 친자감정을 위한 새로운 초위성체 마커 개발

김 혜란1†, 이 지웅3†, 고 민정2, 박 종은2, 김 민지1, 백 열창1, 박 설화1, 임 다정2, 이 성대1, 최 봉환2*
1농촌진흥청 국립축산과학원 영양생리팀
2농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과
3전남대학교 농업생명과학대학 동물자원학부

초록


본 연구는 한우 개체식별 및 친자감별에 있어 기존의 di-nucleotide repeat microsatellite marker 사용 시 발생했던
stutter로 인한 대립유전자 판별 오류 등의 문제들을 극복하고, 분석결과의 신뢰도와 정확도를 높이기 위해 tri-, tetra-,
penta-, hexa-nucleotide repeat microsatellite 좌위들로 이루어진 새로운 개체식별 마커 13
종(BTRC6_01, BTRC19_02, BTRC11_03, BTRC16_05, BTRC9_07, BPC19_08, BTEC17_09,
BPC21_10, BTEC4_11, BPC7_12, BPC1_13, BHXC29_14, BPC1_15)을 개발하였다. 선발된 13개의 좌위를
가지고 소 1,530두에 microsatellite typing을 실시한 결과, 총 61개에 대립유전자가 발견되었으며, 좌위별로 평균
4.69개의 대립유전자를 가지는 것으로 확인되었다. 마커의 다형성과 정보력의 척도인 PIC (Polymorphism Information
Contents)값은 0.25(BTRC9_07)~0.59(BTEC17_09)로 나타났으며 BHXC29_14, BPC1_13, BTEC17_09,
BTRC16_05, BTRC19_02, BTRC6_01 좌위들은 PIC 0.5 이상 그리고 나머지 좌위들 모두
PIC 0.25 이상의 값을 가지는 것으로 확인되어 마커로서 다형성이 있음이 검증되었다. 개발한 마커를 활용하여 한우(영암, 장흥)와 유럽우
7종 (Brown Swiss, Limousin, Angus, Simmental, Hereford, Charolais, Holstein)의 유전적
특성을 분석하였으며, 총 9개 집단의 Heterozygosity와 FIS (inbreeding
coefficient) 값을 측정하였다. 기대이형접합율은 0.451(BS)~0.605(AG) 범위 내로, 한우는 0.532(영암),
0.545(장흥)의 값을 가지는 것으로 나타났다. 한우(영암, 한우)와 7종의 유럽우들 간의 유연관계 분석은 특정 대립유전자 빈도를 근거로 한
유전적 거리의 추정으로 이루어졌다. 한우집단과 Simmental 간의 유전적 거리(0.1848)가 가장 가깝고 비교적으로 Brown
Swiss와의 유전적 분포(0.3352)가 가장 먼 것으로 나타났으며, 계통발생학적으로 유전적 분화 양상을 확인함으로써 본 마커의 한우 유전적
다양성 및 유연관계 분석에 활용 가능성을 제시하였다.



    Rural Development Administration
    PJ01098001

    서론

    국내 축산물시장의 개방으로 저가의 수입육이 유입됨에 따라 한우의 경쟁력을 제고시키기 위한 국산 축산물의 차별화된 판매 전략이 촉구되고 있다. 이에 따라 국내 산업에서는 한우(Hanwoo) 육질 고급화를 통한 한우 고유 브랜드를 육성하기 위한 노력을 기울이고 있다. 그러나 고급육 생산을 위해 한우 비육기간이 장기 화되면서 생산비가 증가함에 따라 수입육과의 가격 편차가 심화되 었으며, 이로 인해 수입소를 국내산 쇠고기로 둔갑시켜 불법으로 유통하는 사례들이 발생하자 쇠고기 원산지에 대한 소비자들의 불 신과 식품 안전성에 대한 우려가 높아지게 되었다. 이에 국내 한우 사업에서는 소비자의 신뢰도를 제고시키기 위해 2006년부터 소의 생산, 도축, 가공, 유통 등 일련의 과정을 기록하고, 소에게 개체식 별번호를 부여하여 이표 및 전자칩을 통해 개체정보를 확인하게 함으로써 문제 발생 시에 신속하게 원인규명 하는 쇠고기이력제를 시행해 왔으나(Lee, 2007), 이표 및 전자칩의 탈락 또는 고의적인 위․변조가 가능한 점 등의 한계로 인해 정확한 원산지 파악에 어려 움이 있었다. 이러한 문제점들을 해결하기 DNA marker를 활용하 여 과학적이고 체계적으로 한우의 개체를 식별하고 국내 한우와 수입소를 구별하는 방법이 활용되고 있다. 또한 보증씨수소 및 씨 암소를 통한 육량, 육질 개량은 한우 산업에 있어 매우 중요한 요소 로서(Kim et al., 2019) 체계적이고 효율적인 번식우 관리와 개량 을 위한 기초 자료 확보가 중요한 것으로 여겨지는데(Kwon et al., 2019) 이에, 번식우와 송아지의 개체정보 관리와 친자관계를 구명을 통해 개량 효과를 높일 수 있을 것으로 기대된다.

    DNA marker는 개체식별, 친자감정 및 집단의 유연관계를 분석 하는 도구로, 그 중에서도 microsatellite marker는 가장 성공적이 고 효율적인 수단으로 널리 이용되고 있다(Fernandez et al., 2013). Microsatellite는 1~6개의 짧은 염기단위(motif)들이 반복 되어 있는 구간으로, DNA 복제과정 중 임의로 발생하는 slippage 돌연변이 현상에 의해 반복 길이의 증가나 감소가 일어나 높은 다형성(polymorphism)을 가지는 특징이 있다(Tautz, 1989). 때문 에 법의학분야에서 개체 식별을 위한 DNA fingerprinting 기법으 로 활용되며, 그 변이가 다음세대에게 안정적으로 전달되기 때문에 친자감별, 혈통분석(pedigree analysis) 및 genetic mapping 등 종간의 유전적 다양성 분석을 통한 집단유전학 및 계통분류 연구에 도 널리 활용되고 있다(Delgado et al., 2011). 1990년대부터 소과 동물의 microsatellite loci에 대한 연구가 시작된 이래로(Barendse et al., 1993), 소의 개체식별 및 연관지도 연구를 위해 많은 marker 들이 제안되었으며(van de Goor et al., 2009), 국내에서도 국제동 물유전학회(ISAG)에서 제안한 12개의 microsatellite marker를 활용하여 한우 산업에 개체식별 및 친자감별 시스템을 구축하고 있다(Yoon et al., 2005a;Lee et al., 2008).

    현재 다형성과 식별력이 높은 Di-nucleotide repeat marker를 개체식별에 활용하고 있으나, 사용함에 있어 많은 문제들이 보고되 고 있다. 특히 multiplex-PCR 과정 중 발생하는 slippage 돌연변 이로 생겨난, 실제 단편의 길이보다 1bp이상 짧은 stutter라는 단편 들이 정확한 대립유전자 형을 판독하는 데에 큰 어려움을 주고 있다(Chamber & MacAvoy, 2000;Sim et al., 2013). stutter의 존재는 연구자의 실험수행 능력이나 PCR 증폭효율에 따라서 분석 결과의 차이를 야기하여 개체식별이나 친자감별 결과에 대한 신뢰 도를 떨어트릴 위험이 있다. 이에 반해 tri-, tetra-, penta-nucleotide repeat의 경우 염기단위(motif)의 수가 많아 다형성은 적으나, slippage 현상이 발생할 확률이 낮고 stutter의 검출 강도 또한 실제 대립유전자의 1~15%이하로 현저히 낮아 대립유전자의 크기를 판 단하기 수월하여 분석결과의 정확도를 높일 수 있다는 장점이 있다 (Bacher et al., 1998). 따라서 분석 오류를 줄이고 정확하고 체계적 인 개체식별 및 친자감별 시스템을 구축하기 위해서는 di-nucleotide repeat 대신 tri-, tetra-, penta-, hexa-repeat microsatellite loci를 유전적 마커로 사용하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.

    본 연구는 원산지 위조 쇠고기의 불법유통을 근절 및 친자일치 를 통한 한우 개량효과의 극대화를 위한 한우의 체계적인 개체식별 및 친자감별 시스템 구축에 있어 기존의 di-nucleotide microsatellite marker의 문제점 인지함으로써, 이를 보완하기 위한 새로 운 tri-, tetra-, penta-, hexa-nucleotide repeat microsatellite marker를 개발하였으며 다형성 분석을 통해 개체식별 마커로서 법과학 적으로 적합성을 입증하였다. 또한 개발한 마커를 활용하여 한우와 유럽우 간의 유전적 근연관계 및 한우의 유전적 특징(차별성)에 대해 분석을 실시하였으며 genetic mapping 등 종간의 유전적 다 양성 분석을 통한 집단유전학 및 계통분류 연구에서도 활용 가능성 을 제시하였다.

    재료 및 방법

    1. 공시 재료 및 DNA 추출

    본 연구의 공시재료는 농촌진흥청 국립축산과학원에서 제공한 유럽우 7종(BS; 19, LM; 20, AG; 18, SM; 15, HF; 21, CH; 12, HT; 10)과 국내 영암, 장흥 지역의 한우(YH; 301, JH; 1,114) 총 1,530두를 사용하였다.

    Wizard Gemonic DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 혈액 3ml으로부터 genomic DNA를 추출하였으며 추출 된 DNA는 Nanodrop Spectrometer를 이용하여 260nm~280nm 에서 흡광도를 측정하여 농도와 순도를 확인하였다.

    2. Microsatellite marker 제작

    NGS Database를 기반으로 한 Tandem repeat Finder (Benson, 1999) 프로그램을 이용하여 tri-, tetra-, penta-, hexa-nucleotide repeat microsatellite loci를 발굴하였으며 이를 Primer3 plus를 통해 primer로 제작하였다. 후보 좌위들은 single PCR 및 전기 영동을 통해 1차적인 선별작업을 거쳤으며, 후에 multiplex PCR 을 통해 다형성과 증폭 안정성이 입증된 좌위들만을 선별하여 최종 13개의 좌위들을 선발하였다. 선발된 좌위들은 단편의 증폭 크기 와 좌위들 간의 호응도를 고려하여 5’말단 형광표지(FAM, VIC, NED, PET) primer로 제작하였다.

    3. Multiplex PCR 수행 및 genotyping

    Template DNA (20ng/ul) 4ul에 13종의 Primer (Foward/Reverse, 10pm/ul)를 각각 0.3ul씩 분주하고 10x reaction Buffer (GenetBio, Korea) 3ul, 10m dNTP (GenetBio, Korea) 2.4ul, HS Tag polymerase 1.8ul 첨가 후, 총 용량 20ul이 되도록 증류수를 추가하였 다. GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)기 기를 이용하여 Multiplex PCR을 수행하였으며 PCR 조건은 다음과 같다. pre-denaturation(1cycle); 95℃/15min → 1phase(9cycle); 94℃/1min-60℃/1min-72℃/1min → 2phase(5cycle); 94℃/1min -59℃/1min-72℃/1min → 3phase(25cycle); 94℃/1min-58℃/1min -72℃/1min. 마지막으로 65℃/30min 반응시켰다. PCR 산물을 1:80 비율로 희석시킨 후 1ul을 PCR 96 well plate에 분주하고 Hi-Di™ Formamide(Applied Biosystems, USA)와 size standard( GeneScan™ 500 LIZ®; Applied Biosystems, USA) 100:1 비율로 혼합한 mixture 9ul를 첨가하여 총 10ul의 반응물이 되도 록 맞춘 후, Septa로 PCR plate를 sealing하여 95℃에서 5분간 denaturation 시켰다. 반응이 끝난 plate를 바로 얼음에 chilling하 여 자동염기서열분석장치 ABI 3730xl genetic analyzer(Applied Biosystems, USA)으로 모세관 전기영동을 수행한 뒤 GeneMapper v.3.0 software(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 대립유전 자형을 판독하였다.

    4. 통계분석

    Microsatellite Toolkit software (Park, 2000)를 통한 통계분석 을 실시하여 locus 별 대립유전자의 수와 대립유전자 빈도(allele frequency) 그리고 PIC(Polymorphism Information Content)를 산출하였다. 또한 FSTAT v.2.9.3. program을 이용하여 집단 및 locus 별 관측이형접합률(Observed heterozygosity) 기대이형접 합율(Expected heterozygosity), 유전자 분화정도(Gst)를 구하였 고 Weir & Cockerham(1984)의 방식을 통한 F-검정을 실시하여 FIS을 계산하였다.

    H e t E = 1 ( i = 1 n P i 2 ) P I C υ a l u e = 1 ( i = 1 n P i 2 ) i = 1 n = 1 P i 2 i = i + 1 n 2 P i 2 P j 2

    • n : 대립유전자의 수, i · Pj : i 번째와 j 번째 대립유전자의 빈도, HetE : 기대되는 이형접합율(expected heterozygosity), PIC : 유전적 다형성 정보량

    집단 간 유연관계 분석을 위해 Nei et al.(1983)의 방법을 근거 로 한 DISPAN package(Ota, 1993)를 이용하여 Da genetic distance를 추정하였고, Neighbor-Joining method(Saitou & Nei, 1987)를 통해 집단 간의 유전적 거리를 근거로 한 phylogenetic tree를 작성하였다.

    결과

    1. MS Toolkit 분석을 통한 tri-, tetra-, penta-, hexanucleotide repeat microsatellite marker의 유용성 검사

    NGS database 기반의 Tandem Repeats Finder software (Benson, 1999)로 다형성이 높을 것으로 예상되는 tri-, tetra-, penta-, hexanucleotide repeat microsatellite loci들을 발굴한 뒤, 스크리닝을 통해 최종 BTRC6_01, BTRC19_02, BTRC11_03, BTRC16_05, BTRC9_07, BPC19_08, BTEC17_09, BPC21_10, BTEC4_11, BPC7_12, BPC1_13, BHXC29_14, BPC1_15 총 13종의 마커를 선발하였다(Table 1). 선발된 마커는 한우집단인 영암한우(YH) 301두 장흥한우(JH) 1,114두 및 타품종 Brown Swiss (BS) 19두, Limousin (LM) 20두, Angus (AG) 18두, Simmental (SM) 15두, Hereford (HF) 21두, Charolais (CH) 12두 그리고 Holstein (HT) 10두, 총 1,530 두를 대상으로 multiplex PCR과 모세관 전기영동 및 GeneMapper v.3.0를 통해 대립유전자 양상과 결과를 확인하였으며, Ms Toolkit software(Park et al. 2000)를 사용해 마커별 대립유전자(allele) 빈 도와 관찰 이형접합도(Observed Heterozygosity), 기대 이형접합도 (Expected Hetrozygosity) 및 PIC (Polymorphism Information Content)를 측정하여 개체식별 및 친자감별 마커로서 사용 적합성 에 대해 판단하고자 하였다.

    13종의 microsatellite loci에서 총 61개의 대립유전자(allele)가 발 견되었으며 평균 4.69개의 대립유전자로 모든 마커가 3개 이상의 대립 유전자를 가지는 것으로 확인되었다. FSTAT v.2.9.3.를 이용하여 산 출된 locus 별 이형접합율 및 분화도를 표로 제시하였으며, 집단내 기대 이형접합율(Hs)은 0.295(BTRC9_07)~0.662(BHXC29_14), 관 측이형접합율(Ho)은 0.123(BTRC9_07)~0.681(BTEC17_09)을 보였으며, 유전적 분화정도를 나타내는 유전자좌위별 변이도(Gst; coefficient of gene differentiation)는 평균 0.103에 0.382 (BTRC9 _07)~0.034(BTRC11_03) 분포를 나타내었다(Table 2).

    한우집단(YH, JH)에서 PIC는 BTEC17_09(0.71)가 가장 높았 고 그 외에도 BHXC29_14, BPC1_13, BPC19_08, BPC21_10, BTEC4_11, BTRC19_02가 평균 0.5이상 PIC값을 가졌으며, 나 머지 마커들은 0.25~0.5 사이의 PIC 수치를 기록했다. 타품종을 포함한 9개 집단의 평균을 보았을 때 BHXC29_14, BPC1_13, BTEC17_09, BTRC16_05, BTRC19_02, BTRC6_01는 0.5 이 상의 PIC값을 가지는 것으로 확인되었으며 BTRC9_07(0.25)는 가장 낮은 값을 보였다(Table 3).

    2. 한우 유전적 특성 및 외래 품종간의 유연관계 분석

    한우의 유전적 구조 및 다양성 분석의 결과는 Table 4, 5에 나타 내었다. 한우의 유전적 다양성에 대해 파악하기 위해 전체 집단에 대한 집단별 대립유전자의 수 및 이형접합율을 FSTAT v.2.9.3.를 이용하여 산출하였다. 대립유전자 수는 4.15(JH)~2.62(HT)를 가 지는 것으로 나타났고 기대이형접합율은 평균 0.527에서 최저 0.451(BS)에서 최고 0.605(AG)의 수치를 보였다(Table 4).

    Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE)에 준한 기대이형접합율 보다 실제로 관찰되는 관측이형접합율이 높은 경우 이형접합체초 과(heterozygote excess)라고 하며 이때 Fis 값은 음의 값을 지닌 다. Table 5에는 집단별, 좌위별 근친교배계수(Fis)가 제시되었다. 좌위별 Fis값은-0.035(BTEC17_09)~0.378(BTRC9_07)이 나타 났으며 그 중 Fis값이 0 이하인 좌위들은 BPC1_13, BPC19_08, BPC21_10, BPC7_12, BTEC17_09, BTRC16_05, BTRC19_02 이 발견되었다.

    한우와 타품종 간의 유연관계를 알아보기 위해 한우 집단 YH (30), JH(30) 및 7종의 유럽우 BS(19), LM(20), AG(18), SM (15), HF(21), CH(12) 총 175두를 대상으로 하여 분석을 실시하 였다. MS toolkit software 분석에서 구해진 Da genetic distance matrix를 DISPAN 프로그램에 도입하여 유전적 거리를 계산하여 이를 근거로 Neighbor-Joining method를 통한 Phylogenetic tree 를 작성하였다.

    한우와 유럽우 7종과의 유전적 근연관계를 나타내는 NJ Phylogenetic trees는 Fig. 1에 제시되었으며, 계통발생학적으로 유연관계를 분석 할 때 신뢰도(degree of confidence)를 나타내는 bootstrap values 는 1,000회의 반복 실험을 통해 백분율로서 각 cluster의 꼭짓점에 표기되었다. 한우집단(YH, JH)의 유전적 거리는 0.006으로 유전적 으로 거의 차이가 없었으며 유럽우에서는 SM이 0.1848로 한우집단 과 가장 유전적 거리가 가까웠다. 그에 비해 BS는 한우집단과의 유전적 거리 평균 0.3352로 가장 먼 것으로 나타났다(Table 6).

    고찰

    기존의 한우 개체식별 및 친자감별 체계에서 11종의 di-nucleotide repeat microsatellite marker (BM2113, EHT10, SPS115, TGLA227, TGLA53, BM1824, ETH225, ETH3, INRA23, TGLA122, TGLA126)를 사용하였을 때 발생되는 stutter 현상 및 2bp로 인접 한 대립유전자 분포로 인한 정확하고 신속한 대립유전자형 판별의 어려움 등의 문제를 해결하기 위해 새로운 tri-, tetra-, penta-, hexanucleotide repeat microsatellite marker들을 개발하였으며 새롭 게 개발한 마커들을 활용하여 실제적인 genotyping 및 통계분석을 시도함으로서 선발한 좌위들의 다형성(polymorphism) 검증 및 법 과학적 유의성에 대해 판단하였다.

    선발한 microsatellite 좌위들을 본 실험에 적용한 결과, 기존의 Di-nucleotide repeats비교 하였을때 다형성은 적었으나 대립유전자 분포 지역의 겹침이 없어 좌위들을 확연하게 구분할 수 있었으며, stutter 발생이 현저히 적을 뿐만 아니라 비정상적인 peak 및 특별한 문제점이 발견되지 않아 전체적으로 대립유전자 판별이 용이하였다. 좌위별 대립유전자의 수는 최소 3개(BTRC11_03, BTRC9_07)에 서 최대 7개(BPC21_10)로 전체적으로 3개 이상의 대립유전자 수 를 가지고 있는 것이 확인되었다. 특히 microsatellite 좌위의 다형성 을 평가하는 척도로써 PIC (Polymorphism Information Contents) 가 주로 이용되는데 PIC 값이 0.50이상인 경우 다형성이 매우 높 은 것으로 효율성이 높은 마커로(highly informative) 여겨지며, 0.25~0.50사이일 경우 사용하기에 적합한 마커로(reasonably informative), 0.25미만의 PIC값을 가지는 좌위는 정보력이 거의 없 는 마커로(slightly informative) 판단된다(Botstein et al., 1980). 전체 9개 집단을 대상으로 실험된 13종의 좌위들 중 PIC 0.50이상인 좌위는 총 6개(BHXC29_14, BPC1_13, BTEC17_09, BTRC16_05, BTRC19_02, BTRC6_01)로 다형성이 매우 높은 것으로 확인되 었고 그 외에 좌위들 역시 PIC 0.25~0.50사이의 값들을 지니고 있으므로 충분한 정보력 가지고 있어 13개의 microsatellite 좌위 모두 개체를 식별하기에 적합한 것으로 사료된다.

    앞서 검증한 13개의 microsatellite marker를 활용하여 한우(영암, 장흥 한우) 2종과 타품종 7종(Brown Swiss, Limousine, Angus, Simmental, Hereford, Charolais, Holstein)의 계통 연구 및 개체 별 유전적 분화도 측정을 통한 유연관계 분석에 활용하였으며 이를 통해 한우 유전적 다양성을 구명하였다.

    Barker et al.(1994)은 microsatellite marker를 이용하여 집단 의 유전적 거리(genetic distance)를 추정할 때 오류(standard error) 를 줄이기 위해서는 대립유전자의 수가 최소 4개 이상일 것을 제안하였다(Chung et al., 2006). 연구결과 한우집단(YH, JH)에 서는 대립유전자의 수가 4.08, 4.15로 나타났으나, 유럽우 집단은 4개 이하인 것으로 나타났다. 이는 유럽종 시료를 구하기 어려운 이유로 실험에 이용된 집단의 크기가 작은 것에 기인한 것으로 보이며 특히 샘플의 수가 20두 이하인 Charolais나 Holstein 집단 의 대립유전자 수가 한우집단에 비해 현저히 낮은 것을 확인할 수 있었다. 추후 연구에서는 유전적 거리 추정의 오류를 줄이고 좀 더 정확한 결과를 얻기 위해 유럽우 집단의 크기를 늘려서 실험 해야 할 것으로 보인다. 일반적으로 유전적다양성을 분석하는데 있어 마커로 사용하기 위해서는 이형접합율이 0.3~0.8를 충족되어 야 하는데(Takezaki & Nei, 1996), 본 연구에서는 전체 집단에 대한 기대이형접합율의 수치가 0.451~0.605로 나타나 Takezaki & Nei (1996)이 제시한 조건에 충족하므로 다양성분석에 있어 유용한 marker임이 검증되었다. 한우집단의 기대 이형접합율은 0.532(YH), 0.545(JH)로 전체 9집단의 평균 0.527보다는 높아 타 집단에 비해 상대적으로 다양성이 높은 것으로 볼 수 있다.

    FIS 수치의 계산은 실제 관측된 이형접합율(Observed Heterozygosity) 이 유전적 평형상태에서 기대되는 이형접합율(Expected Hetrozygosity) 을 얼마나 초과하는지 측정함으로써 이루어지는데 기대이형접합율보 다 관측이형접합율이 클 경우(Heterozygote excess) FIS (inbreeding coefficient) 값은 0보다 작으며 이는 집단 내 근친도(inbreeding coefficient)가 낮다는 것을 뜻한다. 전체 9집단에 대하여 F-검정을 실시하였을 때 한우 두 집단의 경우 FIS이 각 0.019(YH), 0.029(JH) 로 0보다 큰 값을 가지는 것으로 관찰되었는데 이는 소수의 씨수소 (KPN)만을 이용하여 인위적 교배를 실시하고 있는 우리나라의 개 량체계 특성으로 인해 한우의 근친도가 높게 나타난 것으로 보인다.

    집단 간 좌위별 특정 대립유전자 빈도를 근거로 하여 allele sharing distance를 추정한 결과 한우(YH, JH)와 유럽품종(Brown Swiss, Limousin, Angus, Simmental, Hereford, Charolais, Holstein) 간의 유전적거리를 추정하였다. 한우 집단(YH, JH)은 European Bos taurus 집단들과 확연하게 구분되었으며, Simmental(0.1848, 0.1647)과 유전적으로 가장 가깝고 Brown Swiss, Angus 및 Hereford 집단들은 일찍이 분화되어 특히 Brown Swiss(0.3352) 와의 유전적거리가 먼 것으로 나타났다. 이는 Yoon et al.(2005b) 의 연구에서 ISAG 권장 di-nucleotide 마커 11종을 이용하여 한우 와 European Bos taurus; Angus, Holstein, Charolais, Limousin, Hereford 5품종을 포함한 외래 품종간의 유연관계를 분석한 결과 와 같이, 5품종 중 한우와 Charolais의 유전적거리가 가장 가까우며 Phylogenetic tree에서 Holstein, Angus 및 Charolais, Limousin 의 군집 형성 양상이 유사한 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 개발한 마커가 한우와 외래 품종간의 유전적 근연관계를 분석하는 데에 활용 가능성이 있음을 시사하였다.

    감사의 글

    본 연구는 농촌진흥청 연구사업(세부과제명: 한우의 핵 및 미토 콘드리아 DNA 변이체 발굴과 유전자 상호 작용 연구, 세부과제번 호: PJ01098001)의 지원에 의해 이루어진 것임

    Figure

    JALS-54-4-75_F1.gif

    NJ Phylogenetic trees showing the genetic relationships among 9 cattle populations based on DA genetic distance. The numbers indicate bootstrap values in percentage after 1,000 resampling. YH: Yeongam Hanwoo, JH: Jangheung Hanwoo, BS: Brown Swiss, LM: Limousin, AG: Angus, SM: Simmental, HF: Hereford, CH: Charolais, HT: Holstein.

    Table

    List of microsatellite markers

    Number of allele and allele range(bp) and Nei's estimation of heterozygosity for 13 microsatellite markers. Expected within-population heterozygosity(Hs), Observed heterozygosity(Ho) and Coefficient of gene differentiation(Gst)

    Polymorphic information content(PIC) value of 13 microsatellite loci in 9 beef cattle populations

    aYH: Yeongam Hanwoo, JH: Jangheung, BS: Brown Swiss, LM: Limousin, AG: Angus, SM: Simmental, HF: Hereford, CH: Charolais, and HT: Holstein.

    Genetic diversity; Sample size, number of allele, Expected Heterozygosity(Exp Hz), and Observed Heterozygosity(Obs Hz) in 9 beef cattle populations

    F-statistic for inbreeding estimates within-population inbreeding coefficient(FIS) in 9 beef cattle populations

    *<i>p</i><0.05. NA, Not available.

    DA genetic distance matrix estimated from the frequencies of 13 microsatellite loci among the 9 beef cattle populations

    YH: Yeongam Hanwoo, JH: Jangheung Hanwoo, BS: Brown Swiss, LM: Limousin, AG: Angus, SM: Simmental, HF: Hereford, CH: Charolais, and HT: Holstein

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