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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.54 No.1 pp.61-70
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2020.54.1.61

Neuroglial Cells Activation and Inflammatory Factors Increase by Lipopolysaccharide Treatment in Adult Mouse Hippocampus

Ju-Bin Kang1, Dong-Ju Park1, Phil-Ok Koh1,2*
1Department of Veterinary Medicine, College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, jinju-daero 501, Jinju 52828, South Korea
2Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, jinju-daero 501, Jinju 52828, South Korea
Corresponding author: Phil-Ok Koh Tel: 82-55-772-2354 Fax: 82-55-772-2349 E-mail: pokoh@gnu.ac.kr
February 4, 2020 February 18, 2020 February 20, 2020

Abstract


Lipopolysaccharide (LPS) is the endotoxin of Gram-negative bacteria that stimulates inflammatory cytokine release and induces inflammation. In the present study, we investigated whether LPS regulates neuroglial cell activation and nuclear factor kappa B (NF-κB)-related inflammatory factors in the hippocampus. Adult male mice were randomly grouped as control animals and LPS-treated animals. Mice were intraperitoneally injected with vehicle or LPS (250 μg/kg) for 5 days and body weight was measured. Reactive oxygen species and lipid peroxidation levels in the hippocampus were analyzed. Hematoxylin and eosin staining was performed for the morphological study. Western blot analysis and immunofluorescence staining were carried out to examine the expression of ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1), glial fibrillary acidic protein (GFAP), NF-κB, interleukin-1β (IL-1β), and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the hippocampus. Body weight was reduced in LPS-treated animals. LPS treatment induced increases in reactive oxygen species and lipid peroxidation levels. We confirmed severe histopathological changes in the hippocampi of LPS-treated animals. We also observed that LPS treatment increases Iba-1 and GFAP expression levels. Iba-1 and GFAP are used as markers of microglia and astrocyte activation, respectively. Moreover, LPS administration increased NF-κB expression and up-regulated pro-inflammatory factors, including IL-1β and TNF-α. These results indicate that LPS promotes an inflammatory response and leads to hippocampal damage. Thus, we demonstrated that LPS induces neuroglial cells activation and increases NF-κB-mediated inflammatory factors in the hippocampus. In conclusion, our findings suggest that LPS leads to neurotoxicity by up-regulating oxidative stress and activating inflammatory factors in the hippocampus.



생쥐 해마조직에서 lipopolysaccharide의 투여에 의한 신경아교세포 활성화 및 염증인자 증가

강 주빈1, 박 동주1, 고 필옥1,2*
1경상대학교 수의과대학 수의학과
2경상대학교 농업생명과학연구원

초록


Lipopolysaccharide (LPS)는 염증유발 cytokine 분비를 자극하고 염증을 유발하는 그람음성균의 내독소이다. 본 연구에서는 LPS가 신경아교세포 활성과 해마에 있는 nuclear factor kappa B (NF-κB) 매개 염증유발 요소를 조절하는지를 조사하였다. 성체 수컷 쥐를 대조군과 LPS를 투여한 실험군으로 무작위로 나누어 vehicle 또는 LPS (250 μg/kg)를 5일 동안 복강투여하고 무게를 측정했다. 해마의 활성산소와 과산화지방질 수준을 분석하고, 형태학적 연구를 위해 Hematoxylin and eosin 염색을 시행하였다. 또한, 해마에서 ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1), glial fibrillary acidic protein (GFAP), NF-κB, interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α)의 발현을 확인하기 위해 Western blot 분석과 immunofluorescence 염색을 시행하였다. 그 결과, LPS를 투여한 쥐들의 체중이 감소하였다. LPS 투여는 활성산소와 과산화지방질 수준의 증가를 유발하였고 LPS를 투여한 쥐의 해마에서 심각한 조직병리학적 변화를 확인했다. 또한 LPS 투여는 신경교세포와 별아교세포의 표시물인 Iba-1과 GFAP의 발현을 증가시켰고, NF-κB의 발현과 IL-1β와 TNF-α와 같은 염증성인자의 발현을 증가시켰다. 이러한 결과들을 통해 LPS 투여는 해마손상과 염증반응을 유도한다는 것을 알 수 있고 LPS 투여가 해마조직에서 신경아교세포와 NF-κB에 매개된 염증인자들을 활성화시킨다는 것을 확인하였 다. 따라서, 본 연구는 LPS 투여는 해마조직에서 산화적 스트레스 증가와 염증인자 활성을 증가시켜 신경손상을 유도함을 보여준다.



    National Research Foundation of Korea
    NRF-2018R1D1A1B07044074

    서론

    염증반응(Inflammatory response)은 조직의 손상이나 항 원 침입에 대한 국소적인 방어작용으로, 손상된 세포의 제 거나 조직 회복에 관여한다. 그러나, 과도한 염증반응은 세 포사멸을 유도하고, 결국 조직 손상과 기능 장애를 일으킨 다. 최근, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 등의 퇴행성 신경 질환의 발병률이 증가하고 있다. 이들 신경질환은 세균에 대한 감염이나 내성 인자의 발현에 따른 신경 염증을 동반 한다(Wyss-Coray & Mucke., 2010; Amor et al., 2014). Lipopolysaccharide (LPS, 지질다당질)는 그람 음성균의 외 막을 구성하는 내독소로서, 염증반응을 유도한다고 알려져 있다(Nolan et al., 2003; Quan et al., 1999). LPS는 염증성 cytokine의 분비를 자극시켜 신경염증과 신경퇴화를 일으킨 다(Laye et al., 1994; Pitossi et al., 1997). 또한, LPS는 뇌 손상을 악화시키고 인지장애와 행동장애를 나타내었다(Zhao et al., 2019).

    Ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1)은 미 세아교세포에서 발현하는 칼슘과 액틴 결합단백질로, cytokine 과 interferon에 의해 유도된다고 알려져 있다(Ahmed et al., 2007). 또한, glial fibrillary acidic protein (GFAP)는 별아교 세포에서 발현되는 중간섬유 단백질로, 세포 골격의 구조, 혈액-뇌장벽 형성, 세포 운동성 조절 등 중추신경계의 주요 기능에 관여한다(Takizawa et al., 2008). GFAP의 변이는 비 정상적인 수초형성과 혈액-뇌장벽의 손상을 나타내었다 (Liedtke et al., 1996). 미세아교세포와 별아교세포의 활성화 는 신경에서 나타나는 염증반응에서 중요한 역할을 담당하 고 있다(Burguillos et al., 2011; Grimaldi et al., 2019). 또한 이들 염증세포들은 LPS에 의해 유도된 염증에서 활성이 이 루어졌다고 보고된 바가 있다(Stalder et al., 1997). 따라서, Iba-1과 GFAP는 각각 미세아교세포와 별아교세포의 표지 자로 사용된다.

    포식세포는 염증성 cytokine 분비에 중요한 역할을 한다 (Silswal et al., 2005). Nuclear factor kappa B (NF-κB)는 DNA 전사 조절 및 cytokine 분비에 관여하는 단백질복합체 이다(Dutta et al., 2006; Brantley et al., 2001; Zhao et al., 2014). 또한, NF-κB는 감염에 의한 면역반응의 조절에 관여 하며, NF-κB의 비정상적인 조절은 자가면역질환, 바이러스 감염, 불완전한 면역체계를 초래한다. Interleukin-1β (IL-1β, 인터루킨-1β)와 tumor necrosis factor-α (TNF-α, 종양괴사 인자-α)는 대표적인 염증성 cytokine으로, 염증반응을 일으 키는 주요 매개체로 알려져 있다(Strieter et al., 1993;Ren & Torres, 2009). 이들은 포식세포의 활성화를 통해 분비되며, 세 포 분화, 증식, 사멸에 관여한다(Quan et al., 1994; Zieleniewski et al., 1995;Parameswaran & Patial, 2010;Olmos & Lladó, 2014). 본 연구에서는 LPS에 의한 중추신경계, 특히 대뇌의 해마조직의 손상이 어떤 기전을 통하여 이루어지는가를 확 인하고, 이를 통해 LPS와 관련된 신경염증 질환 치료방법 개발에 있어 그 기초자료를 마련하고자 한다. 이전의 연구 들에서는 LPS 투여에 따른 해마에서의 여러 염증반응에 대 해 연구 된 바는 있으나, NF-κB 연관 염증반응경로에 대한 연구는 거의 없다(Schwarz et al., 2011; da Silva et al., 2019). 본 연구는 LPS 투여가 해마조직에서 미세아교세포 와 별아교세포의 활성을 조절하고, NF-κB 매개 cytokine인 IL-1β와 TNF-α를 조절하는지를 확인하고자 하였다. 따라 서, LPS가 투여된 해마조직에서 조직병리학적 변화를 관찰 하였고, 산화적 스트레스 증가, 신경아교세포 활성화 및 염 증인자 증가를 확인하였다.

    재료 및 방법

    1. 실험동물 및 LPS 투여

    실험동물은 BALB/c계 수컷 생쥐(6주령, 33-35 g)를 분양 받아 사용하였고, 온도와 습도가 조절되는 동물관리실에서 사육되었다. 사료와 물은 자유롭게 제공되었고, 대조군과 LPS 투여군으로 나누었다. LPS (250 μg/kg, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)는 생리식염수에 희석하여 5일 동안 복강으 로 주사하였고, 대조군은 LPS 투여군과 동일한 용량의 생리 식염수를 주사하였다. 매일 오전 10시에 체중을 측정하였고, 마지막 LPS 투여 24시간 후에 뇌 조직을 적출하였다. 뇌 조 직은 조직병리학적인 분석을 위하여 4% paraformaldehyde 용액에 고정시켰고, reactive oxygen species (ROS, 활성산 소종), lipid peroxidation (LPO, 지질인산화), Western blot 분석을 위하여 뇌 조직의 해마 부위를 분리하여 -70°C에서 보관 하였다.

    2. Reactive oxygen species (ROS) 측정

    해마조직을 lysis buffer [1% Triton X-100, 1 mM EDTA] 에 넣어 분쇄시킨 후, 15,000 g에서 20분간 원심분리하여 상 층액을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 bicinchoninic acid kit (BCA, Pierce, Rockford, USA)로 측정 한 후, Locke’s buffer [154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 3.6 mM NaHCO3, 2.0 mM CaCl2, 10 mM D-glucose, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid (HEPES)]로 5 ㎎/㎖ 농도로 희석시켰다. ROS는 dichlorofluorescein (DCF)로 산화되는 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)를 이용하여 측정되었고, 분광광도 계를 이용하여 484 nm의 excitation wavelength과 530 nm의 emission wavelength에서 측정되었다. 분석결과는 DCF pmol/mg 단위로 표시하였고, 대조군의 ROS 값을 1로 설정하여 분석 하였다.

    3. Lipid peroxidation (LPO) 측정

    지질인산화 과정에서 생성되는 malondialdehyde (MDA) 를 측정하였고 LPO assay kit (BioVision Inc., Milpitas, USA)를 이용하여 분석하였다. 해마조직은 MDA lysis buffer 와 butylated hydroxytoluene에 넣어 분쇄되었고, 13,000 g에 서 10분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 상층액은 thiobarbituric acid와 95°C에서 60분간 반응시킨 후, 얼음에 10분간 방치되었다. 상층액의 흡광도는 532 nm에서 측정되 었으며, MDA 분석결과를 MDA nmol/mg 단위로 표시하였 다. 대조군의 MDA 값은 1로 설정하여 분석하였다.

    4. Hematoxylin & eosin 염색

    뇌 조직을 수세한 후 저농도에서 고농도의 에탄올 용액 으로 탈수 시킨 후, xylene으로 투명화시켰다. 투명화된 조 직은 파라핀 포매센터(Embedding center, Leica, Wetzlar, Germany)에서 파라핀으로 포매되었다. 파라핀 블록은 회절 식 박절기(Rotary microtome, Leica)를 사용하여 4 μm 두께로 박절되었고, 조직절편은 조직 가온기(Slide warmer, Thermo Fisher Scientific, Walthem, USA)에서 건조되었다. 건조된 조직절편은 탈파라핀 후 고농도에서 저농도의 에탄올 용액으 로 함수되었다. 조직절편은 Harris’ hematoxylin 용액(Sigma- Aldrich, St. Louis, USA)과 eosin Y 용액(Sigma Aldrich, St. Louis, USA)을 이용하여 염색되었다. 염색 후 저농도에서 고농도의 에탄올 용액으로 탈수시켰고, xylene으로 투명화 과정이 이루어졌다. 조직절편은 봉입제(Permount mounting solution, Thermo Fisher Scientific, Walthem, USA)로 봉입되 었고, 현미경(CX31, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰되었다.

    5. Western blot 분석

    해마조직은 200 μM phenylmethylsulfonyl fluoride을 첨 가한 lysis buffer [1% Triton X-100, 1 mM EDTA]에서 분쇄 되었고, 15,000 g, 20분간 원심분리 후 상층액을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 BCA kit (Pierce, Rockford, USA)를 이용하여 측정하였다. 단백질 시료 30 μg를 100°C에서 3분 간 가열한 후 얼음상자에 1분간 넣어두었고, 10% sodium dodecyl sulfate poly-acrylamide gels에서 전기영동 하였다. 전기영동 후 단백질을 polyvinylidenedifluoride membrane (Millipore, Billerica, USA)로 옮겼고, 0.1% Tween-20으로 혼합된 tris-buffered saline (TBST)용액으로 희석된 5% skim milk 용액에서 1시간 반응시켰다. Membrane은 TBST 로 세척 후, 일차항체와 4°C에서 18시간 반응시켰다. 일차 항체로는 anti-Iba-1, anti-GFAP, anti-NF-κB, anti-TNF-α, anti-IL-1β, anti-β-actin (1:1,000, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA)이 사용되었다. Membrane은 TBST로 세척 후, horseradish peroxidase와 결합된 anti-mouse IgG 또는 anti-rabbit IgG (1:5,000, Cell Signaling Technology, Danvers, USA)와 실온에서 2시간 반응시켰다. 이차항체와 반응 후 membrane을 TBST로 세척시켰고, enhanced chemiluminescence detection reagents (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)와 반응 후 Fuji medical X-ray film (Fuji Film, Tokyo, Japan)에 노출시켰다.

    6. 면역형광 염색

    탈파라핀 된 조직절편은 고농도에서 저농도의 에탄올 용 액으로 함수되었고, phosphate buffered saline (PBS)로 세척 후, normal goat serum으로 1시간 반응시켰고, anti-Iba-1, anti-GFAP, anti-NF-κB, anti-TNF-α, anti-IL-1β (1:100, Santa Cruz Biotechnology) 1차 항체를 조직위에 떨어뜨려 습윤한 상자에 넣어 4°C에서 18시간 반응시켰다. 조직절편은 PBS 로 세척 후, fluorescein isothiocyanate (FITC)와 결합된 anti-mouse IgG 또는 anti-rabbit IgG (1:5,000, Cell Signaling Technology, Danvers, USA)와 실온에서 2시간 반응시켰고, 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)와 10분간 반응시켰다. 염색된 슬라이드는 Ultra- Cruz mounting medium (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA)로 봉입되었다. 양성반응세포는 confocal microscope (FV-1000, Olympus)으로 관찰되었고, 양성반응세포의 형광 강도는 Image-Pro Plus image software (Media Cybernetics, Rockville, USA)를 사용하여 분석되었다. 대조군의 형광강 도는 1로 설정하였으며, 결과 값은 LPS 투여군의 형광강도 와 대조군의 형광강도의 비율로 나타내었다.

    7. 자료 분석

    모든 실험결과는 반복 측정하여 평균 ± 표준오차로 표시 하였다. LPS 투여군 별 유의성 평가는 Student’s t-test를 이 용하여 p<0.05 수준에서 검증하였다.

    결과 및 고찰

    1. LPS투여에 의한 체중 감소 및 ROS과 LPO의 수치 증가

    LPS 투여에 따른 체중의 변화를 확인하기 위해 매일 체 중을 측정하였다. 마지막 LPS 투여 24시간 후 대조군과 LPS 투여군의 체중은 36.5 ± 1.24 g과 29.4 ± 0.98 g으로 LPS를 투여한 실험군에서 체중이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 1A, n=5). ROS와 LPO의 값은 해마조직 내 DCF와 MDA 함량을 통하여 측정되었고, 대조군과 비교하 였을 때 LPS 투여군에서 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 대조군의 수치를 1로 설정하였을 때, LPS 투여 군의 DCF 값은 2.14 ± 0.22, MDA 값은 2.34 ± 0.19로, LPS 투여군의 ROS과 LPO의 수치가 증가하였다(Fig. 1B, n=5). 이 결과는 LPS 투여에 의한 체중 감소 및 해마조직에서 산 화적 스트레스 증가를 보여주었다. LPS에 의해 유도된 산 화적 손상을 ROS와 LPO 분석을 통하여 확인하였고, LPS 가 투여된 해마조직에서 DCF와 MDA 값이 현저히 증가함 을 보여주었다. 산화적 스트레스의 증가는 미토콘드리아 막 투과성을 감소시키고, 미토콘드리아 호흡 활성을 손상시켜, 신경세포의 기능 장애와 퇴화를 유도하였다(Noh et al., 2014; Hunter et al., 2017). 따라서, LPS에 의한 산화적 스트 레스의 증가가 신경세포의 손상 및 기능장애를 일으킴을 알 수 있었다.

    2. LPS투여에 따른 해마조직의 조직병리학적 변화

    대조군과 LPS 투여군에서 해마조직의 조직병리학적 변 화를 관찰하였다(Fig. 2, n=5). 대조군에서는 전형적인 피라 미드 모양을 가진 정상적인 신경세포를 관찰할 수 있었고, 가지돌기도 잘 발달되었다(Fig. 2A, C, E and G, 화살표). 그러나, LPS 투여군의 신경세포는 신경세포체가 팽창되고, 가지돌기가 소실되었다(Fig. 2B, D, F and H, 빈 화살표). 또한, 신경아교세포들은 진하게 염색된 찌그러진 형태를 보 였고, 세포 주위에 공포가 관찰되었다(Fig. 2B, D, F and H, 화살표머리). 이 결과는 LPS 투여에 따른 조직병리학적 변 화를 통하여 LPS가 해마조직의 신경세포에 손상을 미치는 것을 확인할 수 있었다.

    3. LPS투여에 따른 해마조직의 Iba-1과 GFAP의 발현량의 변화

    LPS 투여에 의한 신경아교세포의 활성을 조사하기 위하 여, 미세아교세포와 별아교세포 표지자인 Iba-1과 GFAP의 단백질 발현을 측정하였다. Western blot 결과에서, Iba-1과 GFAP의 발현이 LPS 투여군에서 현저하게 증가한 것을 확 인하였다(Fig. 3A). Iba-1 발현량은 대조군에서 0.31 ± 0.08, LPS 투여군에서 0.63 ± 0.05로 나타났으며, GFAP 발현량은 대조군에서 0.82 ± 0.07, LPS 투여군에서 1.25 ± 0.09로 나 타났다(Fig. 3B, n=5). 또한, 면역형광 염색을 통해 LPS 투 여군의 Iba-1과 GFAP의 발현량을 대조군과 비교하였다 (Fig. 4). 양성반응세포들이 LPS 투여군에서 현저히 증가되 었고, CA1 부위가 CA2와 CA3 부위 보다 훨씬 더 현저하게 증가되었다(Fig. 4A). CA1 부위에서 이들 양성반응세포들 의 형광강도를 분석한 후, 대조군의 값을 1로 설정하였을 때, LPS 투여군에서 Iba-1의 형광강도는 1.96 ± 0.24, GFAP 의 형광강도는 4.36 ± 0.24로 나타났다(Fig. 4B and C, n=5). 퇴행성 신경질환에서 염증성 cytokine의 증가와 미세아교세 포와 별아교세포의 활성화가 보고되었다(Bodea et al., 2014; Pekny et al., 2014). Iba-1의 증가는 미세아교세포 활 성화를, GFAP의 증가는 별아교세포 활성화를 나타낸다. 본 연구의 결과는 LPS에 의한 해마조직의 손상 시 Iba-1와 GFAP의 증가를 보여 주었다. 신경세포 손상 시 신경아교세 포에서 Iba-1의 증가가 보고되었고, GFAP의 발현은 노화, 중추신경계의 손상, 퇴행성 뇌질환, 신경염증질환에서 증가 되었다(Chen et al., 1993; Kohama et al., 1995; Brenner, 2014). LPS 투여에 의한 Iba-1과 GFAP 증가는 뇌 손상 시 이들 단백질의 변화를 밝힌 앞선 연구의 결과를 입증해주고 있다. 또한, 활성화된 신경아교세포는 cytokine과 chemokine 을 분비하고, 중추신경계 면역을 활성화하는 항원제시를 통 해 염증을 일으켜 신경독성을 유발하였다(Jha et al., 2012). 본 연구는 LPS 투여가 해마조직에서 신경아교세포를 활성 화하여 염증반응을 일으키고, 결국 세포 손상을 유도한다는 것을 설명해 주고 있다.

    4. LPS투여에 따른 해마조직의 NF-κB, IL-1β, TNF-α의 단백질 발현량의 변화

    LPS 투여에 의한 NF-κB 매개 염증인자의 변화를 조사 하기 위하여, NF-κB, IL-1β, TNF-α의 단백질 발현량을 측 정하였다. Western blot 결과에서 NF-κB의 발현이 LPS 투 여군에서 현저하게 증가한 것을 확인하였다(Fig. 5A). NF-κ B 발현량은 대조군에서 0.27 ± 0.05, LPS 투여군에서 0.75 ± 0.04로 나타났다(Fig. 5B, n=5). 또한, NF-κB의 양성반응 세포들은 LPS 투여군에서 현저히 증가되었다(Fig. 5C). CA1 부위에서 LPS 투여군의 형광강도는 2.05 ± 0.24로 대 조군에 비해 현저하게 증가하였다(Fig. 5D, n=5). IL-1β와 TNF-α의 발현이 LPS 투여군에서 현저하게 증가함을 확인 하였다(Fig. 6A). Western blot 결과에서, IL-1β 발현량은 대 조군에서 0.44 ± 0.04, LPS 투여군에서 0.88 ± 0.03로 나타 났으며, TNF-α 발현량은 대조군에서 0.12 ± 0.06, LPS 투여 군에서 0.45 ± 0.04로 나타났다(Fig. 6B, n=5). 면역형광 염 색의 결과는 IL-1β와 TNF-α 양성반응세포들은 대조군에 비 해 LPS 투여군에서 현저히 증가함을 보여주었다(Fig. 7A, n=5). CA1 부위에서 LPS 투여군의 IL-1β의 형광강도는 1.45 ± 0.24, TNF-α의 형광강도는 2.74 ± 0.24로 나타났다 (Fig. 7B and C).

    활성화 된 미세아교세포와 별아교세포는 NF-κB와 염증 유발 인자의 발현을 증가시켰고, 활성산소 생성을 증가시켰 다(Block et al., 2007; Farina et al., 2007), 또한, 활성화된 NF-κB는 IL-1β와 TNF-α을 포함하는 염증성 cytokine 방출 에 관여하였다(Srinivasan et al., 2004). 이들 cytokine은 포 식세포 활성화에 관여하며, 신경세포뿐만 아니라 신장, 폐, 간 조직의 손상을 유발하였다(Seekamp et al., 1993; Gieling et al., 2009). IL-1β는 TNF-α와 관련된 염증반응을 증가시 켰고, TNF-α는 외상성 뇌손상과 뇌 허혈을 일으키는 신경 염증반응에 관여하였다(Watters & O’Connor, 2011; Longhi et al., 2013). 해마조직에서 IL-1β와 TNF-α의 증가는 시냅스 의 신호 전달에 변화를 주어 기억 손상을 일으켰다(Barrientos et al., 2009; Liu et al., 2017). 본 연구는 LPS에 의한 해마조 직의 손상시 NF-κB의 증가와 NF-κB와 관련된 염증인자인 IL-1β 와 TNF-α의 증가를 통해, LPS가 염증반응을 유도함 을 알 수 있었다. 해마의 CA1 부위는 LPS에 더 민감하다고 알려져 있다(Espinosa-Oliva et al., 2011). LPS 투여는 CA1 부위의 시냅스 신호전달과 가소성의 변화를 일으켰다(Commins et al., 2001). 특히, 내인성 산화적 스트레스에 의한 해마의 손상은 CA3 부위보다 CA1 부위에서 더 큰 손상을 보였다 (Wang et al., 2005). 본 연구의 면역형광염색의 결과는 Iba-1, GFAP, NF-κB, IL-1β, TNF-α 발현의 변화가 CA2와 CA3 부위보다 CA1 부위에서 현저하게 증가함을 보여주었다. 이 들 결과는 CA1부위가 CA2와 CA3 부위보다 LPS에 의한 조직 손상이 더 심한 부위임을 나타내 주었다. 앞선 연구들 은 LPS가 Akt/GSK-3β 신호전달체계를 통해서 신경염증과 신경퇴화를 유도한다고 보고하였다(Beurel & Jope, 2009). LPS와 관련된 기전은 매우 복잡하며, 신경염증반응도 다양 한 신호전달체계에 의해 이루어진다. 본 연구에서는 LPS에 의해 손상된 해마조직에서 산화적 스트레스 증가, Iba-1과 GFAP 증가, NF-κB, IL-1β, TNF-α 증가를 밝혀 LPS에 의한 미세아교세포와 별아교세포 활성화, NF-κB 및 염증인자 증 가를 보여주었다. 따라서, 본 연구는 LPS의 투여는 해마조 직에서 신경아교세포와 NF-κB에 매개된 염증인자들의 활 성화를 통하여 신경염증반응을 유도함을 밝히고 있다.

    LPS 투여는 실험동물의 체중을 감소시켰고, 뇌의 해마조 직에서 산화적 스트레스를 증가시켰으며, 신경세포를 손상 을 유도했다. 또한, LPS 투여는 Iba-1과 GFAP 발현을 증가 시켰고, 이들 단백질의 증가는 미세아교세포와 별아교세포 의 활성화를 나타내었다. LPS에 의한 해마조직 손상 시, NF-κB, IL-1β, TNF-α 발현은 증가되었고 이들 단백질의 증 가는 LPS가 NF-κB 활성화를 통해 염증반응을 유도함을 나 타낸다. 따라서, 본 연구의 결과는 LPS 투여에 의한 해마조 직의 산화적 스트레스 증가, 신경아교세포의 활성화, NF-κ B와 관련된 염증성 cytokine인 IL-1β와 TNF-α 발현의 증가 를 보여주었다. 궁극적으로, 본 연구는 LPS 투여는 해마조 직에서 신경아교세포의 활성 조절 및 이전 연구에서 다루었 던 여러 염증경로와는 다르게 NF-κB에 매개된 염증인자들 의 활성화를 통하여 신경손상이 유발됨을 밝혔다.

    감사의 글

    “본 연구는 교육과학기술부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행한 기본연구사업 연구임(NRF-2018R1D 1A1B07044074).”

    Figure

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    Body weight (A), reactive oxygen species (ROS) and lipid peroxidation (LPO) analyses (B) in hippocampus of control and lipopolysaccharide (LPS)-treated animals. LPS induced a reduction of body weight (A) and increases of DCF and MDA values (B). Data (n=5) are shown as mean±S.E.M. #p<0.05 vs. control animal.

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    Representative photomicrographs of hematoxylin and eosin staining in hippocampus of control and lipopolysaccharide (LPS)-treated animals. LPS treatment induced severe histopathological changes including swelling and vacuolation of nerve cells. Arrows indicate normal pyramidal cells with well characterized dendrites. Open arrows indicate abnormal nerve cells that were swelled and vacuolated. Arrowheads indicate shrunken neuroglial cells. Magnified photos indicate square region (n=5). Scale bar=100 μm (A and B), 200 μm (C-H).

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    Western blot analysis of ionized calcium binding adaptor molecule-1 (Iba-1) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in hippocampus of control and lipopolysaccharide (LPS)- treated animals (A). Density values are expressed as a ratio of each protein intensity to β-actin intensity (B). Data (n=5) are shown as mean±S.E.M. #p<0.05 vs. control animal.

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    Immunofluorescence labeling of ionized calcium binding adaptor molecule-1 (Iba-1) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in hippocampus of control and lipopolysaccharide (LPS)-treated animals (A). Intensity values of fluorescence were expressed as ratio of intensity of LPS-treated to intensity of control animals (B and C). Intensity value of control animal was set to 1. Data (n=5) are shown as mean±S.E.M. #p<0.05 vs. control animal.

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    Western blot analysis (A and B) and immunofluorescence labeling of nuclear factor kappa B (NF-κB) in hippocampus of control and lipopolysaccharide (LPS)-treated animals (C and D). Density values of are expressed as a ratio of each protein intensity to β-actin intensity (B). Intensity values of fluorescence were expressed as ratio of intensity of LPS-treated to intensity of control animals (D). Intensity value of control animal was set to 1. Data (n=5) are shown as mean±S.E.M. #p<0.05 vs. control animal.

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    Western blot analysis of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in hippocampus of control and lipopolysaccharide (LPS)-treated animals (A). Density values are expressed as a ratio of each protein intensity to β-actin intensity (B). Data (n=5) are shown as mean±S.E.M. #p<0.05 vs. control animal.

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    Immunofluorescence labeling of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in hippocampus of control and lipopolysaccharide (LPS)-treated animals (A). Intensity values of fluorescence were expressed as ratio of intensity of LPS-treated to intensity of control animals (B and C). Intensity value of control animal was set to 1. Data (n=5) are shown as mean±S.E.M. #p<0.05 vs. control animal.

    Table

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