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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.53 No.6 pp.75-86
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2019.53.6.75

Survey and Microbiological Quality Control of Commercial Probiotics for Livestock in South Korea

Yeon-Jae Choi, Sang-Suk Lee*
Department of Animal Science & Technology, Sunchon National University, Suncheon 57922, Korea
Corresponding author: Sang-Suk Lee Tel: +82-61-750-3237 Fax: +82-61-750-3230 E-mail: rumen@sunchon.ac.kr
August 6, 2019 ; November 12, 2019 ; December 9, 2019

Abstract


This study surveyed and evaluated the product information of commercial probiotics for livestock in South Korea. The products were randomly collected and evaluated for the indicated strains, the number of microorganisms, the date of manufacture, the expiration date, quality of the actual product and the antibiotics resistance. The microorganisms indicated in the product were 34 species of lactic acid bacteria, 33 species of Bacillus sp., 25 species of yeast, and 22 other species. The product with the number of viable cells matched to the indicated strain was 57.78%, the product with the indicated strain was 37.78%, the number of viable cells and indicated strain matched was 22.22%. The information on the microbial strains of the product was different from the actual microbes amount and species identified. Saccharomyces cerevisiae, Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis, and Enterococcus faecium were the major microorganisms analyzed in the actual product. Highest resistance was in chloramphenicol and susceptible was in ampicillin. In order to restore the reliability of probiotics products and to verify their effectiveness, it is necessary to strengthen regulations of management institutions and improve quality control of producers.



국내 상업용 사료첨가제 생균제의 제품조사 및 품질평가

최 연재, 이 상석*
순천대학교 동물자원과학과

초록


본 연구는 상업용 사료첨가제 생균제의 제품정보 조사와 미생물학적 평가를 통해 제품개선방안을 모 색 하는데 목적이 있다. 상업용 생균제는 무작위로 수집하여 표기균주 및 보증균수 조사, 실제 제품의 생균수 및 우점균주 평가, 유통기한 변화에 따른 품질평가, 항생제 내성평가 등을 수행하였다. 제품에 표기된 보증 생균수는 평균 6.98 log10 cfu/g, 혼합된 미생물은 평균 2.37개, 주요 미생물은 Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus acidophilus, L. plantarum으로 조사되었다. 실제 제품 분석결과 생균수와 표기균주 모두 일치한 제품은 22.22%, 불일치 제품은 24.44%로 분석되었으며 주로 검출된 미생물은 S. cerevisiae, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, Enterococcus faecium 으로 나타나 표기정보와 상이한 결과를 보였다. 항생제 감수성 평가결과 클로람페니콜에 대해 저항성이 가장 높았으며 암피실린에 민감성이 가장 높았다. 상업용 생균제의 안정성 확보를 위한 자체 품질관리 강화와 유통구조 개선이 시급하며 제품의 신뢰성 회복을 위한 효과검증 및 안전성평가에 대해 관리기관 의 지속적인 제품 모니터링 및 규정강화가 필요할 것으로 판단된다.



    서론

    Probiotics 또는 Direct-fed microbials (DFM)으 로 통용되는 생균제는 인체용 뿐만 아니라 축산분 야에서 다양하게 사용되고 있다. 국내에는 1980년 후반 축산용 생균제가 보급되어 30년간 지속적으 로 성장하였으며(Lee, 2008), 단일미생물제, 복합 미생물제, synbiotics 제품이 개발되었고, 최근에는 Psychobiotics 제품 등이 주목받고 있다(Sarkar et al., 2016; Cheng et al., 2019). 유럽 및 국내에서 는 배합사료 내 성장촉진용 항생제 첨가가 금지됨에 따라 생산성 향상, 질병예방 및 악취저감 목적 등으 로 생균제를 사용하고 있으며, 생균제는 동물용의약 품, 보조사료, 농업기술센터에서 보급하는 생균제로 구분할 수 있다. 상업용 제품군은 약 300여개 업체 가 직·간접적으로 생균제를 취급하고 있다(Choi & Heo, 2019).

    생균제는 사용균주, 생균수 및 안전성을 기본으로 안정성 및 효능이 확보되어야 하며 장내에서 충분한 효과를 발휘하기 위해서는 사용균주의 내열성, 내산 성, 내담즙성, 장 정착능, 증식능력이 기본적으로 확보되어야 하며, 항균력, 항생제내성, 효소생성능, 악취저감능 등 추가적으로 요구되고 있다. 안전성 측면에서 생균제용 미생물 또한 항생제 내성인자가 plasmid DNA 뿐만 아니라 장 바이러스에 의해 수 평적 전이가 된다고 알려져 있다(Moon et al., 2006; Shoemaker et al., 2001). 유럽의 경우, 유 럽식품안전청 및 감수성 시험 유럽위원회에서 생균 제 미생물의 항생제 내성 기준을 확립되어 있으며, 유럽 동물영양 과학위원회에는 항생물질과 대등한 연구자료 제출 및 심사를 받아야 제품 등록 및 유통 이 가능한 시스템이 구축되어있다. 그러나 국내의 상업용 생균제의 등록규정은 미생물 성분, 함량, 균 수 측정방법, 임상시험, 안전성 시험을 거쳐 허가를 취득하는 동물의약품보다는 사료공정서에 고시된 미 생물 사용과 최소균수 106 cfu/g 기준으로 등록이 가능한 보조사료 생균제 비중이 높은 것이 현실이다 (Lee, 2008; Lee, 2012).

    국내 축산업은 축산물 위생 안전, 친환경축산, 농 가경영 안정, 생산기반 유지, 미래성장산업화로 정 책이 변화되고 있으며, 최근에는 악취방지법 강화에 따라 냄새와 관련한 사회적 분쟁이 심화되고 있다. 이에 최적의 대안으로 양돈농가 대부분은 생균제를 사용하고 있으며, 축산농가의 60% 이상 미생물 제 품을 사용하고 있으나 효과에 대한 의문이 제기되고 있는 실정이다(Yoon et al., 2009;Choi & Heo, 2019). 따라서 본 연구에서는 상업용으로 유통되고 있는 동물용의약품 및 보조사료 생균제 제품을 조사 하여 현황을 파악하고 품질을 평가하여 개선방안을 모색하고자 수행되었다.

    재료 및 방법

    1 시험재료

    본 실험에 사용한 상업용 생균제는 동물약품대리 점, 농가직접방문, 인터넷구입 등을 통해 무작위로 수집하였다. 동물용의약품 생균제는 18제품, 보조사 료용 생균제는 27제품, 총 38개업체의 45제품을 조 사하였다.

    2 제품정보 조사

    제품의 정보를 분석하기 위해 제품에 표기된 허가 정보, 제조일, 유통기한, 보증균수, 사용균주를 조사 하였다.

    3 생균수 측정

    시료를 0.85% 생리식염수 27mL에 3g를 넣고 30분 동안 shaking 하였다. 십진 희석한 후 도말평판배양 법을 이용하여 생균수를 측정하였다. 유산균은 MRS agar (Merck, USA), 바실러스는 TSA agar (BD Difco, USA), 효모는 Yeast glucose chloramphenicol agar (BD, USA), 클로스트리듐은 reinforced-clostridium medium (Merck, USA)을 사용하였으며, 표기된 균 수함량에 따라 단계희석하여 3반복으로 평가하였다. 유산균 및 클로스트리듐은 Anaerocult® A (Merck, Germany)를 Anaerobic jar에 넣어 유산균은 37℃ 에서 48시간 동안, 클로스트리듐은 39℃에서 24시 간 동안 혐기적으로 배양하였다. 바실러스 및 효모 는 37℃ 및 30℃에서 호기적으로 48시간에서 72시 간 동안 배양하였다.

    4 균주확인

    균주 확인은 Hu et al. (2015) 방법을 변형하여 실시하였다. 생균수측정 완료 후 가장 높은 희석배 율의 고체배지에서 생성된 콜로니를 모양, 색, 크기 를 고려하여 무작위로 10개씩 새로운 배지에 분리 이식하여 배양하였다. 배양된 콜로니를 5% chelex solution (BioRad, USA)을 이용하여 DNA를 추출 하였고 Colony PCR을 진행하였다. 세균은 27F (5’-AGA GTT TGS TCM TCG CTC AG-3’), 1492R (5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’), 진균은 ITS1 (5’-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GT-3’), ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT GAT ATG C-3’) primer를 이용하여 PCR을 진행하였다. 1% agarose gel을 이용하여 100V에서 20분 동안 전기영동 하여 PCR 결과를 확인하였다. PCR 산물 은 제한효소절단분석(ARDRA, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) 을 이용하여 균주를 스 크린 하였다. 제한효소는 HhaⅠ 과 HaeⅢ (Takara, Japan)를 이용하였으며 패턴분석 하여 염기서열 분 석을 의뢰하였다. 염기서열 분석은 NCBI 및 EzTaxon DB를 이용하여 균주를 확인하였다.

    5 항생제 감수성 및 최소저해농도 분석

    상업용 생균제에서 분리동정한 균주의 항생제 감 수성 및 최소저해농도 분석을 위해 Lactobacillus 4종, Enterococcus 3종, Bacillus 13종, 효모 3종을 이용하였다. Kirby-Bauer disk diffusion 항생제 감수성 시험은 Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) 방법을 이용하였다(Hudzicki, 2009). 자동화 디스펜서(BBL TM Sensi-Disc Designer Dispencer, USA)를 사용하여 항생제 디스크 시험 에 이용하였으며, 플레이트를 35℃±2℃ 에서 배 양한 후 18시간 배양 후 판독하였고, 반코마이신 에 대한 Enterococcus의 판독은 24시간 배양한 후 판독하였다. 감수성 시험 유럽위원회의 기준에 따라 항생제에 대한 민감성 및 저항성을 평가하였 다(EUCAST, 2016). 항생제 최소저해농도(MICs, Minimun Inhibitory Concentrations) 분석은 two fold plate dilution 방법으로 조사하였다. 사용된 항생제의 농도는 2,048㎍/mL부터 0.063㎍/mL까지 1/2씩 단계희석 하여 3반복으로 하였다. 각 농도별 항생제가 첨가된 배지에 107cfu/mL 수준의 미생물 을 희석하여 접종한 후 35℃±2℃에서 18시간 동안 배양한 후 생장여부를 항생제가 포함되지 않은 대조 구와 비교하여 확인하였다. 균의 성장이 완전히 저 지되는 농도의 2배 농도를 MIC로 결정하였으며, break point 보다 높은 농도쪽에 분포하는 균주들 을 내성균으로 결정하였고 유럽식품안정청(EFSA, 2012) 기준에 따라 판정하였다. Table 1

    결과 및 고찰

    1 생균제 제품 정보

    38개 업체의 45제품의 유통기한은 최소 6개월에 서 최대 24개월 평균 17.85개월로 조사되었다. 제품 에 표기된 유효 생균수는 평균 6.98 log10 cfu/g, 표기된 미생물 종은 평균 2.37개로 조사되었다. 제 품에 표기된 미생물 종은 유산균 34종, Bacillus sp. 33종, Yeast 25종, 기타 22종으로 분석되었다. 유산균 중 Lactobacillus acidophilusL. plantarum이 주 로 표기되었고 L. casei, L. paracasei, Pediococcus acidilactici 가 일부 표기되었다. Bacillus sp. 중 Bacillus subtilis가 28개 제품에서 표기되어 가장 높 은 분포를 보였고, B. licheniformis, B. coagulans 가 일부 표기되었으며, Yeast 는 Saccharomyces cerevisiae가 주로 표기되었다. 기타 표기 균주로는 Streptococcus faecium, Enterococcus faecium, Aspergilus oryzae, Clostridium butyricum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium pseudolongum 이 조사되었다(Fig. 1). 하지만 일부제품에서 사 료공정서에 공시되지 않은 Bacillus thuringiens , Bacillus polymyxa, Streptomycess griseus , Actinoplanes sp. 등 이 표기된 제품이 확인되었 다. 상업용 미생물 제품에 대한 일부 연구가 보고 되었는데, 동물의약품 및 보조사료 생균제 32제품 을 조사한 결과 유통기한은 12개월, 균종은 2종이 포함된 제품이 가장 많았다. 그 중 LactobacillusBacillus가 주로 포함되어 있으며(Lee, 2012), 냄새 저감용 생균제에서 가장 높은 빈도로 사용된 미생 물은 B. subtilis, 2-4종의 균주가 포함된 제품이 59%를 차지하였다(Sung et al., 2017). 또한 사용 권장량은 0.1-0.2% 제품이 71%로 가장 많은 것으 로 보고하여 본 연구결과와 유사한 결과를 보였다. Table 2

    2 생균제 제품표기 일치여부

    제품의 생균수 및 미생물 동정결과를 바탕으로 한 종류의 배지에서 생균수가 106 cfu/g 이상일 때 생 균수 일치, 최소 하나의 균주가 표기균주와 일치하 였을 때 미생물 일치, 최소 하나의 생균수와 표기균 주가 일치하였을 때 미생물 및 생균수 표기일치로 하여 Table 3에 나타냈다. 전체 45개 제품의 제조 일로부터 분석 시점까지 평균 5.09개월 경과 되었 고, 생균수가 일치한 제품은 57.78%, 표기균주가 일치한 제품은 37.78%, 생균수와 표기균주 모두 일 치한 제품은 22.22%, 불일치 제품은 24.44% 로 분 석되었다. 생균수 일치 비율은 동물용의약품 생균제 는 55.56%, 보조사료 생균제는 59.26%로 분석되었 고, 표기균주 일치 비율은 동물용의약품 생균제가 50.00%로 보조사료 생균제의 29.63% 보다 약 20% 높은 결과를 보였다. 불일치 비율은 5.56%로 보조 사료 생균제의 37.04% 보다 약 30% 낮았다. 이는 분석시점에서 동물용의약품 생균제가 보조사료 생균 제보다 제조경과일이 약 1.7개월 더 높았음에도 불 구하고 품질유지 효율이 높았음을 시사한다. 일부 생균제 제품에 표기된 균주가 없거나 표시된 균주가 있더라도 언급된 균의 숫자가 부족하거나 다른 미생 물이 오염되는 사례들이 인체용 및 가축용 생균제 제품에서 보고되고 있다(Tuomola et al., 2001; Temmerman et al., 2003; Masco et al., 2005; Huys et al., 2006; Chen et al., 2014). 국내의 경우 2012년 동물의약품 및 보조사료 생균제 품질 평가 보고에 따르면 생균수와 표기균주와 일치한 제품은 37%, 일부 균종 또는 균수가 일치한 제품 34%, 불일치 제품 28%로 보고되었다(Lee, 2012). 생균제 유산균의 경우 섭취 전 108-109 cfu/g 수준 으로 유지되어야 하며 적어도 106-107 cfu/g 이 장 에 도달하여야 효과를 기대할 수 있어 가축용 생균 제 또한 유통기간 동안 유용한 균주가 일정한 균수 를 유지하는 것이 매우 중요하다(Muniandy et al., 2017;Park & Lee, 2017).

    3 미생물 사용빈도

    38개 업체 총 45개 생균제 제품의 미생물 동정 결과 총 144개의 균주의 정보를 획득하였으며 주 로 검출된 균주의 정보를 Fig. 2에 나타냈다. 제품 포장지에 주로 L. acidophilus, L. plantarum, B. sbutilis, S. cerevisiae가 표기되었지만 S. cerevisiae 를 제외하고 실제 제품에서 분석된 미생물은 B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, E. faecium 이 주요 균주로 나타났다. B. amyloliquefaciens 는 총 144개 동정된 균주 중 17균주가 검출되었고 11.81%로 가장 높은 검출빈도를 나타냈으며, B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 와 B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7 type strain 2종류가 검출되었다. B. amyloliquefaciens는 전통발효식품에서 분리되는 유 익균으로 알려져 있지만(Wu & Ahn, 2011; Kim et al., 2012; Kim et al., 2014) 사료공정서 상 허가 되지 않은 균주이다. B. licheniformis 는 16균주 가 검출되었고 11.11% 검출빈도를 나타냈으며, B. licheniformis ATCC14580 type strain 1종류만 검 출되었다. E. faecium은 15균주가 검출되었고, 검 출 빈도는 10.42%였으며, E. faecium ATCC19434 와 E. faecium CGMCC1.2136 type strain 2종류 가 검출되었다. 45개 제품에서 총 47종, 144개 균 주가 검출되었으며, 사료공정서 고시균주는 10종, 54균주였다. 고시균주 외 약 30종 이상 검출되었 는데 이는 곡류 부형제에서 유래되어 제품에 존재 하는 것으로 판단되며, 생장을 조기에 억제하거나 사멸시키기 위해서는 부형제의 전처리과정이 보완 되어야 할 것이다. 또한 최근에는 metagenomics 연구가 활발하게 진행됨에 따라 염증성 장질환에 유익한 Faecalibacterium prausnitzii , 대사장애 치료에 유익한 Akkermansia muciniphila 등 새로 운 지표균주의 가능성이 밝혀지고 있어 다양한 균 주개발 노력이 더욱 필요할 것으로 사료된다 (Miquel et al., 2013;Siniscalco & Antonucci, 2013; Papadimitriou et al., 2015; Kim et al., 2016).

    4 제조일 경과에 따른 품질변화

    생균제 제품의 제조일 경과시간이 상이하여 제품 을 제조일로부터 2개월 이내 및 3개월 이상 제품군 으로 분류 및 비교분석한 결과를 Fig. 3에 나타내었 다. 2개월 이내 제품의 평균 제조일경과는 1개월로 총 14개 제품이었다. 2개월 이내 제품의 생균수 일 치 비율은 64.29%, 미생물 표기 일치 비율은 42.86%, 생균수와 미생물 표기 일치 비율은 28.57%, 불일치 비율은 21.43%로 조사되었다. 반면에 3개월 이상 제품의 평균 제조일경과는 7.07개월로 총 31개 제품 이었다. 3개월 이상 제품의 생균수 일치 비율은 54.84%, 미생물 표기 일치 비율은 35.48%, 생균수 와 미생물 표기 일치 비율은 19.35%, 불일치 비율 은 25.81%로 조사되었다. 두 제품군의 제조일 경과 시간은 6.07개월 차이를 보였고 2개월 이내 제품군 이 3개월 이상 제품군에 비해 생균수 일치 비율 9.45%, 균주 일치 비율 7.37%, 생균수와 미생물 일 치 비율이 9.22% 높았고, 불일치 비율은 4.38% 낮았 다. 본 결과를 종합해보면 유통이 지연됨에 따라 유 효균수와 균주의 비율이 낮아짐을 확인할 수 있었다.

    생균제의 품질에 미치는 요인은 제품의 수분함량, 부형제 종류, 보관온도, 습도, 빛 등이 영향을 미칠 수 있어(Lee, 2012) 생균제 품질유지를 위해서 건냉 암소에 보관하고 개봉한 제품은 단시간에 사용하도 록 권장하고 있다. 또한, 제품에 대해 축산농가 입 장에서 판별할 수 있는 지표가 제한적이며 유통기한 에 관한 규정이 없어 미생물 제품 제조부터 가축에 게 급여되는 시점까지 보증 생균수와 균주가 관리 될 수 있도록 관리기관의 규정강화가 필요하다. 생 산업체에서는 미생물의 저장성이 증진될 수 있는 천 연보존료 사용, 동결건조 미생물 이용, 미생물 캡슐 화, 보호제 이용 등(Kanmani et al., 2011) 제형화 시스템 적용이 추가적으로 필요할 것으로 사료된다. Table 4,5,6

    5 항생제 감수성 및 최소저해농도

    항생제 감수성 평가결과, 모든 항생제에 저항성 을 보인 균주는 L. acidipiscis, L. rennini, S. cerevisiae 2종 및 Candida glabrata 1종으로 나타 났다. 대표적인 생균제로 활용되는 L. plantarum은 반코마이신 및 테트라사이클린에 저항성을 보였고, L. acidophilus는 겐타마이신, 카나마이신 및 클로 람페니콜에 저항성을 보였다. Enterococcus는 공통 적으로 카나마이신과 스트렙토마이신에 저항성을 나 타내었다. Bacillus는 대부분 항생제에 높은 민감성 을 나타내었지만 B. sonorensis는 암피실린, 카나마 이신, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 클로람페니 콜에 저항성을 나타내었다. 감수성 시험 유럽위원회 기준에 따라 항생제 감수성을 판단한 결과 항생제 민감성은 β-lactam 계열의 암피실린에 73.91%로 가장 높았고, 항생제 저항성은 클로람페니콜이 69.57%로 가장 높았다. 기능적으로 항생제를 2개 그룹으로 분류하면 세포벽합성 억제 기능을 가지는 암피실린과 반코마이신 그룹, 단백질합성 억제기능 을 가지는 클로람페니콜, 겐타마이신, 스트렙토마 이신, 카나마이신, 테트라사이클린, 에리트로마이 신, 클린다마이신으로 구분할 수 있다(Georgieva et al., 2015). Lactobacilli는 대표적인 β-lactam 계열의 항생제인 암피실린에 민감성이 높으며 옥 사실린, 세포시틴, 세팔로틴에 저항성이 가장 높 은 것으로 보고되었고(Danielsen & Wind, 2003) Lactobacillus sp. 2종, B. subtilis 1종, S. cerevisiae 1종을 이용 항생제 최소저해농도를 분석 한 연구에서는 반코마이신에 대해 모든 균주가 저항 성을 나타내었다고 보고하였다(Kim et al., 2019).

    항생제 최소저해농도를 유럽식품안전청 기준에 따 라 평가한 결과 L. acidophilus 는 카나마이신 최소 저해농도가 128㎍/mL로 기준치인 64㎍/mL을 상회 하였으며, E. durans 는 클린다마이신 최소저해농 도가 8㎍/mL로 기준치인 4㎍/mL을 상회하여 항생 제 저항성을 보였다. 효모는 유럽식품안전청 기준 이 없지만 암피실린 최소저해농도가 가장 높은 대 장균기준으로 평가한 결과 S. cerevisiaeC. glabrata는 모두 대장균과 동일한 8㎍/mL로 항생제 저항성을 보였다. 생균제 미생물로 고시되고 주로 사용되는 L. acidophilusS. cerevisiae에서 각 각 카나마이신과 암피실린 최소저해농도가 기준치 이상으로 나타남에 따라 생균제용 미생물의 항생제 내성에 대한 추가적인 연구 및 모니터링이 필요할 것으로 판단된다.

    감사의 글

    본 논문은 농촌진흥청 보조사료용 미생물 안전성 확보기술 구축 연구사업(세부과제번호: PJ010906) 의 지원에 의해 이루어진 것임.

    Figures

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    Main microorganisms label of probiotics products.

    JALS-53-6-75_F2.gif

    Microorganisms detection frequency of probiotics products.

    JALS-53-6-75_F3.gif

    Quality changes according to manufacturing date of probiotics products.

    Tables

    Microbiological cut-off values for susceptibility and resistance (mm)

    Microbiological breakpoints for minimum inhibitory concentration (㎍/mL-1)

    Accuracy of products claimed in label description

    Antibiotics susceptibility of bacterial isolates from probiotics by agar diffusion method

    Percentage susceptibility and resistance of isolates from probiotics to antimicrobials

    Minimum inhibitory concentrations of antibiotics against the probiotics strains (㎍/mL)

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