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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.53 No.4 pp.29-34
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2019.53.4.29

Breeding of cgy1cgy1titi Soybean Genotype with Brown Seed Coat

Sang Woo Choi, Won Gi Chae, Gyung Young Kang, Jong Il Chung*
Department of Agronomy, Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea
Corresponding author: Jong Il Chung Tel: +82-55-772-1872 Fax: +82-55-772-1879 E-mail: jongil@gnu.ac.kr
May 27, 2019 May 30, 2019 June 11, 2019

Abstract


Soybean [Glycine max (L.) Merr.] protein is excellent nutritional factors and is widely used for human and animal feed in the world. Also, antinutritional factors in the raw mature soybean are exist. The presence of antinutritional proteins requires that soybeans to be heat-treated at high temperature. Kunitz trypsin inhibitor (KTI) protein and β-conglycinin (7S α’-subunit) protein are main antinutritional factors in soybean seed. The genetic removal of the antinutritional factors will improve the nutritional value of soybean seed. The objective of this research was to breed new soybean strain (cgy1cgy1titi genotype) with brown seed coat, 7S α’ subunit protein free, and KTI protein free. Three parents were used. Presence and absence of 7S α’-subunit and KTI proteins were detected by SDS electrophoresis and Western Blot technique, respectively. One new strain (cgy1cgy1titi genotype) with brown seed coat, lacking of 7S α’-subunit and KTI protein was selected from F4 plant population. New strain has purple flower, brown seed coat, yellow cotyledon, white hilum, 7S α’-subunit protein free, and KTI protein free. Plant height of new strain was 65 cm and 100-seed weight was 24.2 g. New strain selected in this research will be used to improve new cultivar with brown seed coat, 7S α’-subunit and KTI protein free.



갈색 종피를 가진 cgy1cgy1titi 유전자형 콩 육종

최 상우, 채 원기, 강 경영, 정 종일*
경상대학교 농업생명과학대학 농학과

초록


콩[Glycine max (L.) Merr.] 종자에는 수용성 탄수화물 11%, 단백질 40%, 지방 21% 정도의 3대 영 양소가 골고루 함유 되어 있고, 콩 종실 단백질은 양과 질적인 면에서 식물성 단백질 중 가장 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나, 성숙 콩 종실에는 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질, P34 단백질, 7S 단백질 등 품질과 기능성을 떨어뜨리는 성분이 다수 존재하고 있다. 본 연구는 콩 및 콩 제품의 품 질과 기능성을 떨어뜨리는 성분인 7S α’ subunit 단백질과 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질이 유전적으로 없으면서 (cgy1cgy1titi 유전자형) 갈색종피 색을 가진 콩 계통을 선발하기 위하여 진행되었 다. 3개의 모본 (장려품종, PI506876, Gaechuck#2)을 이용한 육종집단으로부터 갈색종피, 노란자엽 및 7S α’ subunit 단백질과 KTI 단백질이 없는 개체를 선발하였다. 선발개체에 대하여 7S α’ subunit 단 백질과 KTI 단백질의 유전적 고정과 농업형질 평가를 통하여 갈색 종피를 가지면서 cgy1cgy1titi 유전자 형을 가져 7S α’ subunit 단백질과 KTI 단백질이 없는 농업형질이 양호한 계통을 선발하였다. 선발된 계통의 초장은 65 cm 정도였으며 백립중은 24.2 g으로 중립이었으며 종피색은 갈색이고 제색은 하얀 색이며 성숙 자엽색은 노란색이었다. 본 연구를 통하여 선발된 계통은 7S α’ subunit 단백질 및 Kunitz Trypsine Inhibitor (KTI) 단백질이 동시에 없는 유색콩 품종 육성을 위한 중간모본으로 이용 될 수 있을 것으로 사료되었다.



    서론

    콩[Glycine max (L.) Merr.] 종자에는 대체적으 로 수용성 탄수화물 11%, 단백질 40%, 지방 21% 정도의 3대 영양소가 골고루 함유되어져 있어 예로 부터 양질의 단백질과 지질의 공급원으로 널리 이 용되어져 왔다(Openshaw & Hardley, 1978). 콩 종 실 단백질은 양과 질적인 면에서 식물성 단백질 중 가장 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나, 성숙 콩 종실에는 Kunitz trypsin inhibitor (KTI) 단백질, P34 단백질, 7S 단백질 등 콩의 품질과 기능성을 떨어뜨리는 성분이 다수 존재하고 있다. 콩 종실 단 백질은 7S (β-conglycinin)와 11S (glycinin)의 비 율이 약 70% 정도이고(Thanh & Shibasaki, 1978), 7S 단백질은 polypeptides인 α', α, β-subunit을 가지고 있으며(Takahashi et al., 2004), 각각의 subunit의 분자량은 대략 72, 76, 53 k dalton으로 알려져 있다. 11S 단백질은 산과 염기 subunit로 구 성되어져 있고, 이들은 disulfide bond로 연결되어 져 있으며(Ogawa et al., 1989), 각각의 subunit에 는 다수의 subunit이 포함되어져 있다. 7S는 알레 르기를 유발하는 단백질을 포함하고 있으며, 11S에 비하여 황함유 아미노산인 methionine과 cystein의 함량이 낮기 때문에 영양학적 가치가 떨어지는 것으 로 알려져 있다. 7S와 11S의 함유량은 부의상관 관 계를 가지고 있어, 7S의 함량을 줄여 11S 함량을 늘 릴 수 있다(Kitamura et al., 1984). 그러므로 영양 적, 기능적으로 떨어지는 7S의 양을 줄이는 육종이 필요하고 이를 위해 7S의 α', α, β-subunit이 각각 결핍 되거나, 저하된 유전자원이 보고되고 있다(Hajika et al., 1996;Kitamura & Kaizuma, 1981). 일본에 서는 7S 단백질 함량이 낮은 Yumeminori (α'-and α-subunits absent, low level of the β-subunit) 가 육성되어져 있다(Takahashi et al., 2004).

    성숙 콩 종실에 함유되어 있는 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질은 181개의 아미노산으로 구 성된 소화 억제 단백질로써 분자량은 21.5 Kda이 며, 콩에 존재하는 대표적인 비영양학적 성분으로 분류된다고 하였다(Kunitz, 1947). Friedman et al. (1991)은 KTI 단백질은 콩 종자에 나타나는 트립신 의 활동을 약 80%정도 억제하여 콩 단백질을 흡수 하는데 있어서 낮은 소화율을 유발시킨다고 하였다. 콩 단백질에는 12가지의 eletrophoretic form이 존 재하며 이러한 형태에는 Tia, Tib (Singh et al., 1969), Tic (Hymowitz, 1973), Tid (Zhao & Wang, 1992), Tie (Wang et al., 2004), Ti-null type (Orf & Hymowitz, 1979), Tif 와 Tibi5 (Wang et al., 2004)가 알려져 있다. KTI 단백질은 Molecular linkage map A2 (chromosome 8번)에 위치하는 Ti 유전자에 의해 조절되는데 recessive allele (ti)일 경우 KTI 단백질이 유전적으로 결핍된 형태이며 (Orf & Hymowitz, 1979), KTI 단백질이 결핍되어 진 유전자원으로는 PI157440, PI196168등이 있다. 현재 국내에는 수확 후 성숙 콩 종실에서 KTI 단백 질이 유전적으로 없는 몇 개의 품종이 육성되어 있 다(Chung, 2009). 따라서 본 연구는 유색콩 품종은 수입콩과 차별화가 쉽고 기능성이 우수하여 소비가 점차 증가할 것으로 예상되어 성숙 콩 종실에서 품 질 및 영양성을 저하시키는 KTI 단백질과 7S α' subunit 단백질이 모두 유전적으로 제거된 갈색 종 피를 가진 cgy1cgy1titi 유전자형을 선발하여 품종화 및 육종모본으로 활용하기 위하여 진행되었다.

    재료 및 방법

    1 육종집단의 창성

    수확된 종자에서 콩의 품질, 가공 적성 및 기능성 을 저하시키는 7S α'-subunit 단백질과 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질이 모두 없으면서 갈색 종피색을 가진 cgy1cgy1titi 유전자형을 가진 계통을 육성하기 위하여 장려품종과 PI506876 자원 을 이용하여 교배를 통하여 F1 종자를 얻은 후 F1 식물체로 양성하면서 잡종성을 확인 한 후 성숙기에 F2 종자를 얻었다. 각각의 F2 종자를 이용하여 7S α'-subunit 단백질이 없는 종자를 선발하여 포장에 서 F2 개체로 전개하면서 갈색 종피색을 가진 개체 를 선발하여 P1 모본으로 이용하였다. P1 모본과 부 본으로 “Gaechuck#2”을 이용하여 육종집단을 창성 하였다. 이용된 2개의 모본에 대한 형질은 Table 1 과 같다.

    P1 모본은 성숙 종실에서 7S α'-subunit 단백질 이 존재하지 않으며(cgy1cgy1 유전자형) KTI 단백 질은 존재하며(TiTi 유전자형), 종피색은 갈색이다. P2 모본으로 이용된 “Gaechuck#2”는 성숙 종실에 서 7S α'-subunit 단백질이 존재하며(Cgy1Cgy1 유 전자형) KTI 단백질은 존재하지 않는(titi 유전자 형) 노란콩 품종이다. 양 모본의 교배를 통하여 F1 종자를 얻은 후 F1 식물체로 양성하면서 잡종성을 확인 한 후 성숙기에 F2 종자를 얻었다. 각각의 F2 종자를 이용하여 7S α'-subunit 단백질과 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질이 모두 없는 cgy1 cgy1titi 유전자형 종자를 선발하여 포장에서 F2 개 체로 전개하면서 갈색 종피색을 가진 개체를 선발하 였다. 선발된 F2 계통을 포장에서 F3 계통으로 유지 시켜 7S α'-subunit 및 KTI 단백질의 부재를 확인 하였다. 포장에서 갈색 종피색을 가진 F4 계통을 전 개하여 경장, 100립중, 제색 등 농업적 형질을 평가 하였다. 육성과정은 Fig. 1과 같다.

    2 7S α'-subunit 단백질 분석

    양 모본의 교배를 통해 얻어진 F2 종자의 7S α'-subunit 단백질의 존재 여부를 분석하기 위해 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 모본의 종자 및 각각의 F2 종자로부터 배가 상하지 않도록 각 종자의 자엽 일부를 절취하여 시료로 사용하였다. 각 시료를 막자 사발에 넣고 막자로 찧어서 가루 로 만든 다음 0.5 ㎖의 buffer [1 M Tris, pH 8.0]를 첨가하고 미세하게 갈아 준 후 1.5 ㎖의 microcentrifuge tube에 옮겨 4℃에서 15,000 rpm 25분간 원심분리를 하였다. 세 층으로 분리된 것 중 제일 위층의 얇은 막 부분을 제거하고 그 아래층의 단백질 부분을 새 microcentrifuge tube로 옮겨 정 제와 정량을 하고 SDS-PAGE의 gel을 이용하는 방 법 중 discontinuous gel 방법을 이용하여 전기영동 을 통해 분석을 실시하였다. 두 개의 유리판을 ethanol로 깨끗이 닦고 유리판 사이에 spacer를 끼워 넣은 다음 주위를 테이프로 감았다. Running gel로 pH8.8 기준의 12% Acrylamide gel 용액을 제조하 여 두 유리판 사이에 붓고 n-butanole을 조심스럽게 첨가한 뒤 gel을 굳혔다. Gel이 굳을 만큼 충분한 시 간이 지난 뒤 gel이 굳으면 상층의 n-butanole을 버 리고 pH6.8 기준의 5% Acrylamide gel 용액의 stacking gel을 붓고 comb를 꽂고 충분한 시간을 주어 stacking gel 을 굳혔다. Gel이 굳는 동안 종 실에서 추출한 각 단백질과 5X sample buffer를 5 ㎕씩 혼합한 뒤 혼합액이 담긴 microcentrifuge tube를 끓는 물에 5분간 담근 후 만들어진 gel에 분 주하여 70 v에서 16시간 동안 loading하여 전기영동 을 하였다. 전기영동이 끝난 gel을 staining solution (0.25 g coomassie brilliant blue R250, 10% acetic acid, 45% methanol)에 충분히 염색을 한 다음 destaining solution (10% acetic acid, 45% methanol)에 탈색을 시켜 72 kDa에서 α'-subunit 단백질 유무를 확인하였다.

    3 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질 분석

    KTI 단백질의 유무는 Western blot 방법을 이용 하였다. 선발개체×Gaechuck#1의 조합으로 얻어진 녹색자엽을 가진 F2 종자로부터 배를 제외한 성숙 자엽을 절취하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단 백질 시료의 농도를 정량한 후 12% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 하였다. Gel에서의 분리된 단 백질을 PVDF membrane에 옮긴 후 2시간 동안 blocking buffer (20 mM Tris (pH7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, 5% nonfat dried milk)에 담갔다. 이후 KTI antibody와 Lectin antibody를 1시간 동안 반응시킨 후 TTBS buffer (20 mM), Tris (pH7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 5분씩 3번 씻고, 2차 antibody와 1시간 동안 반응 시켰다. 그런 후 다시 TTBS buffer에 5분씩 3번 씻 은 후 ECL kit를 사용하여 X-ray film에서 KTI 단 백질 존재여부를 확인하였다.

    결과 및 고찰

    양 모본의 교배로부터 106개의 F2 종자를 얻은 후 각각의 F2 종자로부터 배를 제외한 성숙 자엽을 절 취하여 추출된 단백질을 이용하여 7S α'-subunit 단백질과 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질 이 모두 없는 cgy1cgy1titi 유전자형을 가진 8개의 F2 종자를 얻었다. 이러한 결과는 7S α'-subunit 및 KTI 단백질의 존재여부는 single 유전자에 의해 지배된다는 이전의 연구결과와 일치하였다(Orf & Hymowitz, 1979;Kitamura et al., 1984). 선발된 8개의 F2 종자를 파종하여 8개의 F2 식물체를 수확 하였다. 수확된 F2 계통 중에서 갈색 종피를 가진 3 개의 계통을 선발하였다. 선발된 3개의 계통을 포장 에 전개하여 F3 계통으로 전개하면서 농업적 형질이 양호한 1개의 계통을 선발하였다. 선발된 계통의 random F4 종자를 이용한 7S α'-subunit 및 KTI 단백질의 부재에 대한 검증결과는 Fig. 2와 같다.

    일반콩은 Cgy1Cgy1TiTi 유전자형을 가져 성숙 콩 종실에서 7S α'-subunit 및 KTI 단백질이 모두 존 재하는 반면 선발계통은 cgy1cgy1titi 유전자형을 가져 성숙 콩 종실에서 7S α'-subunit 및 KTI 단 백질이 부재한 상태로 유전적으로 고정된 상태임을 나타내었다(Orf & Hymowitz, 1979;Kitamura et al., 1984). 선발된 계통의 random F4 종자를 포 장에 파종하여 F4 계통으로 유지시키면서 얻어진 농업적 형질은 Table 2와 같다.

    선발된 계통의 경장은 65 cm 정도였으며 백립중 은 24.2 g으로 중립이었다. 종피색은 갈색이고 제 색은 하얀색을 나타내었고 성숙 자엽색은 노란색이 었다. 선발계통의 성숙기 초형과 수확 후 F5 종자 모양은 Fig. 3과 같다.

    성숙 상태에서의 초형은 유한신육형이며 종피색 은 갈색을 나타내었다. 본 연구를 통하여 선발된 계통은 7S α'-subunit 단백질 및 Kunitz Trypsine Inhibitor (KTI) 단백질이 동시에 없는 유색콩 품종 육성을 위한 중간모본으로 이용될 수 있을 것으로 사료되었다.

    Figure

    JALS-53-4-29_F1.gif

    Scheme for development new soybean genotype with 7S α'-subunit and Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) protein free (cgy1cgy1titi genotype) and brown seed coat.

    JALS-53-4-29_F2.gif

    Confirmation of Kunitz trypsin inhibitor (KTI) protein free (□) and 7S α'-subunit protein free (Ⓑ) in the general cultivar (C) and new genotype (S). Arrows are KTI protein band (21.5kDa) and 7S α'-subunit protein band (72kDa). +, -: presence and absence of KTI and 7S α'-subunit proteins, respectively.

    JALS-53-4-29_F3.gif

    Plant type (left) at maturity and seed shape (right) harvested of new soybean strain with cgy1cgy1 titi genotype.

    Table

    Flower color, seed coat color, hilum color, and genotype for Cgy1 (cgy1) and Ti (ti) alleles of two parents used in this experiment

    Agronomic traits of new strain developed in this experiment

    Reference

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