서론

콩[Glycine max (L.) Merr.] 종자에는 대체적으 로 수용성 탄수화물 11%, 단백질 40%, 지방 21% 정도의 3대 영양소가 골고루 함유되어져 있어 예로 부터 양질의 단백질과 지질의 공급원으로 널리 이 용되어져 왔다(Openshaw & Hardley, 1978). 콩 종 실 단백질은 양과 질적인 면에서 식물성 단백질 중 가장 우수한 것으로 알려져 있다. 그러나, 성숙 콩 종실에는 Kunitz trypsin inhibitor (KTI) 단백질, P34 단백질, 7S 단백질 등 콩의 품질과 기능성을 떨어뜨리는 성분이 다수 존재하고 있다. 콩 종실 단 백질은 7S (β-conglycinin)와 11S (glycinin)의 비 율이 약 70% 정도이고(Thanh & Shibasaki, 1978), 7S 단백질은 polypeptides인 α', α, β-subunit을 가지고 있으며(Takahashi et al., 2004), 각각의 subunit의 분자량은 대략 72, 76, 53 k dalton으로 알려져 있다. 11S 단백질은 산과 염기 subunit로 구 성되어져 있고, 이들은 disulfide bond로 연결되어 져 있으며(Ogawa et al., 1989), 각각의 subunit에 는 다수의 subunit이 포함되어져 있다. 7S는 알레 르기를 유발하는 단백질을 포함하고 있으며, 11S에 비하여 황함유 아미노산인 methionine과 cystein의 함량이 낮기 때문에 영양학적 가치가 떨어지는 것으 로 알려져 있다. 7S와 11S의 함유량은 부의상관 관 계를 가지고 있어, 7S의 함량을 줄여 11S 함량을 늘 릴 수 있다(Kitamura et al., 1984). 그러므로 영양 적, 기능적으로 떨어지는 7S의 양을 줄이는 육종이 필요하고 이를 위해 7S의 α', α, β-subunit이 각각 결핍 되거나, 저하된 유전자원이 보고되고 있다(Hajika et al., 1996;Kitamura & Kaizuma, 1981). 일본에 서는 7S 단백질 함량이 낮은 Yumeminori (α'-and α-subunits absent, low level of the β-subunit) 가 육성되어져 있다(Takahashi et al., 2004).

성숙 콩 종실에 함유되어 있는 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질은 181개의 아미노산으로 구 성된 소화 억제 단백질로써 분자량은 21.5 Kda이 며, 콩에 존재하는 대표적인 비영양학적 성분으로 분류된다고 하였다(Kunitz, 1947). Friedman et al. (1991)은 KTI 단백질은 콩 종자에 나타나는 트립신 의 활동을 약 80%정도 억제하여 콩 단백질을 흡수 하는데 있어서 낮은 소화율을 유발시킨다고 하였다. 콩 단백질에는 12가지의 eletrophoretic form이 존 재하며 이러한 형태에는 Ti^a, Ti^b (Singh et al., 1969), Ti^c (Hymowitz, 1973), Ti^d (Zhao & Wang, 1992), Ti^e (Wang et al., 2004), Ti-null type (Orf & Hymowitz, 1979), Ti^f 와 Ti^bi5 (Wang et al., 2004)가 알려져 있다. KTI 단백질은 Molecular linkage map A2 (chromosome 8번)에 위치하는 Ti 유전자에 의해 조절되는데 recessive allele (ti)일 경우 KTI 단백질이 유전적으로 결핍된 형태이며 (Orf & Hymowitz, 1979), KTI 단백질이 결핍되어 진 유전자원으로는 PI157440, PI196168등이 있다. 현재 국내에는 수확 후 성숙 콩 종실에서 KTI 단백 질이 유전적으로 없는 몇 개의 품종이 육성되어 있 다(Chung, 2009). 따라서 본 연구는 유색콩 품종은 수입콩과 차별화가 쉽고 기능성이 우수하여 소비가 점차 증가할 것으로 예상되어 성숙 콩 종실에서 품 질 및 영양성을 저하시키는 KTI 단백질과 7S α' subunit 단백질이 모두 유전적으로 제거된 갈색 종 피를 가진 cgy₁cgy₁titi 유전자형을 선발하여 품종화 및 육종모본으로 활용하기 위하여 진행되었다.

재료 및 방법

1 육종집단의 창성

수확된 종자에서 콩의 품질, 가공 적성 및 기능성 을 저하시키는 7S α'-subunit 단백질과 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질이 모두 없으면서 갈색 종피색을 가진 cgy₁cgy₁titi 유전자형을 가진 계통을 육성하기 위하여 장려품종과 PI506876 자원 을 이용하여 교배를 통하여 F₁ 종자를 얻은 후 F₁ 식물체로 양성하면서 잡종성을 확인 한 후 성숙기에 F₂ 종자를 얻었다. 각각의 F₂ 종자를 이용하여 7S α'-subunit 단백질이 없는 종자를 선발하여 포장에 서 F₂ 개체로 전개하면서 갈색 종피색을 가진 개체 를 선발하여 P1 모본으로 이용하였다. P1 모본과 부 본으로 “Gaechuck#2”을 이용하여 육종집단을 창성 하였다. 이용된 2개의 모본에 대한 형질은 Table 1 과 같다.

P1 모본은 성숙 종실에서 7S α'-subunit 단백질 이 존재하지 않으며(cgy₁cgy₁ 유전자형) KTI 단백 질은 존재하며(TiTi 유전자형), 종피색은 갈색이다. P2 모본으로 이용된 “Gaechuck#2”는 성숙 종실에 서 7S α'-subunit 단백질이 존재하며(Cgy₁Cgy₁ 유 전자형) KTI 단백질은 존재하지 않는(titi 유전자 형) 노란콩 품종이다. 양 모본의 교배를 통하여 F₁ 종자를 얻은 후 F₁ 식물체로 양성하면서 잡종성을 확인 한 후 성숙기에 F₂ 종자를 얻었다. 각각의 F₂ 종자를 이용하여 7S α'-subunit 단백질과 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질이 모두 없는 cgy1 cgy1titi 유전자형 종자를 선발하여 포장에서 F₂ 개 체로 전개하면서 갈색 종피색을 가진 개체를 선발하 였다. 선발된 F₂ 계통을 포장에서 F₃ 계통으로 유지 시켜 7S α'-subunit 및 KTI 단백질의 부재를 확인 하였다. 포장에서 갈색 종피색을 가진 F₄ 계통을 전 개하여 경장, 100립중, 제색 등 농업적 형질을 평가 하였다. 육성과정은 Fig. 1과 같다.

2 7S α'-subunit 단백질 분석

양 모본의 교배를 통해 얻어진 F₂ 종자의 7S α'-subunit 단백질의 존재 여부를 분석하기 위해 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 모본의 종자 및 각각의 F₂ 종자로부터 배가 상하지 않도록 각 종자의 자엽 일부를 절취하여 시료로 사용하였다. 각 시료를 막자 사발에 넣고 막자로 찧어서 가루 로 만든 다음 0.5 ㎖의 buffer [1 M Tris, pH 8.0]를 첨가하고 미세하게 갈아 준 후 1.5 ㎖의 microcentrifuge tube에 옮겨 4℃에서 15,000 rpm 25분간 원심분리를 하였다. 세 층으로 분리된 것 중 제일 위층의 얇은 막 부분을 제거하고 그 아래층의 단백질 부분을 새 microcentrifuge tube로 옮겨 정 제와 정량을 하고 SDS-PAGE의 gel을 이용하는 방 법 중 discontinuous gel 방법을 이용하여 전기영동 을 통해 분석을 실시하였다. 두 개의 유리판을 ethanol로 깨끗이 닦고 유리판 사이에 spacer를 끼워 넣은 다음 주위를 테이프로 감았다. Running gel로 pH8.8 기준의 12% Acrylamide gel 용액을 제조하 여 두 유리판 사이에 붓고 n-butanole을 조심스럽게 첨가한 뒤 gel을 굳혔다. Gel이 굳을 만큼 충분한 시 간이 지난 뒤 gel이 굳으면 상층의 n-butanole을 버 리고 pH6.8 기준의 5% Acrylamide gel 용액의 stacking gel을 붓고 comb를 꽂고 충분한 시간을 주어 stacking gel 을 굳혔다. Gel이 굳는 동안 종 실에서 추출한 각 단백질과 5X sample buffer를 5 ㎕씩 혼합한 뒤 혼합액이 담긴 microcentrifuge tube를 끓는 물에 5분간 담근 후 만들어진 gel에 분 주하여 70 v에서 16시간 동안 loading하여 전기영동 을 하였다. 전기영동이 끝난 gel을 staining solution (0.25 g coomassie brilliant blue R250, 10% acetic acid, 45% methanol)에 충분히 염색을 한 다음 destaining solution (10% acetic acid, 45% methanol)에 탈색을 시켜 72 kDa에서 α'-subunit 단백질 유무를 확인하였다.

3 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질 분석

KTI 단백질의 유무는 Western blot 방법을 이용 하였다. 선발개체×Gaechuck#1의 조합으로 얻어진 녹색자엽을 가진 F₂ 종자로부터 배를 제외한 성숙 자엽을 절취하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단 백질 시료의 농도를 정량한 후 12% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 하였다. Gel에서의 분리된 단 백질을 PVDF membrane에 옮긴 후 2시간 동안 blocking buffer (20 mM Tris (pH7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, 5% nonfat dried milk)에 담갔다. 이후 KTI antibody와 Lectin antibody를 1시간 동안 반응시킨 후 TTBS buffer (20 mM), Tris (pH7.5), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 5분씩 3번 씻고, 2차 antibody와 1시간 동안 반응 시켰다. 그런 후 다시 TTBS buffer에 5분씩 3번 씻 은 후 ECL kit를 사용하여 X-ray film에서 KTI 단 백질 존재여부를 확인하였다.

결과 및 고찰

양 모본의 교배로부터 106개의 F₂ 종자를 얻은 후 각각의 F₂ 종자로부터 배를 제외한 성숙 자엽을 절 취하여 추출된 단백질을 이용하여 7S α'-subunit 단백질과 Kunitz Trypsin Inhibitor (KTI) 단백질 이 모두 없는 cgy₁cgy₁titi 유전자형을 가진 8개의 F₂ 종자를 얻었다. 이러한 결과는 7S α'-subunit 및 KTI 단백질의 존재여부는 single 유전자에 의해 지배된다는 이전의 연구결과와 일치하였다(Orf & Hymowitz, 1979;Kitamura et al., 1984). 선발된 8개의 F₂ 종자를 파종하여 8개의 F₂ 식물체를 수확 하였다. 수확된 F₂ 계통 중에서 갈색 종피를 가진 3 개의 계통을 선발하였다. 선발된 3개의 계통을 포장 에 전개하여 F₃ 계통으로 전개하면서 농업적 형질이 양호한 1개의 계통을 선발하였다. 선발된 계통의 random F₄ 종자를 이용한 7S α'-subunit 및 KTI 단백질의 부재에 대한 검증결과는 Fig. 2와 같다.

일반콩은 Cgy₁Cgy₁TiTi 유전자형을 가져 성숙 콩 종실에서 7S α'-subunit 및 KTI 단백질이 모두 존 재하는 반면 선발계통은 cgy₁cgy₁titi 유전자형을 가져 성숙 콩 종실에서 7S α'-subunit 및 KTI 단 백질이 부재한 상태로 유전적으로 고정된 상태임을 나타내었다(Orf & Hymowitz, 1979;Kitamura et al., 1984). 선발된 계통의 random F₄ 종자를 포 장에 파종하여 F₄ 계통으로 유지시키면서 얻어진 농업적 형질은 Table 2와 같다.

선발된 계통의 경장은 65 cm 정도였으며 백립중 은 24.2 g으로 중립이었다. 종피색은 갈색이고 제 색은 하얀색을 나타내었고 성숙 자엽색은 노란색이 었다. 선발계통의 성숙기 초형과 수확 후 F5 종자 모양은 Fig. 3과 같다.

성숙 상태에서의 초형은 유한신육형이며 종피색 은 갈색을 나타내었다. 본 연구를 통하여 선발된 계통은 7S α'-subunit 단백질 및 Kunitz Trypsine Inhibitor (KTI) 단백질이 동시에 없는 유색콩 품종 육성을 위한 중간모본으로 이용될 수 있을 것으로 사료되었다.