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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.53 No.4 pp.45-53
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2019.53.4.45

Evaluation of Antagonistic Activities of Burkholderia cepacia KF1 strain against the Pepper Anthracnose Pathogen Colletotrichum scovillei in South Korea

Hyun-Hoo Park, Hee-Yeong Kim, Byung-Seoung Park, Teng Fu, Kyoung Su Kim*
Division of Bio-Resource Sciences and BioHerb Research Institute, Kangwon National University, Chuncheon, 24341, Korea
Corresponding author: Kyoung Su Kim Tel: +82-33-250-6435 Fax: +82-33-259-5558 E-mail: kims@kangwon.ac.kr
July 4, 2019 August 6, 2019 August 10, 2019

Abstract


Pepper (Capsicum annuumm L.) is an economically important crop in the world. However, pepper anthracnose caused by Colletotrichum species is a major limiting factor not only in pepper production, but also for marketability. In this study, in order to find a biological control agent for pepper anthracnose caused by C. scoviilei, we confirmed antagonistic activities of Burkholderia cepacia KF1 that was isolated from Cheonma mountain. The KF1 strain was identified based on 16S rRNA and recA genome sequence analysis. The mycelial inhibition rate of KF1 was 66.0% against C. scovillei, and the germination rates of C. scovillei by treatment 1×105, 106, 107, 108 cfu/mL each concentration were 7.8%, 4.3%, 1.2%, and 0%, respectively. We also confirmed that KF1 was effective in inhibiting the mycelial growth and conidial germination of C. scovillei, and produced plant growth promotion rhizobacteria, antibiotics and cell wall degrading enzymes in vitro. Our study supports that B. cepacia KF1 could be used as a potential biological control agent against pepper anthracnose disease.



고추탄저병균 Colletotrichum scovillei에 대한 Burkholderia cepacia KF1의 길항 활성 검정

박 현후, 김 희영, 박 병성, 부 등, 김 경수*
강원대학교 농업생명과학대학 생물자원과학부

초록


고추는 전 세계적으로 중요한 경제작물이다. 하지만, 매년 Colletotrichum species에 의해 발생하는 고추탄저병에 의해 상품성이 떨어지고 수량이 현저히 감소하여 많은 농가에 중대한 피해를 주는 주요 병해이기 때문에 방제대책이 절실히 요구되고 있다. 본 연구에서는 국내에 최근 발생한 C. scovillei에 대해 Burkholderia cepacia를 이용하여 길항 능력을 확인하였다. 16S rRNA와 recA 유전자 분석을 통 해 분리된 균주가 B. cepacia임을 확인하였고, 식물 생장 촉진 물질인 siderophore와 항진균 가수분해 효소인 protease, cellulase 생산을 기내 실험을 통해 확인하였다. 또한, C. scovillei에 대한 KF1의 균 사 생장 억제율은 66.0%로 나타났으며, 1×105, 106, 107, 108 cfu/mL의 길항 미생물 처리 농도에 따른 포자 발아율은 각각 7.8%, 4.3%, 1.2%, 0%로 확인되어 분리된 길항 미생물은 효과적으로 병원균의 균 사 생장 및 포자 발아를 억제하였다. 따라서 본 연구는 길항 미생물 B. cepacia KF1의 고추탄저병균에 대한 생물학적 방제제 자원으로서의 활용가능성을 제시하였다.



    National Research Foundation of Korea
    NRF-2017R1D1A1B03029622 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs
    918019-04

    서론

    고추(Capsicum annuum L.)는 국내 재배면적 28,824ha, 생산량 71,509톤에 달하는 주요한 경제 작물 중 하나이다(KOSTAT, 2018). 비타민 A, C 등의 함량이 높고, 우리나라 음식에서 빠질 수 없 는 중요한 식재료이며, 고추에 함유된 캡사이신 (capsicin)은 식욕을 촉진하고 대사작용을 활발하 게 하여 체내 지방축적을 방지하며 체내의 면역력 을 증진하는데 도움을 준다. 또한 염증 완화작용이 있어 소염제로써 활용되며, 혈액순환을 증진하고, 항암작용을 하는 것으로 알려져 있다(Kwon et al., 2014;Saxena et al., 2016).

    국가 농작물 병해충 관리시스템(RDA, http://ncpms. rda.go.kr)에 의하면 고추에 발생하는 주요 진균 병 해는 Cercospora capsici에 의한 갈색 점무늬병, Alternaria spp.에 의한 검은 곰팡이병, Phytophthora capsici 에 의한 역병 등 14개의 병해가 보고되어있 다. Colletotrichum spp.에 의한 고추탄저병은 수량 뿐 만 아니라, 과실의 상품성에도 중대한 피해를 입 히는 주요 병해로 잘 알려져 있다(Kim et al., 2015).

    고추 탄저병은 Colletotrichum 속(genus)에 의해 발생하며 고추 탄저병의 특징은 과실의 감염 부위 에서 움푹 패인 원형의 갈색 병반이 나타나고 병이 진전되면 병반에서 주황색의 분생포자 점액질 덩어 리들이 만들어지며, 병반이 점차 확대되어 결국 과 실 전체를 감싸게 된다. 병원균의 포자는 비바람, 폭우 등에 의해 전파되며 감염된 식물체 잔해나 토 양 내에서 자낭각과 균사의 형태로 월동한다. 병원 균의 감염 최적 온도는 20~24℃이며 상대습도 약 80%의 다습한 환경에서 발생한다(Pernezny K et al., 2003;Oo & Oh, 2016).

    특히 여름철의 고추 노지재배는 잦은 강우로 인해 포자 확산이 활발하고 높은 온·습도로 인하여 탄저 병이 발생하기 쉬운 상태가 된다. 따라서 탄저병을 방제하려면 수확기에 이르기까지 10회 이상의 잦은 약제 처리를 해야 한다. 하지만 화학농약은 생태계 에 부정적인 영향을 미칠 뿐만 아니라 식재료 등에 남아있는 화학물질로 인한 유해성은 반드시 해결해 야 할 문제이다. 이를 해결하기 위해 각종 친환경 자재나 미생물을 이용한 탄저병의 방제가 활발하게 시도되고 있다(Kang et al., 2015).

    최근 친환경 농업에 대한 관심이 증가하면서 유용 미생물을 이용하여 작물 병해를 방제하는 미생물제 제의 개발이 증가하고 있다. 고추 탄저병을 방제하기 위한 길항 미생물 연구에는 C. gloeosporioides의 방 제를 위한 Pseudomonas koreansis, Bacillus sp., Paenibacillus polymyxa (Park et al., 2006;Kim et al., 2007;Kim et al., 2016), C. acutatum의 방 제를 위한 Streptomyces padanus, Saccharomyces cerevisiae (Chi et al., 2012, Lopes et al., 2015) 등이 있지만, 최근 발생한 C. scovillei에 대한 생물 학적 방제에 대한 연구는 전무한 실정이다.

    본 연구에서는 국내 고추 탄저병 균주 C. scovillei 에 대해 활성을 보이는 길항 미생물 균주를 선발하 여, 길항 미생물이 생산하는 항진균 물질을 조사하 고 고추 탄저병을 방제 할 수 있는 유용 미생물로서 의 가능성을 조사하였다.

    재료 및 방법

    1 고추 탄저병균 및 길항 미생물 선발

    길항 미생물은 경기도 남양주시 화도읍 천마산 주변에서 살균제가 시용되지 않은 토양을 이용하 여 분리하였다. 길항 미생물의 분리를 위해 토양 을 1.5 mL tube에 덜어 넣고 멸균 증류수를 넣고 10-3~10-5의 농도로 희석하여 LB agar 배지에 100 μL 도말하여 28℃에서 1~2일간 배양하였다. 배양 후 단일 콜로니를 순수 분리하였다. 분리된 균주들은 20% glycerol에 현탁하여 –70℃ deep freezer에 보 관하였다. 고추 탄저병 균주 C. scovillei는 본 연구 실에서 분리한 균주를 사용하였으며, C. nymphaeae 는 농촌진흥청 국립농업과학원에서 분양 받아 사용 하였다.

    2 길항 미생물 DNA 추출, PCR 및 염기서열 분석

    길항 미생물의 genomic DNA 추출은 3 mL의 LB (Luria Bertani) 액체배지에 28℃, 185 rpm으로 16시간 동안 배양시킨 배양액을 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA)의 방법에 따라 추출하였다. 이후 정제된 DNA는 16S rRNA 염기 서열 분석을 위해 27F (`5-AGAGTTTGATCM TGGCTCAG-3`)와 1492R (`5-TACGGYTACCTTGT TACGACTT-3`) 프라이머를 이용하였고, recA 염기 서열 분석을 위해 recA forward (`5-AGGACGATT CATGGAAGAWAGC-3`)와 recA reverse (`5-GAC GCACTGGAYGMRTAGAACTT-3`) 프라이머를 이용 했다(Spilker et al., 2009). PCR은 98℃에서 30초 의 denaturation 후 98℃에서 10초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분의 과정을 30회 반복 후 72℃에서 7분간 반응시켰다. PCR 산물은 1% agarose gel에서 1X TAE(Tris-acetate-EDTA) buffer를 이용하여 15~20분 간 전기영동 후 Etbr로 염색하여 UV를 이용하여 밴 드를 확인하였다. 확인된 밴드는 DOKDO-prepTM Gel Extraction Kit (ELPIS BIOTECH, Korea)의 방법에 따라 정제한 후, 정제된 DNA는 염기서열 분 석을 위해 서울대학교 염기서열분석 서비스(http:// nicem.snu.ac.kr)를 이용하였다. 분석된 염기서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLASTN 프로그램을 이용하여 분석하였고 Mega7.0 프로그램 을 이용하여 bootstrap 1,000회 방법으로 neighborjoining 방법에 따라 수행하였다.

    3 길항 미생물 효소 활성 검정

    길항 미생물의 효소 활성 검정을 위해 길항 미생 물을 3 mL의 LB 액체배지에서 28℃, 185 rpm에서 16시간 동안 배양하여 배양액을 얻었다. LB 액체배 지의 성분을 제거하기 위해 얻어진 배양액을 2 mL microtube에 분주한 후 5,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 조심스럽게 따라버린 후 10 mM MgCl2 1 mL을 넣고 vortexing하여 길항 미생물 현 탁액을 얻었다.

    Protease 활성을 확인하기 위해 LB agar 배지에 3% skim milk powder를 첨가하여 만든 배지에 직경 5 mm의 cork borer를 이용하여 구멍을 뚫고 1×109 cfu/mL 농도의 길항 미생물 현탁액을 10 μL 접종하여 28℃에 3일간 배양한 뒤, clear zone 형 성을 관찰하여 protease 활성을 검정하였다(Sokol et al., 1979)

    Cellulase 활성을 확인하기 위해 LB agar 배지 에 Carboxymethyl Cellulose (CMC)를 1% 첨가하 여 만든 CMC agar 배지를 만들어 위와 같은 방법으 로 길항 미생물을 접종하여 7일간 배양한 뒤 0.1% congo red 용액에 15분간 배지를 염색하고 1M NaCl 용액에 15분간 배지를 담가 탈색시켜 clear zone 형성을 관찰하여 cellulase 활성을 검정하였 다(Budi et al., 2000;Singh et al., 2013).

    난용성 인산염 분해 활성이 있는지 알아보기 위 해 Ca3(PO4)2가 첨가된 Pikovskaya’s agar 배지를 사용하였고 위와 같이 길항 미생물을 접종하고 10일 간 배양한 뒤 clear zone 형성을 통해 인산 가용성 활성을 검정하였다.

    Siderophore 활성을 알아보기 위해 변형된 CAS (Chrome Azurol Sulfonate) 배지를 이용하였다(Han et al., 2015). 위와 같은 방법으로 길항 미생물을 접종하고 3일간 배양한 뒤 clear zone 형성을 관찰 하여 Siderophore 활성을 관찰하였다.

    4 길항 미생물의 항균 활성 범위 및 균사 생장 억제 검정

    고추 탄저병균 C. scovillei, C. nymphaeae , C. acutatum 3종과 옥수수 밑둥썩음병균 Fusarium verticillioides에 대해 길항 미생물이 균사 생장 억 제 효과를 갖는지 알아보기 위해 대치 배양으로 균 사 생장 억제 효과를 검정하였다. 대치 배양을 위해 90 mm의 페트리디쉬에 PDA 배지를 만들고 직경 5 mm의 cork borer로 가운데를 중심으로 3개의 구 멍을 내었다. 길항 미생물은 LB 액체배지에 28℃, 185 rpm으로 16시간 배양하였다. 배양된 배양액은 5,000 rpm에서 10분간 원심분리를 하여 상층액을 버리고 10 mM MgCl2 1 mL을 넣어 vortexing 하여 길항 미생물 현탁액을 얻었다. 얻어진 길항균 현탁 액은 1×109 cfu/mL 농도로 조정된 후 3개의 구멍 에 20 μL 씩 접종하였다. 그리고 고추 탄저병균 두 종을 55 mm PDA 배지에 25℃에서 4일간 암조건에 배양하였고, 배양된 병원균의 균사 끝 부분을 5 mm 직경의 cork borer로 agar plug를 분리하여 대치 배양을 위해 만들어진 PDA 배지 한 가운데에 접종 하였다. 접종 후 25℃에서 7일간 암조건에 배양하였 고, 억제된 균사의 길이를 측정하였다. 균사 생장 억제율은 다음과 같이 계산하였으며, 실험은 총 3회 3반복 실시하였다.

    균사생장 억제율 ( % ) = 무처리구의균사생장길이-처리구의균사생장길이 무처리구의균사생장길이 ×100

    5 고추 탄저병균 포자 발아 억제 검정

    고추 탄저병균 C. scovilleiC. nymphaeae의 포자를 얻기 위해 55 mm의 OA (Oatmeal agar media) 배지에서 25℃, 6일간 광조건에 배양하여 포자형성을 유도하였다. 각 병원균이 있는 배지에 5 mL의 멸균된 증류수를 붓고 1.5 mL tube 아랫 부분으로 표면을 조심스럽게 긁은 뒤 두 겹의 miracloth에 걸러 균사 잔여물들을 제거하였다. 이 로 얻어진 현탁액을 5,000 rpm으로 10분간 원심분 리하여 상층액을 천천히 버리고 다시 멸균된 증류수 를 1 mL 넣어 세척하는 과정을 2회 실시하였다. 이 후 hemocytometer를 이용하여 1×105 conidia/mL 로 농도를 맞춘 포자 현탁액을 얻었다. 길항미생물 현탁액은 1×105, 106, 107, 108 cfu/mL로 각각 맞 추었다. 포자 발아를 유도하기 위해 소수성 유리표 면에 10 μL를 접종하였고, 그 위에 각 농도의 세 균 현탁액 10 μL를 접종하였으며, 대조군으로 포 자 현탁액 10 μL 위에 멸균 증류수를 10 μL 접종 한 것과 LB 액체배지 10 μL를 접종한 것을 사용하 였다. 그리고 접종 16시간 후 포자 100개에 대한 부착기 형성률을 확인하였다. 실험은 3회 3반복 실 시하였다.

    결과 및 고찰

    1 길항 미생물 선발 및 동정

    경기도 남양주시 화도읍 천마산에서 살균제가 시 용되지 않은 토양을 이용하여 미생물들을 분리하였 다. 1차적으로 서로 다른 형태의 콜로니 12개를 선 발하였고 고추 탄저병균 2종 (C. nymphaeae, C. scovillei)과 대치 배양을 통해 항균 활성을 보이는 미생물을 선발하였다. 그 중 고추 탄저병균에 항진 균 활성을 보였던 길항 미생물에 대해 16S rRNA, recA 염기서열 분석을 진행한 결과 B. cepacia로 동정되었다. 다른 균주들과의 유연관계를 Fig. 1. 에 나타내었으며, KF1으로 명명하여 실험에 사용 하였다. 분리된 B. cepacia는 간균형의 그람 음성 세균으로 식물의 근권에서 식물의 생육 촉진과 생 물적 방제 효과를 동시에 나타내는 유용 미생물로 알려져 있다(Kim et al., 2016). 또한, 항균 물질 인 cepacin (Parker et al., 1984), pyrrolnitrin (Burkhead et al., 1994) quinolinone (Moon et al., 1996) 등을 생산하여 식물 병원균의 균사 생 장 및 포자 발아를 억제한다고 보고되어있다. 그리 고 식물 생장 물질인 IAA, siderophore를 생산하 여 작물의 뿌리 생육을 촉진하는 역할을 한다고 알 려져 있다(Kang et al., 2015;Kim et al., 2016). Burkholderia spp.를 이용한 생물학적 방제에 대 한 연구에는 고추 탄저병균 C. gloeosporioides의 방제를 위한 B. cepacia, B. lata (Kim et al., 2016;Hahm et al., 2018), 마늘 흑색 썩음 균핵 병균 Sclerotium cepivorum의 방제를 위한 B. pyrrocina (Han et al., 2013) 등이 연구되었다. B. cepacia complex에 속해 있는 일부 종들은 인체에 병을 일으킬 수 있는 기회감염병원체이며 건강한 사 람의 정상적인 점액 섬모 작용(normal mucociliary activity)에 의해 제거된다고 알려져 있다(Parke & Gurian-Sherman, 2001). B. cepacia complex에 속한 종을 생물학적 방제제로서의 이용하기 위해 서는 정확한 인체 병원성에 대한 연구가 선행되어 야 할 것으로 사료된다.

    2 길항 미생물 활성 효소 검정

    길항 미생물은 식물 병원균의 외막을 분해하는 가수분해효소를 이용하여 생육을 억제하거나 저지 시키는 능력을 가진 미생물을 말한다. 그래서 분리 한 길항 미생물이 분비하는 가수분해 효소 중 protease와 cellulose에 대한 활성과 식물 생장 촉 진에 도움을 주는 PGPR (Plant growth promoting rhizobacteria)의 역할이 가능한지 기내실험을 통해 확인하였다. 그 결과 B. cepacia KF1는 protease, cellulase 그리고 siderophore 효소 활성을 확인할 수 있는 배지에서 clear zone 형성을 함으로써 효소 활성을 확인하였다(Fig. 2). 이 외에도 Burkholderia spp.가 분비하는 효소는 amylase (Chatterjee et al., 2019), lipase (Xu et al., 2018), catalase (Khambalkar & Sridar, 2015), chitinase (Suryadi et al., 2018) 등이 알려져 있다. Siderophore는 식 물 병원균에 대한 억제 효과를 함과 동시에 철 이온 에 특이적으로 결합하여 식물이 이용할 수 없는 철 을 가용화시켜 식물 생장 촉진에 도움을 주는 PGPR 의 역할을 하여 작물체의 근권 정착능력을 증대시켜 식물의 성장이 촉진되어 수확량을 증가시킬 수 있다 (Kloepper et al., 1980;Bagg & Neilands, 1987).

    따라서 KF1은 cellulase와 protease를 분비하여 고추 탄저병균에 대한 항균 활성을 나타내고, siderophore 를 생산하여 식물 생장 촉진에 도움을 줄 것으로 사 료된다.

    3 길항 미생물의 항균 활성 범위 및 균사 생장 억제

    길항 미생물의 항균 활성 범위를 알아보기 위해 C. scovillei와 근연 관계가 가까운 고추 탄저병균인 C. nymphaeae, C. acutatum과 옥수수 밑둥 썩음 병균을 일으키는 F. verticillioides를 KF1과의 대치 배양을 통해 알아보았다(Fig. 3). 그 결과 C. scovillei 에 대해 66.0%의 균사 생장 억제율을 나타내 가장 높은 항균 활성을 보였으며, C.nymphaeaeC. acutatum에 대해 각각 64.6%, 59.7%의 억제율을 나 타내 우수한 활성을 보였다. 또한 F. verticillioides 에 대해 44.7%의 균사 생장 억제율을 보여 옥수수 밑둥 썩음병의 방제에도 적용할 수 있을 것으로 사 료된다.

    4 길항 미생물의 포자 발아 억제 효과

    고추 탄저병균의 분생포자는 식물체 표면을 인 식하여 발아관을 형성하고, 부착기를 형성하여 부 착기 내에 glycerol 등의 당의 축적을 일으켜 높 은 팽압을 만들고, 높아진 팽압에 의해 식물체 내 로 침입 균사가 침입하여 병을 일으킨다. 따라서 병원균의 발아 억제는 병 방제의 중요한 요소이 다. 길항 미생물 KF1의 포자 발아 억제 효과를 확인하기 위해서 길항균 현탁액을 고추 탄저병균 현탁액에 각 농도별로 처리한 후 16시간 후에 부 착기 형성율을 조사하였다(Fig. 4A). 그 결과 C. scovillei에 대한 1×105, 106, 107, 108 cfu/mL의 길항 미생물 처리 농도에 따른 포자 발아율은 각각 7.8%, 4.3%, 1.2%, 0%로 확인되었으며 무처리구 의 발아율은 80.7%이었다. C. nymphaeae는 각각 1.7%, 6.7%, 1.8%, 0%로 확인되었으며 무처리구는 78%로 확인되었다(Fig. 4B). 따라서 KF1은 고추 탄저병균의 균사 생장 및 포자 발아와 부착기 형성 을 억제하여 기주식물로의 침입을 막아 고추 탄저 병에 대한 생물학적 방제제로 사용할 수 있을 것으 로 기대된다.

    감사의 글

    본 연구는 한국연구재단(NRF-2017R1D1A1B0302 9622)과 미생물유전체전략연구사업단(918019-04)의 지원을 받아 수행된 것으로 이에 감사드립니다.

    Figure

    JALS-53-4-45_F1.gif

    A neighbor-joining tree based on 16S rRNA and recA gene sequences with 1,000 bootstrap replicates. DNA sequences were aligned using the ClustalW program in MEGA 7.0. Bar represents 0.2 substitutions per nucleotide sequences. The strain used in this study was marked in bold.

    JALS-53-4-45_F2.gif

    Enzyme activity assay in vitro. KF1 produced protease, cellulase and siderophore. Halo zone of cellulase assay plates was stained by 0.1% congo red. The plates of protease and siderophore were incubated for 3 days at 28℃ in the dark condition. The plates of cellulase and phosphate solubility were incubated for 7 days at 28℃ in the dark condition.

    JALS-53-4-45_F3.gif

    Mycelial growth inhibition tests using KF1 against Colletotrichum species and Fusarium verticillioides. (A): Dual culture tests for mycelial growth inhibition. The pathogens were cultured on PDA plates at 25℃ for 7 days. (B): Inhibition rate of mycelial growth was measured at 7 days after inoculation against C. scovillei, C. nymphaeae, C. acutatum and F. veticillioides. Error bars represent standard deviation of three replicates.

    JALS-53-4-45_F4.gif

    Germination inhibition assay. The concentration of conidial suspensions was 1×10⁵ conidia/mL. The control was treated with sterilized distilled water. The pictures were taken at 16 hours after inoculation. Scale bar=10 μm.

    Table

    Reference

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