Journal Search Engine
Search Advanced Search Adode Reader(link)
Download PDF Export Citaion korean bibliography PMC previewer
ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.53 No.2 pp.15-26
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2019.53.2.15

Evaluation and Method of In vitro Digestibility in Monogastric Animal Model

Lyeongin Kang1, Jin Seon Kim1, Sung Sill Lee1, Gyo-Moon Chu2, Jin Wook Kim1*
1Dept. of Animal Science & Biotechnology, Division of Applied Life Science(BK21 Plus), Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea
2Feed Technology Research Center, Nonghyup Feed Co., Ltd, Seoul, 05398, Korea
Corresponding author: Jin Wook Kim Tel: +82-55-772-1885 Fax: +82-55-772-1889 Email: jinkim@gnu.ac.kr
October 15, 2018 November 14, 2018 January 16, 2019

Abstract


An in vitro digestibility methods have been developed to mimic an in vivo system in the past decades. Because the in vivo techniques cause high cost, intensive labor, longer research periods and ethnical problems. In this review, the digestive systems from stomach to large intestine of pig as a monogastric animal were addressed to understand an in vivo digestion. The innovative in vitro technique using the Daisy II incubator was performed and the in vitro ileal and fecal dry matter (DM) digestibility of corn, rice, wheat and barley was determined.



단위동물 모델에서 In vitro 소화율 측정과 평가

강 령인1, 김 진선1, 이 성실1, 추 교문2, 김 진욱1*
1경상대학교 응용생명과학부(BK21 Plus) 축산생명학과(농업생명과학연구원)
2농협사료 사료기술연구소

초록


In vivo 측정법은 비용이 많이 들고 연구기간이 길며 동물복지 측면에서 여러 문제점이 있다. 이에 대한 대안으로 지난 수십년간 in vitro 소화율 측정법이 개발되어 왔다. 본 총설에서는 대표적인 단위 동물로써 사양되고 있는 돼지의 소화기관 특징 및 소화작용에 대한 논하였다. 또한, 최근에 개발된 daisy II incubator 를 이용한 in vitro 방법을 통해 돼지에서 주요 곡류사료로 이용되고 있는 옥수수, 쌀, 소맥 및 대맥의 회장 및 전분 건물소화율을 측정하였다.



    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs
    315022-3 Gyeongsang National University

    서론

    양돈산업에서 사료비의 비중은 ~50% 이상으로 대부분의 원료사료를 수입에 의존하고 있는 것이 현 실이다. 원료사료의 적정급여를 통해 최적의 생산성 을 유지하고 과다 급여로 발생하는 분뇨의 배출에 의한 환경오염을 최소화하려는 노력은 연구자 뿐만 아니라 생산현장에서도 꾸준히 시도되고 있다.

    돼지에서 대표적으로 사용되는 에너지사료는 옥 수수, 소맥 및 대맥 등이 있으며 단백질 사료로 대 두박이 많이 사용되고 있다. 또한, 사료값의 상승 으로 다양한 부산물 및 섬유질사료가 사용되고 있 다(Bindelle et al., 2008;Agudelo, 2009). 따라서 영양학적 측면에서 볼 때 각각의 원료사료에 대해 소화율을 설정하는 것은 기본이 되는 중요한 연구과 제라고 할 수 있으며, 지난 수십년에 걸쳐 연구가 진행되고 있다. 그러나 실제 돼지를 이용한 in vivo 소화율 측정은 상당한 연구기간이 필요하며 비용이 많이 드는 단점이 있어 in vitro 소화율 측정법이 대안으로 제시되고 있으며 꾸준히 개발되고 있다.

    본 총설에서는 돼지의 소화기관의 특징 및 소화작 용에 대해 설명하고, 현재까지 연구되고 있는 다양 한 in vitro 소화율 측정법에 대해 논하고자 한다. 특히 최근에 개발된 daisy II incubator를 이용한 방법을 소개하고 곡류사료의 in vitro 회장(ileal) 및 전분(fecal) 건물(dry matter) 소화율 측정법을 제시하고자 한다.

    소화 작용과 소화율

    1 돼지의 소화작용

    우리나라에서 사육되는 대표적인 경제동물은 소 화생리 과정을 기준으로 반추동물인 소, 면양 및 염소와 단위동물인 돼지, 닭(육계 및 산란계) 및 오 리 등으로 구분할 수 있다. 반추동물은 기본적으 로 4개의 위를 가지고 있으며 특히 반추위라고 명명 된 1위에서 반추미생물의 작용에 의해 사료의 분해 및 재합성이 이루어지는 특징을 가지고 있다. 반면 에, 단위동물은 인간과 같이 위가 1개로 구성되어 있으며 반추동물의 제 4위와 같은 소화작용을 하여 영양소의 분해를 촉진한다(Kim, 2012).

    일반적으로 섭취된 사료는 가수분해 작용을 거쳐 아미노산, 당, 지방, 및 지방산 등과 같은 영양소로 분해되고 소화기를 통해 흡수된다. 이러한 일련의 작용을 소화작용이라 한다. 단위동물에 속하는 돼 지의 소화작용은 크게 3 단계로 구분된다. 첫째, 사 료가 입을 통해 섭취되어 위에서 분해 및 흡수가 일어나는 작용, 둘째, 위에서 배출된 사료의 분해물 이 소장(십이지장-공장-회장)에서 분해 및 흡수되 는 작용, 마지막으로 소장에서 이전된 분해물이 대 장(맹장-결장-직장)에서 대장 미생물에 의해 분해 및 흡수가 일어나는 작용으로 흡수되지 못한 최종 분해물은 분으로 배설된다. 또한 간 및 췌장과 같 은 장기의 협력에 의해 이러한 작용이 촉진된다. Wilfart et al.(2008)에 의하면 소화작용은 섭취 (Ingestion), 가수분해(Hydrolysis), 흡수(Absorption), 분비(Secretion) 및 영양소의 전변(Transition of ingested nutrients)을 포함한 복잡한 생리현상이며 소화계에 의해 수행되는 다기능성 대사작용이라고 한다. 사료의 소화관내 체류시간(Retention time)은 소화기관에 따라 상당한 차이가 있으며, 위-소장에 서는 대략 2~16 h, 대장에서는 20~40 h 정도로 알려져 있으며 특히 사료내 섬유소 함량 및 조성에 따라 40 h 이상 대장에 체류한다(Freire et al., 2000;Metzier & Mosenthin, 2008).

    1.1 위의 소화작용

    위는 위선(gastric gland) 에서 분비하는 HCl에 의해 pH=2.5정도로 유지되며 이러한 환경에 의해 입과 식도을 통해 넘어온 사료는 물리적으로 결합조 직이 분해되며 미생물의 사멸이 촉진되고 사료내 단 백질 및 효소의 변성과 불활성화가 촉진된다(Wang et al., 2003;Kim, 2012). 위에서 분비되는 효소로 는 pepsin이 있으며 단백질 분해효소로써 HCl에 의 해 불활성형인 pepsinogen이 활성형인 pepsin으로 전변된다(De Rouchey et al., 2009). 돼지는 섬유 소를 분해하는 효소의 활성이 매우 낮고, 위의 pH 로 인해 미생물의 활성이 매우 낮기 때문에 사료내 섬유소를 분해하지 못한다(Wang et al., 2003).

    1.2 소장의 소화작용

    돼지의 소장은 사료의 소화 및 흡수의 중추적 기 관으로 십이지장(duodenum), 공장(jejunum) 및 회 장(ileum)으로 구성되어 있으며, 이밖에 췌장, 담낭 및 간 등이 관여되어 있다. 십이지장은 담관 및 췌 장관과 연결되어 지방의 유화작용을 하는 담즙산 및 췌장 소화효소(pancreatic enzymes)가 췌장으로 유 입되는 장소이다. 췌장의 내분비선에서는 insulin 및 glucagon이 분비되어 일차적으로 혈당을 조절 하고, 외분비선에서 췌장액(수분 및 중탄산염)이 분 비되어 pH=4~5로 유지한다. 또한, 탄수화물, 단백 질 및 지방 분해효소를 분비하여 십이지장으로 배 출한다(Kim, 2012). 사료내 전분(starch)은 사료내 탄수화물의 주요 구성성분으로 췌장에서 분비된 alpha-amylase, gluco-amylase에 의해 분해되며, 돼지에 있어서는 이유초기에는 활성이 낮으나 일령 이 증가하여 고형물 사료의 섭취가 증가하면 활성도 가 증가한다(Sun et al., 2006). 췌장에서 분비되는 단백질 분해효소는 zymogen 형(불활성형)으로 분비 되는데 소장의 융모에 존재하는 enterokinase에 의해 활성형인 trypsin, chymotrypsin, carboxypeptidase, elastase으로 전변되어 단백질을 펩타이드(peptide) 및 아미노산으로 분해한다. 췌장의 지방 분해효소인 pancreatic lipase는 중성지방을 free fatty acids 및 2-monoglyceride로 분해하고 담즙산과 결합하여 micelle를 형성한 후에 단순확산(simple diffusion) 으로 소장의 미세융모로 흡수된다. 미세융모에는 이 당류를 분해하는 sucrase, lactase, maltase 및 isomaltase, 펩타이드를 분해하는 aminopeptidase 가 존재하며, 촉진확산 및 능동수송을 통해 분해물 들을 흡수한다(Kim, 2012). 또한, 비타민과 광물질 등도 소장말단인 회장에서 대부분 흡수된다. 따라서 소장은 사료가 여러 소화효소의 작용을 통해 분해 및 흡수가 일어나는 주요 소화기관이라고 할 수 있 다(De Rouchey et al., 2009;Kim, 2012).

    1.3 대장의 소화작용

    대장은 맹장(cecum), 결장(colon) 및 직장(rectum) 으로 구성되어 있다. 돼지는 후장발효(hindgut fermentation)을 하며 맹장 및 결장에서 미생물에 의 해 휘발성 지방산(Volatile fatty acid)인 Acetate, Propionate, Butyrate, 다양한 가스(Methane, Hydrogen, CO2), urea, heat 및 미생물체(Bacterial mass) 등이 생성된다(Noblet & Le Goff, 2001;Coles et al., 2005)(Fig. 1). 휘발성 지방산은 사료내 섬유 소의 발효정도를 측정하는데 이용될 수 있으며 돼 지에서 추가적인 에너지원으로도 사용된다(Freire et al., 2000). 휘발성 지방산의 생성비율은 사료내 섬유소의 구성(NDF, ADF, lignin 등의 함량 및 비 율)에 따라 다르게 나타나는데 수용성 탄수화물이 많으면 propionate 비율이 높고 불용성 탄수화물이 높으면 acetate의 비율이 높게 나타난다(Freire et al., 2000;Makkar, 2002).

    2 소화율(Digestibility)

    소화율은 경제동물에서 사료의 영양학적 가치를 측정하는 가장 중요한 방법 중의 하나로 이용되고 있으며 공식은 다음과 같다. 소화율(%)=[(Cinput - Coutput)/Cinput]×100, 여기서 Cinput 및 Coutput은 각각 총 영양소의 섭취량 및 배출량을 의미한다. 돼지에 서는 전분소화율(Fecal digestibility) 및 회장소화율 (ileal digestibility)을 주로 사용한다. 전분소화율은 Coutput을 분으로 설정하였을 때 측정하는 방법으로 위, 소장 및 대장을 거쳐 소화 및 흡수되고 남은 영 양소를 고려한 것이며, 회장소화율은 Coutput을 위 및 소장말단부인 회장까지의 영양소를 고려한 방법으로 대장발효에 의해 분해 및 생성된 영양소를 제외한 측정방법으로 회장캐뉼라(cannula)을 이용하여 회장 내용물을 수거한다. 돼지에서 회장소화율이 전분소 화율 보다 높다는 것은 대장의 후장발효에 의해 생 성된 영양소가 분으로 배출된다는 것을 의미하며, 전분소화율이 회장소화율보다 높으면 후장발효에 의 해 영양소가 분해 및 흡수되어 분으로의 배출양이 적어진다는 것을 말한다(Kim, 2012). 소화율은 건물 및 각각의 영양소(탄수화물, 지방, 단백질, 아미노산 등)별로 소화율을 구분하여 표시할 수 있다. In vivo 소화율은 동물을 이용하여 직접적으로 측정하는 것 이며, 반면에 in vitro 소화율은 실험실에서 다양한 방법에 의해 간접적으로 측정하는 것을 말한다.

    In vitro 소화율 측정과 평가방법

    현재 경제동물의 사육비에서 ~50% 이상 차지하 는 사료의 효율적인 생산 및 급여기술의 개발은 경 제적인 측면 뿐만 아니라 과다 사료 급여에 의한 분 뇨의 환경오염 측면에서도 간과 할 수 없는 중요한 문제로 대두되고 있다. 동물의 사양조건에 맞는 사 료의 최적 급여량을 결정하기 위해서 우선적으로 고 려되어야 하는 사항은 원료/배합사료에 대한 최적 소화율을 결정하는 것이다. 다양한 경제동물의 생산 조건을 맞추기 위해 각 조건별 영양소요구량을 설정 하여야 하며 이에 충족하는 사료를 급여하기 위해 사료의 성분분석 및 소화율을 측정하여 최적사료를 공급하여야 한다(Corson et al., 1999).

    지난 수십년에 걸쳐 in vitro 측정법은 발전되어 왔으며, 가장 기본이 되는 측정법은 시험관 측정법 (tube method)라고 할 수 있다. 사료를 시험관에 넣고 일정기간 배양하여 분해된 정도를 측정하는 방 법으로 사료를 분해하기 위해서 장내용물, 소화액, 소화효소 등과 같은 다양한 촉매제를 사용하였으며 사료입자, 배양시간, 배양온도 및 교반속도 등과 같 은 조건을 설정하고 사료의 소화된 정도를 측정하기 위해서 소화되고 남은 양, 가스 발생량, 미생물 수 등과 같은 직접 또는 간접적인 방법을 사용하였다.

    Tilley & Terry(1963)에 의해 고안된 측정법은 반 추동물에서 현재까지도 널리 사용되는 방법으로 반 추위액(rumen fluid)을 채취하여 사료가 든 실험관 에 넣고 반추미생물에 의한 발효가 진행되도록 조건 을 설정하여 반추미생물의 소화작용에 의해 생성된 가스를 측정함으로써 간접적으로 사료의 반추위 분 해정도를 측정하는 방법이다. Van Soest(1966)Tilley & Terry(1963) 측정법을 개량하여 반추위액 에서 분해되고 남은 사료를 중성세제용액(neutral detergent solution)으로 가수분해하고 남은 물질은 미소화 세포벽물질(hemicellulose, cellulose, lignin 등)로 명명하였으며, 계속적인 분해방법을 적용하여 사료내 섬유소(fiber)의 분석방법을 확립하였다.

    돼지는 반추동물과는 달리 단위동물이므로 위에서 미생물에 의한 분해과정이 없다. 따라서 사료의 분 해 및 소화 작용에 사용되는 접종원(inoculum)으로 장 내용물을 사용하는 방법이 사용되었다(Lowgren et al., 1989;Perez-Vendrell & Torrallardona, 2010). 또한 위, 소장, 및 대장의 소화를 고려한 in vitro 전분소화율 측정에 효소에 의한 배양 실험방 법을 시도하였으며(Boisen & Fernandez, 1997), pepsin을 이용하여 위의 소화를 촉진하는 in vitro 시스템을 개발하였다(Chiang et al., 2008). 돼지에 서 회장 및 맹장의 내용물을 접종원으로 사용하여 소장 및 대장의 소화시스템에 대한 모델도 제시되었 다(Poeikhampha & Bunchasak, 2010). 돼지의 소 장에 사료가 포함된 nylon bag을 주입하여 in situ 배양를 실시하였고(Viljoen et al., 1998), 이 방법 을 응용하여 배양기에 사료가 포함된 filter bag을 주입하여 소화율을 측정하였다(Adesogan, 2005). Adesogan(2005)에 의해 수행된 in vitro 방법은 배 양기(Ankom Daisy II Incubator)를 이용하는 방법 으로 배양액이 포함된 glass jar에 각각의 사료를 넣은 filter bag를 넣어 연속적으로 배양하는 시스 템으로 tube를 이용한 기존의 배양방법에 비해 간편 하고 많은 수의 시료를 분석할 수 있는 장점이 있다 (Fig. 2). 돼지의 위, 소장 및 대장의 대표적인 소화 효소인 pepsin, pancreatin 및 섬유소 분해효소를 이용하여 밀의 전분 소화율을 예측하는 in vitro 3-step 방법이 개발되었으며(Regmi et al., 2008), 또한, 사료자원으로 almond hull, 보리, 옥수수글루텐피드, 옥수수글루텐밀, 루핀(hull 및 kernel)을 사용한 양돈사료의 에너지 소화율을 예 측하였다(Lee, 2017).

    In vitro 소화율 측정방법에서 고려해야 할 요인

    1 배양액/완충용액(Buffering solution)

    사료의 분해 및 소화 작용을 촉진하는 배양액의 기본적인 요건은 접종원의 종류에 따라 다양하게 설 정되어야 한다. 접종원으로 미생물을 이용할 경우에 는 호기성 또는 혐기성에 따라 다를 수 있으며, 장 내용물 또는 효소를 이용할 경우에는 최적의 활성을 유지하도록 배양의 조건을 설정하여야 할 것이다. 돼지에서 소화효소를 이용한 in vitro 측정방법에 는 완충용액을 사용하여 적정 pH가 유지되도록 한 뒤, 효소의 활성을 유지하는 방법이 이용되고 있다 (Coles et al., 2005). 완충용액은 약산과 그 짝염기 또는 약염기와 그 짝산으로 구성되며, 강산, 강염기 또는 지방산 등에 의한 pH의 변화에도 억제력을 유 지하도록 구성된다. 일반적으로 널리 사용되는 완충 용액은 인산(phosphate)과 탄산(carbonate)이 있다. 완충용액은 pH 조절 뿐만 아니라 소화작용에도 영 향을 미치는데 인산용액은 가스 발생의 특징에 변화 를 주어 섬유소 소화율을 향상시키며(Kennedy et al., 2000), 중탄산(bicarbonate)은 미생물의 성장 및 활성을 촉진하여 결과적으로 섬유소 분해 및 가 스발생을 증가시킨다(Rymer et al., 2005).

    2 소화효소

    In vitro 방법에서 사용하는 소화효소는 기본적으 로 돼지의 소화관에서 생성되는 효소의 종류 및 특징 을 기준으로 설정된다. 돼지 pepsin 및 pancreatin 은 위와 소장의 소화작용에 사용되며, 대장의 섬유 소분해에는 여러 종류의 복합효소를 이용하는 방법 으로 발전하였다(Boisen & Fernandez 1997;Regmi et al., 2008). Pancreatin은 복합효소로 protease, amylase 및 lipase로 구성되며(Wilfart et al., 2007), 섬유소 분해효소인 Viscozym®은 Arabinase, Cellulase, Gluconase, Hemicellulase, Pepctinase 및 Xylanase 를 포함하고 있어 전분소화율 측정에 사용된다(Biosen & Fernandez, 1997).

    3 시료 및 배양 조건

    단미 또는 배합사료를 시료로 사용하기 위해서는 준비과정이 필요하다. 사료는 재배지역, 보관상태, 온도 및 상대습도 등에 따라 성분의 차이가 발생하 며, 특히 수분의 함량에 차이가 생길 수 있다. 동일 한 조건을 위해 건물함량을 기준으로 한다. 열풍건 조는 60~70℃에서 실시하고 필요할 경우 동결건조 도 고려해야 한다(Williams et al., 2005). 시료의 입자크기는 일반적으로 1~2 mm가 적당한것으로 보 고되고 있다(Bendar et al., 2001;Bauer et al., 2003). 입자크기가 1 mm 이상일 경우 in vitro 소 화율이 감소했으며(Biosen & Fernandez, 1997), 입 자크기가 작을 수록 표면적이 증가하여 미생물 또는 소화효소의 분해작용이 증가하는 양의 상관관계가 있 다(Rymer et al., 2005). 시료의 사용량에 따라 소 화율 측정값의 오차가 발생할 수 있으며 0.5 g에 비 해 0.25 g에서 반복당 측정값의 오차가 크게 나타났 으며(Lowgren et al., 1989;Bindelle et al., 2007), 시료의 양이 증가 할수록 완충용액의 작용범위을 초 과할 수 있는 경우가 발생할 가능성이 있다(Dung et al., 2002). 또한, 고함량의 단백질사료에서 0.5 g 이상을 사용할 경우 in vitro 소화율을 과소평가되는 결과가 나타났다(Biosen & Fernandez, 1997).

    시료의 배양조건에서 pH와 온도는 기본적으로 in vivo 조건과 가능하면 동일하도록 설정한다. 여러 연구결과에 의하면 위의 소화는 pH=2.0과 39℃, 소 장의 소화는 pH=6.8과 39℃, 대장의 소화는 pH= 4.8과 39℃로 설정하였다(Boisen & Fernandez, 1997;Noblet & Jaguelin-Peyraud, 2007;Regmi et al., 2009;Jha et al., 2011). In vivo 조건에서 사료의 소화관 체류시간은 사료의 성분 및 물리/화 학적 특성에 따라 차이가 있으며, 위에서 대장까지 의 통과시간을 고려하여 여러 실험이 수행되었다. Biosen & Fernandez(1997)은 위-소장-대장의 배 양시간을 2-4-18 h으로 설정하였고, Lowgren et al.(1989)는 6-12-48 h를 제시하였다. 대장의 배양 시간을 24 h 이상을 하였을 경우, 비전분성 다량류 의 in vivoin vitro의 상관관계가 높게 나타났 으며(Coles et al., 2005), 반면에, 고 섬유질 사료 에서는 미생물 발효의 속도가 낮으므로 48 h 이상 의 배양시간이 적당하다고 제시되었다(Jha et al., 2011). Awati et al.(2006)에 의하면, 섬유소의 분 해속도에 따라 빠른 경우에는 24 h, 늦은 경우에는 72 h이 적절하다고 하였는데, 복합효소의 활성에 따 라 배양시간이 단축될 수 있다고 하였다. 교반작용 의 방법과 속도는 in vivo 조건에서 장관의 연동운 동과 관련하여 고려되어야 한다(Coles et al., 2005). 교반작용이 증가하면 미생물 또는 소화효소 에 의한 사료의 분해가 증가하게 된다. 지속적 또는 간헐적 교반방법, 분당 교반 속도 등과 같은 조건에 따라 소화율의 측정값이 상이하게 도출되었다(Boisen & Fernandez, 1997;Rymer et al., 2005).

    곡류시료의 in vitro 건물소화율 측정

    옥수수는 세계적으로 가장 많이 사용되고 있는 대 표적인 에너지사료이다. 쌀은 우리나라에서 주식으 로 사용되고 있으며 최근에 재고로 비축된 2012년 산 재고미의 가축사료화가 진행되어 2016년부터 9 만9000톤이 사료로 공급되었고, 단가는 현미가준 kg당 200원으로 옥수수보다 낮은 가격으로 공급되 어 원가절감의 효과를 기대하고 있다. 본 실험에서 는 Ankom Daisy II incubator를 이용하여 옥수수, 쌀, 소맥 및 대맥의 in vitro 건물소화율을 2-step (회장) 및 3-step(전분) 으로 구분하여 측정하였다.

    1 시료준비 및 실험설계

    시료는 옥수수, 쌀(재고미), 대맥 및 소맥를 건조 기에 100℃에서 18시간 건조한다. F57 filter bag (fiber filter bag 25 μm porosity, Ankom Technology, USA)은 acetone (99%)으로 세척하여 준비한 후 시 료 0.5 g를 넣고 밀봉하였다. 시료는 시료무게, filter bag무게 및 시료를 포함한 filter bag무게를 측정하 였다. 시료의 입자크기는 실험용 체(Standard Test Sieves, Chunggye, South Korea)를 이용하여 1 mm (0.850~1.000 mm) 및 2 mm (1.700~2.000 mm)의 크기로 준비하였다. 배양기(Daisy II incubator, Ankom Technology, USA)는 39℃가 유지되도록 하였다. 처리구는 원료사료(옥수수, 쌀, 소맥, 대 맥), 입자크기(1, 2 mm), 소화단계(회장, 전분)으로 구분하며 각각의 처리구별 12반복으로 filter bag을 준비하였다.

    In vitro 건물소화율을 측정하기 위해 배양시간은 위-소장-대장의 단계별로 처리하였다. 따라서, 회장 소화율(2-step)은 위-소장으로 4~6 h이며, 전분소 화율은 위-소장-대장으로 4-6-18 h이다. 위, 소장 및 대장 소화단계에 사용된 완충용액은 각각 0.1 M, pH=6.0; 0.2 M, pH=6.8; 0.1 M, pH=4.8이다. Handersen-Hasselbach equation을 이용하여 약산 (KH2PO4)과 짝염기(K2HPO4)로 구성된 완충용액을 제조하였다. 예를 들면, 위의 소화단계에서 필요한 KH2PO4=0.094 M, K2HPO4=0.0058 M이며, 약산용 액을 넣은 후 짝염기용액을 천천히 넣으며 1 M NaOH 또는 1 M HCl을 넣어 pH= 6.0으로 조절하 였다. 소장 및 대장에 사용된 완충용액도 같은 방법 으로 계산하여 몰농도를 구한 후에 각각의 농도와 pH에 맞게 제조하였다.

    위의 소화에 사용된 배양액은 4 L incubation jar에 600 ml 완충용액(0.1 M, pH=6.0)을 넣고 240 ml, 0.2 M HCl을 첨가하였다. 그 후에 1 M HCl 또는 1 M NaOH를 이용하여 pH=2.0으로 조 정하였다. Incubation jar를 배양기에 넣고 39℃, 30 min 데운 후에 0.6 g pepsin (250 units/mg, P7000, Sigma Aldrich, USA)과 12 ml (0.5 g/100 ml ethanol) chloramphenicol(HPLC grade, C0378, Sigma Aldrich, USA)를 첨가하였다. 시료가 들어 있는 Filter bag을 jar에 넣은 후 4 h 배양하였다.

    소장의 소화에 사용된 배양액은 240 ml 완충용액 (0.2 M, pH=6.8)에 120 ml, 0.6 M NaOH를 첨가하 고 pH=6.8로 조정한 후에 2.4 g pancreatin (porcine grade IV, Sigma Aldrich, USA)를 넣고 6 h 배양하 였다. 배양이 종료된 후에 filter bag을 꺼내고 39℃ 의 따뜻한 물로 깨끗히 세척한 후에 95% ethanol과 99% acetone으로 각각 5분씩 세척한 후 80℃ 건조 기에 18 h 건조시킨 후 실온에서 식힌 후에 무게를 측정하여 회장 소화율을 계산 하였다.

    기존의 배양액은 버리고 대장 소화에 필요한 배양 은 다음과 같이 제조하였다. 대장의 소화에 사용된 배양액은 750 ml 완충용액(0.1 M, pH=4.8)을 넣은 후 배양기에서 39℃에 배양하였다. 그 후에 12 ml Viscozyme(Viscozyme L, V2010, sigma Aldrich, USA)와 filter bag을 넣고 18 h 배양하였다. 배양 이 종료된 후에 위에 언급한 방법과 동일하게 filter bag을 처리한 후 무게를 측정하여 전분소화율을 계 산하였다.

    통계분석은 Graphpad Prism (version 5.03)을 이 용하여 Two-way 분산분석(ANOVA)을 실시하였다. 각각의 factor로는 입자크기(1 mm, 2 mm)와 소화 율(Ileal, Fecal)로 설정하여(2×2 ANOVA) 유의차 (p<0.05)검정하였고, 소화율내에서 입자크기에 따 른 유의차를 확인하기 위해 Bonferroni post-test 를 실시하였다(Fig. 3). 각각의 원료사료(옥수수, 쌀, 소맥, 대맥)에 따른 회장 및 전분소화율의 유 의차를 분석하기 위해 원료사료와 소화율을 각각 의 factor로 설정하였으며(4×2 ANOVA), 원료사 료내 입자크기에 따른 유의차를 확인하기 위해 Bonferroni post-test를 실시하였다(Fig. 4).

    2 In vitro 건물소화율 분석

    돼지의 에너지사료로 널리 사용되고 있는 옥수수, 소맥 및 대맥을 포함하여 최근에 우리나라에서 사료 화가 추진중인 쌀(재고미)의 건물소화율을 분석하였 다(Fig 3, 4). 모든 처리구에서 전분 건물소화율이 회장 건물소화율보다 유의적으로(p<0.0001) 높게 나타났으며, 입자크기가 클수록(1 mm vs. 2 mm) 건물소화율은 유의적으로(p<0.001) 낮게 나타났다 (Fig. 3). 이러한 결과는 대장의 소화환경에서 섬유 소 분해효소에 의해 소장까지의 미분해 성분이 대장 조건에서 분해된 것으로 판단되며, 또한 입자크기가 작을수록 사료입자의 표면적이 커지므로 작은 입자 크기(1 mm)에서 건물소화율이 높게 나온 것으로 사 료된다.

    쌀에서 최대값의 회장 및 전분 건물소화율(%)을 보였으며, 각각 93.39(1 mm), 87.86(2 mm) 및 97.44(1 mm), 95.63(2 mm)이었다(Fig. 4). 최소 값의 건물소화율은 회장소화율의 경우 대맥으로 58.53(1 mm)와 41.75(2 mm)이며, 전분소화율의 경 우에는 옥수수로 90.74(1 mm), 87.60(2 mm)이었 다. 쌀의 일반성분을 살펴보면 NFE 및 조섬유의 함 량이 각각 84.97% 및 1.32%이며, 본 실험에서 사용 한 다른 곡류사료보다 높은 값을 보였으며 이로 인 해 소화가 더 용이한 것으로 사료된다. 대맥의 경우 에는 NFE 및 조섬유 함량이 77.14% 및 5.75%로 다 른 곡류사료에 비해 가장 높은 값을 보여 회장소화 율이 낮게 나타난 것으로 사료되며, 옥수수의 경우 에는 NFE (81.72%) 및 조섬유 함량(2.94%)이 대맥 보다는 높으나 전분소화율은 낮게 보인 것은 아마도 옥수수의 과피(hull)에 의해 대장에서 분해가 지연 된 것으로 사료된다. 소맥의 회장 및 전분소화율은 쌀 보다는 낮으나 옥수수 및 대맥보다는 유의적으 로 높게 나타났다. 옥수수, 소맥 및 대맥에 대한 건물소화율을 측정한 다른 연구결과에 의하면 회장 소화율의 경우는 75~84%, 전분소화율의 경우는 85~90%의 범위에 해당 했으며, 소맥의 회장 및 전 분소화율이 가장 높은 값을 나타냈고 그 다음으로 옥 수수이며, 대맥이 가장 낮은 값을 보여 본 연구결과 와는 다소의 차이가 있었다(Kong et al., 2015;Park et al., 2016). 이러한 결과는 곡류사료의 일반 성분, 실험방법 등에 따른 차이로 인한 것으로 사료 된다. 본 실험의 결과를 종합하면, 사료입자의 크기 가 작을 수록 건물소화율은 증가하는 경향을 보였으 며, 전분 소화율이 회장소화율보다 높은 것으로 나 타났고, 특히 쌀(재고미)의 경우에는 다른 곡류사료 에 비해 건물소화율이 우수한 것으로 사료되어 충분 히 에너지사료로써 대체가 가능할 것으로 사료된다.

    본 논문은 지난 수십년에 걸쳐 개발된 in vitro 소화율 측정법에 대한 소개 및 장단점에 대해 논하 였다. 돼지의 사료로 가장 많이 사용되고 있는 대표 적인 곡류사료인 옥수수, 소맥 및 대맥 뿐만 아니 라, 우리나라에서 최근에 사료자원으로 사용이 가능 해진 쌀(재고미)에 대한 in vitro 건물소화율을 측 정하기 위해 in vivo 조건과 가장 유사한 daisy II incubator를 이용한 분석을 실시하였다. 앞으로 배 양시간, 사료입자의 크기, 효소농도 등과 같은 다양 한 변수에 대한 추가 연구가 진행되어야 할 것으로 사료되며 더불어 단백질 및 섬유질사료에 대한 in vitro 소화율 측정도 병행하여 돼지에 사용되는 다 양한 원료사료에 대한 소화율 값을 제시하고 기초자 료로 제공하고자 한다.

    감사의 글

    본 연구는 농림축산식품부 농림수산식품기술기획 평가원(IPET) 농생명산업기술 개발과제(과제번호: 315022-3)의 연구비 지원과 2017년도 경상대학교 연 구년제 연구교수 연구지원비에 의하여 수행되었음.

    Figure

    JALS-53-2-15_F1.gif

    Gastrointestinal tracts of hindgut-fermenting mammals (Stevens & Hume, 1998;Kim, 2012).

    JALS-53-2-15_F2.gif

    Incubation system and sample preparation of in vitro DM digestion. (A) Ankom Daisy II incubator, (B) The sequence of sample preparation.

    JALS-53-2-15_F3.gif

    In vitro DM digestibility of cereal feeds. (A) Corn, (B) Rice, (C) Wheat, (D) Barely. Two-way ANOVA analyses were addressed for P(paticle size, 1 and 2 mm), D (digestive step, ileal and fecal) and the interaction P×D by each cereal feed. Bonferroni post-tests were expressed for the difference of particle size in each digestibility at p<0.01 (**), p<0.05 (*) or NS (Non-siginificant, p>0.05).

    JALS-53-2-15_F4.gif

    Comparison of in vitro DM digestibility by particle size of cereal feeds. (A) 1 mm, (B) 2 mm. Two-way ANOVA analyses were addressed for C(cereal feed), P(paticle size, 1 and 2 mm) and the interaction C×D by each particle size. Bonferroni post-tests were expressed for the difference of digestibility in each cereal feed at p<0.01 (**).

    Table

    Reference

    1. Adesogan AT. 2005. Effect of bag type on the apparent digestibility of feeds in Ankom Daisy II incubators. Animal Feed Science and Technology. 119: 333-344.
    2. Agudelo JH. 2009. Alternative feedstuffs for swine: what are our options? Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias. 22: 287-286.
    3. Awati A, Willams BA, Bosch MW, Li YC and Verstergen WA. 2006. Use of in vitro cumulative gas production technique for pigs: An examination of alternations in fermentation products and substrate losses at various time points. Journal of Animal Science. 84: 1110-1118.
    4. Bauer E, Willams BA, Voigt C, Mosenthin R and Verstegen MWA. 2003. Impact of mammalian enzyme pretreatment on the fermentability of carbohydraterich feedstuffs. Journal of the Science of Food and Agriculture. 83: 207-214.
    5. Bednar GE, Patil AR, Murray SM, Grieshop CM, Merchen NR and Fahey Jr GC. 2001. Starch and fiber fractions in selected food and feed ingredients affect their small intestinal digestibility and fermentability and their large bowel fermentability in vitro in a canine model. Journal of Nutrition. 131: 276-286.
    6. Bindelle J, Buldgen A, Lambotte D, Wavreille J and Leterme P. 2007. Effect of faecal donor and of pig diet composition in in vitro fermentation of sugar pulp. Animal Feed Science and Technology. 132: 212-226.
    7. Bindelle J, Buldgen A and Leterme P. 2008. Nutritive and environmental consequences of dietary fibre in pig nutrition: a review. Biotechnology Agronomy Society and Environment. 12: 313-324.
    8. Boisen S and Fernandez JA. 1997. Prediction of the total tract digestibility of energy in feedstuffs and pig diet by in vitro analysis. Animal Feed Science and Technology. 68: 277-286.
    9. Chiang CC, Croom J, Chuang ST, Chiou PWS and Yu B. 2008. Development of a dynamic system stimulating pig gastric digestion. Asian-Australasian Journal of Animal Science. 21: 1522-1528.
    10. Coles LT, Moughan PJ and Darragh AJ. 2005. In vitro digestion and fermentation methods, including gas production techniques, as applied to nutritive evaluation of foods in the hindgut of human and other simple-stomached animals. Animal Feed Science and Technology. 123-124: 421-444.
    11. Corson DC, Waghorn GC, Ulyatt MJ and Lee J. 1999. NIRS: Forage analysis and livestock feeding. Proceedings of the New Zealand Grassland Association. 61: 127-132.
    12. De Rouchey J, Goodband B, Tokach M, Dritz S and Nelson J. 2009. Digestive system of a pig: Anatomy and function. Swine Profitability Conference, Manhattan. pp.47-50.
    13. Dung NNX, Manh LH and Udeh P. 2002. Tropical fibre sources for pigs digestibility, digesta retention and estimation of fibre digestibility in vitro. Animal Feed Science and Technology. 102: 109-124.
    14. Freire JPB, Guerreiro AJG, Cunha LF and Aumaitare A. 2000. Effect of dietary source on the total digestibility, caecum volatile fatty acids and digestive transit time in the weaned piglets. Animal Feed Science and Technology. 87: 71-83.
    15. Jha R, Bindelle J, Van Kessel A and Leterme P. 2011. In vitro fibre fermentation of fermentable carbohydrate and protein level and protein synthesis by colonic bacteria isolated from pig. Animal Feed Science and Technology. 165: 190-200.
    16. Kennedy PM, Lowry JB and Conlan LL. 2000. Phosphate rather than surfactant accounts for the main contribution to enhanced fibre digestibility resulting from treatment with boiling neutral detergent. Animal Feed Science and Technology. 86: 177-190.
    17. Kim YY. 2012. Animal Nutrition. 2nd edition. Life Science. Korea.
    18. Kong C, Park CS and Kim BG. 2015. Effects of an enzyme complex on in vitro dry matter digestibility of feed ingredients for pigs. Springer Plus. 4: 261-264.
    19. Lee SA. 2017. Prediction of energy values in feed ingredients fed to pigs. MS Thesis. Konkuk Univrsity. Korea.
    20. Lowgren W, Graham H and Aman P. 1989. An in vitro method for digestion in the pig: Stimulating digestion in the different compartments of the intestine. British Journal of Nutrition. 61:673-687.
    21. Makkar HPS. 2002. Applications of the in vitro gas method in the evaluation of feed resources, and enhancement of nutritive value of the tannin-rich/ browse leaves and agro-industrial by products. IAEA TECDOC-1294: Development and field evaluation of animal feed supplementation packages. pp.23-42.
    22. Metzler BU and Mosenthin R. 2008. A review of interaction between dietary fibre and the gastrointestinal microbiota and their consequences in intestinal phosphorus metabolism in growing pigs. Asian-Australasian Journal of Animal Science. 21: 603-615.
    23. Noblet J and Jaguelin-Peyraud Y. 2007. Prediction of digestibility of organic matter and energy in the growing pig from an in vitro method. Animal Food Science and Technology. 134: 211-222.
    24. Noblet J and Le Goff G. 2001. Effect of dietary fibre on the energy value of feeds for pigs. Animal Feed Science and Technology. 90: 35-52.
    25. Park KR, Park CS and Kim BG. 2016. An enzyme complex increases in vitro dry matter digestibility of corn and wheat in pigs. Springer Plus. 5: 598-604.
    26. Perez-Vendrell AM and Torrallardona D. 2010. In vitro digestibility kinetics of diets containing different cereal sources. Livestock science. 134: 47-49.
    27. Poeikhampha T and Bunchasak C. 2010. Effect of sodium gluconate on pH value, ammonia and short chain fatty acids concentration in batch culture of porcine cecal digesta. Journal of Applied Sciences. 10: 1471-1475.
    28. Regmi PR, Ferguson NS and Zijlstra RT. 2009. In vitro digestibility techniques to predict apparent total tract energy digestibility of wheat in growing pigs. Journal of Animal Science. 87: 3620-3627.
    29. Regmi PR, Sauer WC and Zijlstra RT. 2008. Prediction of in vivo apparent digestibility of barley in growing pigs using an in vitro digestibility technique. Journal of Animal Science. 86: 2619-2626.
    30. Rymer C, Huntington JA, Willams BA and Given DJ. 2005. In vitro cumulative gas production techniques: History, methodological considerations and challenges. Animal Feed Science and Technology. 123-124: 9-30.
    31. Stevens CE and Hume ID. 1998. Contributions of Microbes in Vertebrate Gastrointestinal Tract to Production and Conservation of Nutrients. Physiological Reviews. 78: 393-427.
    32. Sun T, Laerke HN, Jorgensen H and Knudsen KEB. 2006. The effect of extrusion cooking of different starch sources on the in vitro digestibility in growing pigs. Animal Feed Science and Technology. 131: 66-85.
    33. Tilley JMA and Terry RA. 1963. A two stage technique for the in vitro digestion of forage crop. Journal of British Grassland Society. 18: 104-111.
    34. Van Soest PJ. 1966. Non-nutritive residue: A system of analysis for the replacement of crude fibre. Journal Association of Official Analytical Chemist. 49: 546.
    35. Viljoen J, Fick JC, Coetzee SE, Hayes JP and Siebrits FK. 1998. Apparent and true amino acid digestibilities of feedstuffs in pig employing the total ileal content (TIC) techniques and the mobile nylon bag technique (MNBT). Livestock Production Science. 53: 205-215.
    36. Wang JF, Li DF, Jesen BB, Jakobson K, Xing JJ, Gong LM and Zhuy H. 2003. Effect of type and level of fibre on gastric microbial activity and short chain fatty acids concentration in gestating sows. Animal Feed Science and Technology. 104: 95-110.
    37. Wilfart A, Jagualin-Peyrand Y, Simmins H, Noblet J, Van Milgen J and Montagne L. 2008. Kinetics of enzymatic digestion of feeds as estimated by a stepwise in vitro methods. Animal Feed Science and Technology. 141: 171-183.
    38. Williams BA, Bosch MW, Boer H, Verstegen MWA and Tamamminga S. 2005. An in vitro batch culture method to assess potential fermentability of feed ingredient for monogastric diet. Animal Feed Science and Technology. 123-124: 445-462.
    오늘하루 팝업창 안보기 닫기