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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.53 No.1 pp.1-11
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2019.53.1.1

On-site Inspection of Agricultural Microorganism Culture Rooms for Culture Efficiency and Contamination Status

Gyeongjun Cho1, Da-Ran Kim2, Chang-Wook Jeon1, Seung Geu Lee3, Youn-Sig Kwak1,2*
1Division of Applied Life Science(BK21Plus), Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea
2Department of Plant Medicine and Institute of Agriculture & Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea
3Food Crop Industry Technology Service Division 300, Nongsaengmyeong-ro, Wansan-gu, Jeonju, 54875, Korea

These authors contributed equally to this work.


Corresponding author: Youn-Sig Kwak Tel: +82-55-772-1922 Fax: +-55-772-1929 E-mail: kwak@gnu.ac.kr
May 2, 2018 July 25, 2018 August 21, 2018

Abstract


Agricultural microorganism culture rooms have been established to provide various microorganisms to farmers. Currently, more than 130 centers which were operated by Agricultural Technology & Extension Center under each local government in nationwide. Major microorganisms, which are cultivated by the culture rooms, are Bacillus, Rhodobacter, Lactobacillus, Saccharomyces, Nitromonas. Contamination during cultivation is a common problem and there is no previous report available, which inspected the quality and quantity of the culture rooms. Therefore, in this study we investigated over-all quality of the culture rooms in terms of microbiological contamination. In culture preparation room showed high concentrations rate of bacteria(104 CFU/m3) and fungi(104 CFU/m3), which are potentially high risk of contamination, were discovered. Some long-term stock microorganisms for scale-up cultures were identified differently due to contamination. Yeast long-term stock was identified as a food poisoning bacteria. In general, most of the center mixed and cultured several microorganisms together without consideration of the microorganism’s characteristics. Some of industrial scale media for large scale culture were not able to grow a microorganism. Additionally, human pathogens Staphylococcus aureus and Bacillus cereus, Escherichia coli were contaminated in end-product of scale-up cultures. Our results suggested that serious contamination could adversely affect employee’s health, farmers’ health and agricultural economy. These problems should be improved through the input of microorganism expert or the training of the non-expert public servant.



농축산미생물배양실 배양효율 및 오염실태 조사

조 경준1, 김 다란2, 전 창욱1, 이 승규3, 곽 연식1,2*
1경상대학교 응용생명과학부
2경상대학교 식물의학과(농업생명과학연구원)
3농촌진흥청 식량산업기술팀

초록


농축산미생물배양실은 농축산미생물을 지자체에서 안전하게 관리하고 지원하기 위해 설립되었으며, 현재 전국에 130개소 이상 분포하고 있다. 주로 배양되는 미생물은 고초균, 광합성균, 유산균, 효모균, 질소고정균 등이다. 농축산미생물배양실의 종균관리, 오염등 품질관리에 대한 조사 연구가 수행되지 않 아, 본 연구에서 농축산미생물배양실의 질적, 양적 오염 현황을 조사하였다. 조사결과 배양실에서는 공 기 중에서 높은 농도의 세균(104CFU/m3)과 진균(104CFU/m3)이 검출되어 오염에 취약하였으며, 또한 배양실에서 보유 중인 종균이 다른 균주로 규명되는 경우도 조사 되었다. 효모 종균이 식중독균으로 동 정되는 결과도 관찰되었다. 대부분의 농축산미생물배양실에서 미생물의 특성을 고려하지 않고 혼합하여 배양하였으며, 기업으로부터 납품받은 일부 배지에서는 미생물이 생육하지 못하는 현상도 조사 되었다. 또한, 인체병원균으로 분류되는 황색포도상구균, Bacillus cereus 병원성대장균등이 농민들에게 나누어 주는 미생물배양액에서 검출되었다. 이러한 문제점들은 배양 업무 담당자와 농민, 나아가 국민의 건강 을 해치고, 농업 경제에 악영향을 줄 수 있다.



    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs
    315004-5

    서론

    미생물은 농업적 측면에서 식물병 방제 및 식물의 성장 촉진 등으로 큰 잠재력을 가지고 있고 환경오 염에 대한 걱정이 적어 농업 용도로 미생물을 활용 하기 위한 연구(Toyata & watanabe, 2013;Sing & Trivedi, 2017)가 활발한 추세이다. 이러한 미생물 의 잠재력을 활용하기 위하여 농민들은 미생물을 예 전부터 자체적으로 미생물을 키워 농업에 사용하고 있었으며 이를 안전하게 지자체가 지원하고 관리하 기 위하여 2000년대 초반부터 농축산미생물배양실 을 설립하고 운영하였다. 2016년을 기준으로 전국적 으로 134개 시·군 농업기술센터에서 농축산미생물 배양실를 운영하여 농업인들에게 보급하고 있다. 대 량배양을 효율적으로 운영하기 위해, 양에 비하여 재 료가 값싸고, 배합이 완료된 산업용 배지를 활용하고 있으며, 배지 구매 시 무상으로 같이 제공되는 미생 물 종균을 활용하거나 농축산미생물 사업자와 계약하 여 정기적으로 종균을 공급받고 있다. 주로 농가들 에게 보급하는 종균으로는 고초균(Bacillus), 광합 성균(Rhodobacter), 유산균(Lactobacillus), 효모 (Saccharomyces), 질소고정균(Nitrosomonas)이며 대량배양을 통해 증식시킨 뒤 농축산인들이 여러 용 도로 사용하기 쉽도록 혼합하여 배포하기도 한다. 그리고 일본 EM Research Organization, inc.에서 개발된 제품인 EM(Higa & Parr, 1994)처럼 유산 균, 광합성균, 효모와 기타 등을 혼합하여 만든 종 균을 구입 및 배양하여 혼합균(EM)을 배포하는 곳 이 많았다.

    배포된 농축산미생물의 농업적 용도로는 작물의 생육촉진, 시설의 가스장해와 염해 감소, 유기물 가 용화, 식물병 방지, 유기질비료, 착색증진등에 사용 하고 있으며, 축산에서는 축사의 악취개선 및 분뇨 액비화, 사료 소화율 증대, 사료 유해균 억제, 가축 면역력 증대 등 다양한 목적으로 사용되고 있다 (Jung et al., 1998). 농축산물 생산자의 입장에서 과도한 화학제품 사용에 대한 부작용을 우려하고 있 으며, 이러한 상황에 대한 대체재로서 농업미생물을 선호하여 요구량이 증가하고 있다. 이에 따라 지역 별 농축산미생물배양실는 점점 늘어갈 전망이다. 그 러나 농축산미생물배양실은 대부분 담당자가 미생물 관련 전공이 아닌 경우가 많아 관련 지식을 습득하 는 데 어려움을 겪고 있으며, 이 때문에 산업용 배 지 제조 및 종균 회사에 의존적인 판단을 하는 경우 가 대부분이다. 또한, 대부분의 농축산미생물배양실 은 자체적인 배지 품질검사와 시설의 오염 예방에 관한 수준이 낮아, 배양 및 시설 운영 규모와 비교 하여 미생물품질 및 시설의 오염 관련 예산편성이 낮은 편으로 조사되었다.

    본 연구는 운영 중인 농축산미생물배양센터의 안 전하고 안정적인 미생물 공급을 지원하기 위하여 오 염, 사용하는 배지의 품질, 배양 미생물의 효능 검 사를 통해 문제점 파악하고 개선하기 위하여 수행되 었다.

    재료 및 방법

    1 종균의 동정 및 법적 금지 인체유해 미생물 검사

    각 센터에서 사용하는 종균을 동정하기 위하여 세 균의 경우 27mF(5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) 와 1492mR(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′) 프라이머(Osborne et al., 2005)로 16S rRNA sequence를 분석 하였으며, 효모는 ITS1(5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′), ITS4(5′-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3′) 프라이머(White et al., 1990)로 ITS 염기서열을 분석하였다. 염기서열검사 결과 오 염으로 확인 된 경우 종균에 대하여 법적 오염균 검 사를 실시하였으며, 농가들에게 보급되는 배양액 또 한 오염 검사를 병행하여 실시하였다. 검사방법으로 대장균 유무를 진단하는 Eosin Methylene Blue 배 지(EMB: peptic digest of animal tissue 10g, lactose 5g, sucrose 5g, dipotassium phosphate 2g, eosin-Y 0.4g, methylene blue 0.065g, agar 20g/L, pH 7.2), 살모넬라 유무를 진단하는 Xylose- Lysine Deoxycholate 배지(XLD: yeast extract 3g, L-lysin 5g, lactose 7.5g, sucrose 7.5g, xylose 3.5g, sodium chloride 5g, sodium deoxycholate 2.5g, sodium thiosulphate 6.8g, ferric ammonium citrate 0.8g, phenol red 0.08g, agar 15g/L, pH 7.4), 황색포도상구균 유무를 진단하는 Baird- Parker Agar 배지(BPA: pancreatic digest of casein 10g, beef extract 5g, yeast extract 1g, glycine 12g, sodium pyruvate 10g, lithium chloride 5g, agar 20g/L, pH 6.8), 병원성 바실러 스를 진단하는 Mannitoal Egg Yolk Polymyxin 배 지(MYP: HM peptone B 1g, peptone 10g, mannitol 10g, sodium chloride 10g, phenol red 0.025g, agar 15g/L, pH 7.2)를 이용하였다(MFDA, 2017).

    2 배지 효율 검사

    바실러스, 유산균, 효모, 광합성세균 각각의 산업 용 배지와 실험실 표준 배지(TSA)에 균을 접종하고 각 미생물 배양실에서 배양적온으로 사용하는 27℃ 에서 각 균주의 최대 생육 시간별로 진탕배양하여 흡광도 600nm를 측정하고 이를 바탕으로 배지효율 을 평가하였다.

    3 혼합균(EM) 배양효율 검사

    각 센터에서 배양하는 혼합균(EM)은 일정한 밀도 의 미생물들이 수종에서 수십종 혼합하여 배양하는 것으로 알려져 있다. 배양환경에 따라 특정 미생물 이 자라기 쉬운 조건인지 알아보기 위하여, 7개소의 배양실에서 농가들에게 제공하는 혼합 배양액을 pH 검사지를 이용하여 pH를 측정하였다. 이 배양액들 은 모두 4가지 이상의 종균을 혼합하여 배양되었다.

    4 농축산 미생물의 효능 검사

    철 이온 흡착력 검사는 CAS media에서 접종하 여 세균 주변에 배지색상이 파란색에서 노란색으로 변화하는지 확인하여 판단하였고(Louden et al., 2011) 단백질분해 검사는 skim milk agar 배지에서 투명환의 크기로 판단하였으며(Kazanas, 1968), 키 틴분해, 셀룰로스 분해 능력검사는 minimal salt media에서 각 분해될 성분들을 첨가하였고, Congo red로 염색하여 투명대 유무를 확인하여 검사하였다 (Kluepfel, 1988;Watanabe, 1990).

    Pikovaskaya’s 배지를 이용한 인산가용화(Pikovskaya, 1948), Nfb 배지를 이용한 질소고정력(Baldani et al., 2014), Salkowski test를 이용한 식물호르몬 분비능력(Lwin et al., 2012)을 알아보았다.

    5 식물병원성 진균에 대한 항균력 검사

    PDK배지 한 가운데 식물병원성 진균을 접종하 고, 3cm 거리에 배양액 및 종균을 접종하여 진균 이 성장하는 정도에 따라 길항능력을 평가하였다. 27℃에서 진행되었으며 사용한 식물성 병원균은 Rhizotonia solani, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici였다.

    6 배양실의 시설 청결도 검사

    배양시설의 공기로 인한 오염을 조사하기 위하여 포자 채집기(Model No. B30120, A.P. BUCK Inc., 미국)를 이용하여 분당 120L로 흡기한 공기를 세균 배지인 TSA와 진균배지인 PDA에 노출하여 조사하 였다.

    결과 및 고찰

    1 종균의 동정

    대부분의 미생물 배양실의 경우 종균은 사기업에 서 분양받아 이용하였고, -70℃ 냉동고에 보관균주 를 만들지 않아 초기 물품과 후기 물품간의 품질 변이가 일어났는지 농축산배양실에서 스스로 알아 내기 어려운 상황이었다. 배양실 A에서 제공한 바 실러스, 유산균, 효모를 16S rRNA 및 ITS 염기서 열을 이용하여 동정 및 분석한 결과 바실러스는 Bacillus vallismortis로, 유산균의 경우 Lactobacillus paracasei로 동정되었으며, 효모는 ITS primer로 PCR 증폭이 되지 않아 세균동정을 실시하였다. 그 결과 Bacillus cereus ATCC14579로 법적금지균인 식중독균 으로 동정 되었다. 배양실B에서 제공한 바실러스, 유 산균, 효모, 광합성균의 종균을 동정한 결과 바실러스 는 Bacillus amyloliquefactiens, 유산균은 Lactobacillus casei로, 효모에서는 Saccharomyces cerevisiae로 정상적으로 나왔으나 광합성균은 Rhodobacter sp.이 아닌 Proteus sp.로 동정 되었다(Fig. 1).

    지속 가능한 농업발전을 위하여 화학적 비료와 화 학 약제의 사용은 국제적으로 제한하는 추세이다. 이에 따라 친환경 농업에 이용 가능한 농업미생물이 주목을 받고 있으며 우리나라도 각 시·군 지자체의 농업기술센터가 농업인들을 위하여 농업미생물을 생산, 제작, 배포하여 친환경농업을 지원하고 있다. 유기농업 또는 친환경 농업으로의 전환에서 농축산 미생물을 이용한 무기질소(Lee et al. 2012)의 효율 개선, 가축 분뇨의 에너지화 및 활용(Heo et al, 2008)등 농업미생물의 활용 및 요구도가 증가 하고 있다. 그러나, 대량배양 시 투입되는 종균의 관리 가 체계적으로 이루어지지 않아 목적에 맞는 균을 제대로 배양하지 못하고 때로는 인체에 해로운 미 생물을 대량배양하고 있는 것으로 나타났다. 각 센 터의 종균 관리를 체계적으로 확립하여 이러한 문 제를 예방해야 할 것이다.

    2 배지 효율 검사

    농축산미생물배양실B에서 사용하는 미생물과 산 업용 배지를 이용하여 배양 효율을 측정하였다. 그 결과 광합성세균(Rhodobacter sp.) 산업용 배지는 배양이 전혀 되지 않은 것으로 나타났다(Fig. 2). 대량으로 구매하는 산업용 배지의 경우에는 납품 시 기에 따라 품질의 편차가 클 수 있으므로 정기적으 로 미생물의 배양이 효율적으로 이루어지는지 검사 가 필요할 것으로 사료된다.

    3 혼합균(EM) 생산물 pH 검사

    농축산미생물을 농가들에 배포 시 다목적으로 사 용하기 쉽게하기 위하여, 배양된 미생물을 혼합하여 배포하는 경우가 많았으며, 이에 따라 여러 종의 미 생물이 혼합된 종균(EM)을 구매하여 대량배양을 진 행하고 있는 곳이 다수 존재하였다. 특정 미생물만 배양되기 쉬운 조건인지 알아보기 위하여 pH를 검 사한 결과 모든 혼합배양액은 pH 3~4 정도로 나타 났다(Fig. 3). 이러한 결과는 적정 pH가 6~8 정 도인 바실러스나 광합성세균, pH가 5~6 정도인 초산균은 도태되었을 가능성이 매우 크며 적정 pH 가 2~6인 효모나 pH가 3~6인 유산균이 우점 하여 배양될 가능성이 크다. 이는 원래의 취지인 다목적 성에 적합하지 않으며, 혼합 배양이 성공할지라도 배양상태에 따라 매번 균의 비율이 달라질 가능성이 크므로 혼합하여 배양하지 않고 단일 종의 균주를 배양 후 혼합하는 것이 적합하다고 판단된다.

    또한 혼합하여 배양하는 형태인 혼합균(EM)의 사용은 효능이 불분명하고, 배양시 각종 문제가 발 생한는 것으로 조사되어 혼합균(EM)의 사용을 지 양해야 한다. 혼합균(EM)의 경우 배양 시 특정 균 만 자랄 가능성이 크고, 단일균만 배양했을 때 보 다 오염 확인이 힘들며 사소한 환경적 영향에도 배 양결과가 크게 다를 가능성이 높다. 혼합균(EM)은 토양 특성 및 식물성장에 아무런 영향을 미치지 않 는다는 연구(Schweinsberg‐Mickan and Mü ller, 2009)가 있을 뿐만 아니라 EM이라는 단어의 창시 자인 Higa Teruo도 EM균의 식물에 대한 긍정적인 효과가 재현성에 문제가 있다는 점을 인정한 적이 있다(Higa and Parr, 1994).

    4 농축산 미생물의 효능 검사

    농축산미생물배양실에서 배양, 보급하는 바실러 스, 유산균, 효모, 광합성세균, 질소고정균이 농축산 업에 유용하게 이용될 수 있는지 알아보기 위하여 철 이온 흡착력, 단백질분해, 키틴분해, 셀룰로스 분해 능력 및 주요 작물 병원균에 대한 길항력을 조 사하였다. 그 결과 바실러스에서 철 이온 흡착력, 단백질분해, 키틴분해, 셀룰로스 분해 능력이 있었 고, 질소고정균에서 철 이온 흡착력이 발견되었으며 나머지는 이러한 능력이 관찰되지 않으며(Table 1) 대치배양을 통해 길항력을 육안으로 확인하였을 때 뚜렷하게 길항력을 나타내는 것은 바실러스가 유일 하였다(Fig. 4). 그리고 유산균에서 미미한 인산가 용화가 확인되었으며 나머지 미생물에서는 모두 인 산가용화, 질소고정력, 식물호르몬 분비능력이 없는 것으로 나타났다(Table 2). 농업미생물을 구매 할 때 사용목적에 맞게 미생물의 효능을 객관적으로 평 가하여 실제로 효과가 있는 미생물인지 판단해야 할 것으로 사료된다.

    5 배양시설의 미생물 오염도 검사

    배양시설의 공기로 인한 오염을 알아보기 위하 여 공기 중 미생물 밀도를 세균과 진균으로 나누 어 조사하였다. 미생물배양실의 공기 중 부유 미생 물을 측정한 결과 평균적으로 A센터의 경우 세균 은 2.23×104CFU/m3, 진균은 1.18×104CFU/m3로 확인되었으며, 배양실 B의 경우 평균적으로 세균은 3.83×104CFU/m3, 진균은 1.46×104CFU/m3로 확 인되었다(Fig. 5). 시설 환경이 유사할 것으로 보 이는 식품제조공장의 2011년도 조사결과에서는 일 반구역, 준 청결구역, 청결구역의 부유세균의 평균 밀도는 각각 2.2×103CFU/m3, 1.2×103CFU/m3, 7.3×102CFU/m3로 구획별 차이가 다소 있는 것으로 보고되었으며, 부유 진균은 2.0×103~2.6×103CFU/m3 로 구획 간 큰 차이를 보이지 않았다(Gwak et al., 2011). 환경이 유사한 식품제조공장과 비교해 보았 을 때 공기 중 부유 미생물의 밀도가 10배에서 100 배가량 높은 것으로 나타났으며, 대량배양 시 부유 미생물에 의한 오염 위험성이 높을 것으로 판단된 다. 그러므로 배지에서 생성되는 에어로졸에 의한 오염 예방 및 정기적인 배양시설 소독이 필요한 것 으로 판단된다.

    6 살모넬라, 병원성대장균, 황생포도상구균 오염 검사

    사용종균의 동정 결과 일부가 인체 유해 미생물 로 동정이 되었고 배양시설이 오염에 취약한 것으 로 판단되어 법적 금지 인체 유해 미생물 검사를 실시하였다. 농축산미생물배양실 B의 바실러스, 유 산균, 효모, 광합성균, 질소고정균과 농축산미생물 배양실 J의 바실러스, 유산균, 효모를 사용하였으 며 혼합종균을 이용한 배양액의 경우 8개소의 농축 산미생물배양실에서 혼합배양액을 수거하여 검사를 진행하였다. 그 결과 B센터에서 효모균에서 식중독 을 일으킬 수 있는 살모넬라와 바실러스가 검출되 었으며, 광합성균에서도 식중독을 유발하는 바실러 스가 검출되었다(Table 3). J의 경우에는 바실러스 에서 식중독을 일으키는 살모넬라가 검출되었다. 혼합배양액의 경우 농축산미생물배양실 A에서 식 중독을 유발하는 대장균, 황색포도상구균, 바실러 스가 검출되었다(Table 4).

    인체 유해 미생물의 경우 농가들에게 배포가 된다 면 농민들의 건강까지 해칠 수 있을 뿐만 아니라 생 과일의 경우 소비자의 건강까지 해칠 우려가 있으 며, 축산용으로 사용한다면 가축의 건강상태도 매우 큰 피해가 예상된다. 그러므로 정기적으로 배양액 검사를 통해 이러한 인체 유해 미생물이 있는지 판 단을 해야 하며, 검출된다면 폐기 시 멸균을 통하여 이러한 유해 미생물이 자연환경에 대량으로 노출되 는 일이 없도록 조치하여야 할 것이다.

    안전한 농업미생물 자재의 안정적인 공급은 지속 가능한 농업발전에 기여 할 수 있을 것이며, 국민들 에게 안전한 먹거리를 지속적으로 제공할 수 있다는 측면에서 농업미생물 산업은 공공성 기능이 매우 높 다고 할 수 있다. 이에 따라 국가적으로 산업에 필 요한 측면을 판단하고, 전문인력 공급에 대한 단계 적인 방안모색이 필요하다.

    감사의 글

    본 연구는 농림축산식품부 농림수산식품기술기 획평가원 농업생명산업기술개발사업(과제번호 315 004-5)의 지원에 의해서 이루어진 것임.

    Figure

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    Identification of stock microorganisms.

    JALS-53-1-1_F2.gif

    Microorganism growth in industrial media used by center B. In legend, Center B indicated a commercial media and TSA represented laboratory quality media.

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    pH of mix cultured microorganisms products. The letters on each column represented different source of the product.

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    Phytopathogenic fungi inhibition assay with microorganism, which are used for mass production.

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    Frequence of bacteria and fungi in culture room air.

    Table

    Enzymes activity of microorganism in center B

    Plant positive ability test in center B’s microorganism

    Human pathogens test with Center B’s microorganism

    Food poisoning bacteria test with the mix-cultured microorganisms

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