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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.52 No.3 pp.55-62
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2018.52.3.55

Genome-wide Association Study Identifies Positional Candidate Genes Affecting Birth Weight Trait in Purebred Landrace

Ho-Chan Kang1, Jae-Bong Lee2, Chae-Kung Yoo3, Tae-Jeong Choi4, Hyun-Tae Lim1,3*
1Division of Applied Life Science(BK21 plus), Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea
2Korea Zoonosis Research Institute(KoZRI), Chonbuk National University, Iksan, 54531, Korea
3Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea
4Swine Science Division, National Institute of Animal Science, RDA, Cheonan, 31000, Korea
Corresponding author: Hyun-Tae Lim Tel: +82-55-772-1945 Fax: +82-55-772-1949s_htim@gnu.ac.kr
August 1, 2017 October 23, 2017 November 15, 2017

Abstract


Birth weight represents an important trait that has an economic value because it is closely associated with survival and mortality. This study aimed to identify positional candidate genes associated with birth weight of purebred Landrace pigs using genome-wide association study(GWAS). Based on the analysis of genes significantly associated with birth weight, a single nucleotide polymorphism(SNP) marker that is significant at genome-wide suggestive level was identified on chromosome 3(ASGA0098921, P=2.41×10-5) and 4(H3GA0013451, P=2.47×10-5), respectively. These three genes(LOC110260055, LOC100156472, LOC100157689) containing each SNP marker individually are positional candidate genes associated with birth weight of purebred Landrace pigs. Therefore, the results of this study can be used for fundamental studies required to select an optimal birth weight range for the purebred Landrace pigs.



전장유전체 관련성 분석을 통한 순종 랜드레이스 생시체중 형질의 위치상 후보유전자 탐색

강 호찬1, 이 재봉2, 유 채경3, 최 태정4, 임 현태1,3*
1경상대학교 응용생명과학부(BK21 plus)
2전북대학교 인수공통전염병연구소
3경상대학교 부속 농업생명과학연구원
4농촌진흥청 국립축산과학원 양돈과

초록


돼지의 생시체중은 생존율과 폐사율에 밀접한 관련이 있어 양돈산업에서 자돈 관리와 직결된 중요한 경제형질이다. 본 연구는 Genome-Wide Association Study(GWAS) 분석을 통해 순종 랜드레이스의 생 시체중과 관련된 위치상 후보유전자 탐색을 실시하였다. 생시체중의 유의적 관련 분석 결과, genomewide suggestive level에서 유의성 있는 single nucleotide polymorphism(SNP) marker는 3번 염색체 (ASGA0098921, P=2.41×10-5)와 4번 염색체(H3GA0013451, P=2.47×10-5)에서 각각 1개씩 동정되었 다. 이들 SNP marker가 위치한 3개의 유전자(LOC110260055, LOC100156472, LOC100157689)들은 순 종 랜드레이스 생시체중의 위치상 후보 유전자이며, 이들 유전자 정보를 이용해서 순종 랜드레이스 생시 체중을 선발할 수 있는 기초 연구 자료가 될 것으로 사료된다.



    Rural Development Administration
    PJ009971032017

    서론

    돼지의 경제형질은 일당증체량, 생시체중, 도체 중, 사료효율 등이 있는데 이중 생시체중은 태어났 을 때의 무게를 말한다. 자돈의 생시체중이 낮으면 면역 및 압사 등 외부적 요인에 의해서 생존율이 감소하게 되고 양돈 농가의 자돈 폐사율이 증가 하 게 된다. 낮은 생시체중은 이유 후의 발육에 부정 적 영향을 미치게 되고(Milligan et al., 2002), 출 하 적정 무게까지 도달하는 출하일수도 늘어나게 되어 그에 따른 사육비용 또한 증가하게 된다. SCA Nutrition(2000)에서 발표한 Feed Evaluation Unit에 따르면 자돈의 생시체중이 1.2kg 이상일 경우 자돈의 생존율이 약 59% 향상 되었고, 생시체중이 0.5kg 더 높으면 이유 시 체중이 1kg 이상 증가됨을 보고하였 다. 따라서 생시체중이 이후 생존율과 성장률에도 영향을 미치는 것을 알 수 있다(Jang et al., 2011).

    Milligan et al.(2002)와 Foxcroft et al.(2006) 이 보고한 내용에 의하면 높은 산자수를 가지고 태 어난 새끼들은 생시체중이 낮은 경향이 있다고 보 고 하였다. 또한 현재 생시체중에 대해 유전적 향 상 가능성과 낮은 생시체중을 가진 산자들에 초점 을 맞춘 연구가 이루어지지 않고 있어 돼지 생산성 에 관해 생시체중의 중요성을 놓치고 있다. 따라서 생시체중은 유전적 소인이 영향을 미치기 때문에 돼지에서의 생시체중 표현형을 빠르게 개선하기 위 해서는 Marker assisted selection(MAS)와 같은 방식이 필수적이다(Zhang et al., 2014).

    Genome-Wide Association Study(GWAS)에 널리 사용되는 DNA chip 기술은 여러 genome project 로부터 축적된 많은 양의 유전정보를 사용하여 시료 를 효율적으로 분석할 수 있는 장점을 가지고 있다 (Fan et al., 2006). GWAS 분석을 통해 SNP marker 와 개체의 표현형 정보를 이용하여 가축에서 경제적 인 형질에 영향을 미치는 유전자들을 동정 할 수 있 게 되었으며, 유전적인 능력 평가의 정확도를 높여 가축의 유전적 개량을 효율적이고 빠르게 활용 가능 하기 때문에 가축에서도 개체간 변이가 나타나는 SNP marker를 이용하여 개체를 선발하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다(Gianola et al., 2006; Verbyla et al., 2009).

    이에 본 연구는 순종 랜드레이스 집단의 생시체중 과 관련하여 GWAS 분석을 수행하고 유의적인 genome 상 위치 및 후보유전자를 탐색하고자 실시 하였다.

    재료 및 방법

    1 공시 동물 및 DNA 추출

    국내 S 종돈장에서 순종 랜드레이스 집단 706두 (수컷 85두, 암컷 621두)의 혈액을 제공 받았다. Genomic DNA 추출에 사용된 혈액의 양은 1ml을 사용하였으며, 채혈한 혈액에서 gDNA의 분리는 Sucrose-Proteinase K법을 이용하여 분리 하였다 (Birren et al., 1997).

    2 생시체중 형질 측정

    순종 랜드레이스 축군 706두의 생시체중을 측정 하였고, 통계분석에 앞서 측정된 형질은 MINITAB 프로그램(Minitab Inc., USA)에서 구현이 되는 Ryan- Joiner 방법(1976)을 이용하여 normality test를 실 시하고 이상치를 제거하였다.

    3 데이터 기초분석 및 GWAS

    MINITAB 프로그램을 이용하여 고정효과와 데이터 의 정규성을 검증하였으며, 혈액에서 추출된 gDNA를 이용하여 Porcine SNP 60K bead chip(Illumina, USA) Ver.1(62,163개)과 Ver.2(61,565개)의 SNP marker 유전자형 분석을 실시하였다. 이중 56,503개 의 공통된 SNP marker를 분석에 사용하였으며, Plink 프로그램 version 1.07(Purcell et al., 2007)을 이용하여 quality control 하였다. Minor allele 빈도 5% 미만, 유전자형분석 오류 10% 초과, Hardy- Weinberg 평형 오류 P-value 10-6 이하에 해당되 는 SNP marker들을 제거하였다. 최종적으로 상염 색체상의 37,639개 SNP marker를 선발하여 가계 보정을 Genome-wide Complex Trait Analysis (GCTA, Yang et al., 2011) 프로그램의 mlma command를 이용하여 GWAS 분석을 하였다. 선형 회귀 분석 식을 이용하여 SNP marker와 생시체중 과의 관련성 분석을 하였다.

    y   =   X b   +   Z 1 a   +   Z 2 u   +   e
    식 (1)

    여기서, y는 생시체중의 표현형 벡터를 말한다. 또한 b는 고정효과로서 성 및 batch이다. Batch는 각 개체가 태어났을 때 어미의 산차를 나타내었다. a는 SNP marker의 고정효과이며, u는 임의 상가 적(random additive) 효과벡터이고 그 평균과 분산 은 u~N(0, Gσa2)을 말한다. G는 유전체 관계 행렬 (genomic relationship matrix, 37,639 SNP markers), σa2는 상가적 유전 분산이다. e는 임의잔차 벡터이 며 그 평균과 분산은 e~N(0, 1σe2)를 말한다. I는 항등행렬, σe 2는 잔차 분산이다. Z₁은 a에 대한 빈 도 벡터, X와 Z₂는 각각 b와 u에 대한 빈도 행렬임 을 말한다.

    GWAS 분석에서 쓰인 SNP marker는 additive model로 분석하였으며, 임계수준(Suggestive threshold level)은 Bonferroni adjusted genome-wide suggestive 유의 수준(Bonferroni adjusted threshold : 1/상염 색체상의 SNP marker수)으로 하였다. Bonferroni threshold에 대해 각 염색체 별 SNP marker를 확 인하고, 이들 marker와 가장 근접한 유전자를 위치 상 후보 유전자로 탐색하였다. 후보유전자 탐색은 NCBI dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp, map ver. 11.1)을 사용하였고, 유의적으로 확인된 SNP marker의 위치를 기준으로 가장 근접하거나 포함되어 있는 유전자를 위치상 후보유전자로 동정 하였다.

    동정된 후보 SNP marker와 주변 SNP marker간 의 연관성을 보기 위해 R 프로그램의 snp.plotter (Luna & Nicodemus, 2007) package를 이용하여 유의성 있는 SNP로 확인된 marker의 연관 불평등 (LD, Linkage disequilibrium) 분석을 실시하였다.

    결과 및 고찰

    순종 랜드레이스 집단 706두 중 결측치와 이상치 를 제외한 703두(수: 82두, 암: 621두)의 생시체중 평균값과 표준편차는 1.477±0.2546kg이고, 최소값 은 0.8kg, 최대값은 2.5kg이었다(Table 1).

    Porcine SNP 60K beadchip 분석을 통하여 생성 된 56,503개의 SNP marker 중 Plink 프로그램을 이용하여 minor allele frequency(MAF) < 0.05, genotyping error > 0.1, Hardy Weinberg equilibrium (P-value ≤ 10-6)을 만족시키는 37,639개 상염색체 의 SNP marker를 확인 하였으며, 이 SNP marker 와 생시체중 형질 사이의 관련성 분석을 통하여 SNP marker의 Manhattan plot과 Quantile-quantile(QQ) plot을 작성하였다(Fig. 1).

    Bonferroni 임계수준(genome-wide suggestive level)을 만족하는 SNP marker는 염색체 3, 4번에서 동정되었다. 3번 염색체에서 1개의 SNP marker [ASGA0098921(P= 2.41 × 10-5)], 4번 염색체에서 1개의 SNP marker[H3GA0013451(P= 2.47 × 10-5)] 가 동정되었다(Table 2).

    생시체중과 관련하여 기존에 보고된 QTL은 염색체 17, Y를 제외한 나머지 염색체에 총 119개가 보고되 어 있다(Animal QTLdb, http://www. animalgenome. org/cgi-bin/QTLdb/SS/index).

    4번 염색체에서 Walling et al.(2000)이 보고한 QTL은 41.8-102.8 cM(23.8-120.5 Mbp)에 위치 하고 있었으며, 본 논문의 결과와 overlapping 되 는 것을 확인할 수 있었다. 4번 염색체에서 동정 된 H3GA0013451 SNP marker의 위치상 후보유 전자 LOC100156472(olfactory receptor 6N1), LOC 100157689(olfactory receptor 6N2)은 olfactory receptor family gene으로 인간과 침팬지 등에게서 G-protein coupled receptor activity, olfactory receptor activity 기능을 하는 것으로 보고되어 있 다(Wetterbom et al., 2009; Jassal et al., 2010).

    4번 염색체에서 동정된 2개의 후보유전자에 대 하여 Choquette et al.(2012)은 음식물 섭취 습관 과 비만 관련 형질에 영향을 미치는 것을 보고 한 바 있다. 또한 Primeaux et al.(2013)은 Olfactory receptors가 지방성의 음식물을 감지하는 역할을 한 다고 보고 하였다. 따라서 동정된 2개의 후보유전자 는 출산 이후에 성장 속도와 성장 관련한 형질에도 영향을 미칠 수 있다고 생각 된다.

    Malek et al.(2001)과 Liu et al.(2008)은 3번 염 색체에서 생시체중과 관련성을 보이는 QTL을 보고 하였다. Malek et al.(2001)이 보고한 QTL은 19 cM 에 위치하고 있고 Liu et al.(2008)이 보고한 QTL 은 17.8-60.5cM(14.8-62.8Mbp)에 위치하고 있어 본 논문의 결과와 overlapping 되지 않았다. 본 연구 결과로 확인된 3번 염색체의 ASGA0098921 SNP marker는 LOC110260055를 위치상 후보유전자로 탐색 하였으나, LOC110260055의 유전자 기능에 대 한 정보를 확인할 수 없었다.

    이전 연구에서 Schneider et al.(2012)은 랜드레 이스와 듀록, 요크셔 3원교잡축군 1,152두를 GWAS 분석과 bootstrap 분석 방법을 이용하여 1번 염색체 의 15Mb에 위치한 유전자 2개와, 13번 염색체 156Mb, 14번 염색체 7.8Mb, 47Mb, 15번 염색체 141Mb에 위치한 유전자들을 후보유전자로 선정하 여, 이들 염색체가 생시체중과 관련성이 있다고 보 고한 바 있다. 또한 Wang et al.(2016)은 Suzhong 집단 82두의 GWAS 분석을 이용하여 1, 7, 13, 14, 15, 18번 염색체에서 생시체중과 연관이 있는 SNP marker 249개를 동정 하였다.

    이 같은 결과와 차이점을 보이는 이유는 품종, 표 본 수, 교배 방식 등의 차이와 통계 분석 방법의 차 이 때문으로 여겨진다. GWAS 분석에 앞서 실시한 quality control의 결과로 선발된 SNP marker 차 이 또한 영향을 준 것으로 보인다.

    Beaulieu et al.(2010)는 복당산자수가 증가함으 로 인해 태어난 개체의 평균 생시체중이 감소하는 것을 보고 하였다. 생시체중의 감소로 인해 이유 후, 5주령, 7주령의 무게 또한 감소한 것을 확인 할 수 있었으며, 출하 일령이 증가한 것을 알 수 있었다. 낮은 생시체중과 연관하여 높은 동복산자수를 가지 고 태어난 개체는 출산후에 근육과 지방조직의 장애 로 인해 성장이 방해 받을 수 있다고 보고된 바 있 다(Powell & Aberle, 1980; Handel & Stickland, 1987). 이와 같이 실험에 이용된 개체들의 복당산자 수의 차이가 생시체중에 영향을 미치게 된 것으로 생각된다.

    뿐만 아니라 Friend & Cunningham(1966), Motsi et al.(2006)은 모돈에서 출산이 될 때 순서 또한 영향을 미친다고 보고한 바 있어 이 또한 개체의 체 중에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다.

    GWAS 분석 결과 3번 염색체의 유의적인 SNP marker는 1.1Mb 영역에서 동정되었고, 4번 염색체의 유의적인 SNP marker 1.4Mb 영역에서 검출 되어 snp.plotter를 이용하여 나타내었다(Fig. 2, Fig. 3).

    본 연구에서 순종 랜드레이스 집단의 생시체중 형 질에 대한 GWAS 분석을 수행한 결과 genome-wide suggestive level에서 관련성을 보이는 genome 상 위치를 확인할 수 있었으며, 유의적으로 확인된 3, 4번 염색체의 3개 유전자는 다른 독립적인 축군에서 반복 실험 및 추가적인 기능 연구를 통하여 생시체 중의 위치상 후보유전자로서 돼지 생시체중을 선발 할 수 있는 기초 연구 자료가 될 것으로 사료된다.

    감사의 글

    본 연구에 참여한 대학원생은 교육과학기술부 BK21Plus 사업의 장학금을 수혜 받았으며, 농촌진 흥청 공동연구사업(과제번호: PJ009971032017)의 지원에 의해 이루어진 것이며, 연구비 지원에 감사 드립니다.

    Figure

    JALS-52-55_F1.gif

    Manhattan plot(P-value) of genome-wide association study of birth weight. SNPs locate their position on each chromosome against on the x-axis and the association signal on the y-axis(shown as -log10 of the P-value). (A) It is research that association between birth weight and 37,639 mapped SNP marker in 18 pig autosomes using additive model. (B) Quantile-quantile plots of SNP marker.

    JALS-52-55_F2.gif

    Association results and LD presented exploiting of purebred landrace data obtained from snp.plotter. SNPs name and their position are locate on x-axis and -log10 of the P-value on y-axis. Dotted lines represent P-value thresholds. It is purebred Landrace SSC3 of snp. plotter results.

    JALS-52-55_F3.gif

    Association results and LD presented exploiting of purebred landrace data obtained from snp.plotter. SNPs name and their position are locate on x-axis and -log10 of the P-value on y-axis. Dotted lines represent P-value thresholds. It is purebred Landrace SSC4 of snp.plotter results.

    Table

    Descriptive statistics of birth weight in purebred Landrace

    1)N: Number of animal
    2)BW: Birth Weight

    GWAS results of SNP markers for birth weight trait in purebred Landrace

    1<i>Sus scrofa</i> chromosome
    2NCBI annotation Ver. 11.1
    3Minor/major allele
    4Minor allele frequency.

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