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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.51 No.5 pp.39-45
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2017.51.5.39

Development of Diagnostic System for Rapid and Specific Detection of Cherry leaf roll virus

Jin-Ho Kim1, Siwon Lee2, Seung-Hun Jeon1,3, Min-Seon Kim1,3, Won-Cheoul Jang1,3*
1Department of Chemistry, College of Natural Science, Dankook University, Cheonan, 31116, Korea
2LSLK Co., Incheon, 22714, Korea
3Institute of Tissue Regeneration Engineering(ITREN), Dankook University, Cheonan, 31116, Korea
Corresponding author : Won-Cheoul Jang +82-41-529-6256+82-41-559-7860wcjang@dankook.ac.kr
20170529 20170717 20170817

Abstract

Cherry leaf roll virus(CLRV) is a plant virus of belonging to Nepovirus, group IV positive sense ssRNA viruses. CLRV has a wide host range, and it has been found in up to 36 families, including cherry, woody plant and pea families. When related crops were infected by CLRV, it cause to significant national, economic and farm damage. Reverse transcription (RT)-nested polymerase chain reaction(PCR) is used as the major technique for the detecting CLRV from various hosts being that important of sensitivity, specificity, reaction time and simple. However, two-steps nested PCR was not simple and need more ten hours reaction time for detecting CLRV. For simple and rapid detection of CLRV, using the loop-mediated isothermal amplification(LAMP) assay was developed, this study. In the results, LAMP reaction showed similar sensitivity compare with RT-nested PCR. However, running time was reduced to approximately two hours, and can more specific detection of CLRV using six regions LAMP primers.


Cherry leaf roll virus의 신속 및 특이적 진단을 위한 등온증폭법 개발

김 진호1, 이 시원2, 전 승훈1,3, 김 민선1,3, 장 원철1,3*
1단국대학교 화학과
2랩슬리코리아
3단국대학교 조직재생공학연구소

초록

Cherry leaf roll virus(CLRV)는 group IV positive sense ssRNA viruses, Nepovirus로 분류되는 식물병원성 바이러스이다. CLRV는 체리 등 목본 및 완두 등 콩과 작물을 자연 기주로 하며, 실험적으로 약 36개 과 이상의 넓은 기주 범위를 가지고 있어 국가적, 경제적 및 농가 개인적 피해를 야기 할 가능 성이 보고되고 있다. 현재 CLRV를 검출하는 방법으로 역전사(reverse transcription; RT)-nesdted 중 합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 이 활용되고 있으며, 다양한 기주로부터 CLRV를 검출하기 위해서는 검출 감도, 특이성, 반응 시간, 단순성 등이 중요 요소였다. 그러나 RT-nested PCR은 두 단계로 구성되어 있어 단순하지 않고, CLRV를 검출하는데 약 10시간 이상의 반응 시간이 소 요되었다. 이번 연구에서는 등온증폭법을 이용하여 단순하고 신속하게 CLRV를 검출하는 방법을 개발하 였다. 등온증폭 반응은 RT-nested PCR과 동등한 검출 감도로 CLRV를 검출 하였다. 그러나 반응 시간 을 약 2시간 수준으로 단축하였으며, 6개 영역을 사용하는 등온증폭 프라이머의 사용으로 더욱 특이적 으로 증폭 할 수 있었다.


    서론

    Cherry leaf roll virus(CLRV)는 Group IV(+) sense ssRNA viruses, Nepovirus 속으로 분류되며, 유럽, 남아메리카, 뉴질랜드 등에서 보고되고 있는 식물병 원성 바이러스이다(Sanfaçon et al., 2009). CLRV 는 식물의 36개 이상의 과(family)에 감염되는 등 기주 범위가 매우 넓으며, 주요 기주는 체리, 베리류, 완두 등의 목본 식물로 알려져 있다(Jones, 1985). CLRV가 감염된 식물체에서는 잎 표면에 백화, 구형 의 반점, 모자이크, 옆맥 황화 및 고사 증상 등으로 작물의 손실을 가져올 수 있으며(SPHDS, 2016), 즙 액, 종자, 선충 및 화분 수정 등을 통해 감염된다 (Lee et al., 2013). CLRV는 국내에 보고되지 않은 바이러스지만, 농산품 수출입이 증가하고 있는 추세 이며 넓은 기주 범위를 고려했을 때, 유입 시 커다 란 경제적 피해가 예상되기 때문에 검출이 빠르고 민감성이 높은 검사법의 개발이 필요한 실정이다 (Buchhop et al., 2009; Eastwell et al., 2012).

    이전에는 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용한 검출 방법이 오랫동안 사용되었으 나, 검사과정에 소요되는 많은 시간, 낮은 민감도, 거짓 양성반응과 같은 단점이 있다(Caruso et al., 2003; Priou et al., 2006). 최근에는 이를 보완하기 위해 nested polymerase chain reaction(PCR)이 나 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription; RT-PCR) 등이 새로운 검출 방법으로 사용되고 있다. 이러한 방법들은 특이성이 높지만, 전용 thermal cycler 장비를 필요로 하고 증폭시간이 10-11시간 소요가 된다는 한계가 있다(Parida et al., 2008; Sidoti et al., 2013). 따라서 이러한 단점들을 보완 하여 CLRV를 빠르게 검출할 수 있는 새로운 방법 이 필요하다.

    본 연구에서 사용한 loop-mediated isothermal amplification(LAMP)는 helicase 활성이 포함된 Bst. DNA polymerase를 사용하기 때문에 동일한 온도에 서 핵산 증폭이 가능하며, 전용 thermal cycler 장 비를 사용하지 않고 항온 수조나 오븐을 사용하여 증폭할 수 있다. 또한, 4개의 특이적 프라이머(FIP, BIP, F3, B3)를 통해 6개의 특이적 염기서열 부위를 인식하여 1시간 이내에 더욱 민감하고 특이적으로 증폭이 가능하다. 개발된 초기에는 비 특이적 증폭 및 거짓 양성반응 등으로 진단법에는 적용하기 어렵 다는 의견이 검토된 바 있었다(Notomi et al., 2000). 그러나 최근 효소를 포함한 다양한 시약과 비 특이적 증폭을 방지하기 위한 조건이 개선됨에 따라 식 물, 동물 및 환경 등 다양한 분야에서 적용되고 있다. Suwancharoen et al.(2016)은 61℃에서 90-120분간 반응을 하였고, 그 후 80℃에서 열을 가함으로써 비 특 이적인 증폭을 막고자 하였다(Suwancharoen D et al., 2016). Gallas-Lindemann et al.(2016)은 Loop F와 Loop B primer를 포함한 총 6개의 프라이머를 사 용하여 8개의 특이적 염기서열 부위를 인식하였다 (Gallas-Lindemann et al., 2016). 따라서 본 연구 에서도 특이적 조건을 포함한 LAMP assay를 활용 하여 현장에서 CLRV를 신속하고 특이적으로 진단 하기 위한 검사법을 개발하였다.

    재료 및 방법

    1.시료수집 및 cDNA의 합성

    검사법 개발대상 바이러스인 CLRV, Tomato black ring virus(TBRV), Grapevine fanleaf virus(GFLV), Carnation ringspot virus(CRSV), Little cherry virus(LchV) 및 Strawberry latent ringspot virus (SLRSV)는 감염되어 있는 식물의 조직을 국립식물 검역원(현 농림축산검역본부)의 금지품 수입허가를 통 해 수입하였다(ADGEN, England)(Lee et al., 2013). Tobacco ringspot virus(TRSV), Tomato ringspot virus(ToRSV), Raspberry ringspot virus(RpRSV) 및 Prune dwarf virus(PDV)는 국내 기업(PLITOS, Korea)에서 구매하였다. 시료로부터 RNA 추출은 RNA-spinTM IIPRNA extraction kit(iNtRon, Korea)을 사용하여 170-200ng/μL의 농도로 추출하 였고, cDNA는 ReverTra Ace-α-®(TOYOBO, Japan) 를 사용하여 100μL의 부피로 합성하였다.

    2.등온증폭법을 위한 특이적 프라이머 디자인 및 반응조건

    CLRV의 특이적 등온 증폭 primer 제작을 위하여, CLRV(GeneBank accession number JN104386.1, 7,905 bp) 및 참고바이러스 9종(TRSV, ToRSV, TBRV, GFLV, RpRSV, CRSV, LchV, PDV, SLRSV) 의 염기서열들을 미국 국립생물정보센터 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)로부 터 수집하였다(Table 1). 수집한 염기서열은 BioEdit (Ver. 7.1.3, USA)를 사용하여 정렬 후, LAMP primer designing software PrimerExploer(Eiken, Japan) 를 사용하여 52.5℃-55.1℃를 조건으로 CLRV의 특 이적 등온 증폭 primer 2sets를 설계하였다(Table 2). 비교 실험 대상인 nested PCR에 사용할 프라이머는 국내 검역 바이러스 검사법과 동일한 방법으로 제작 하였다(Lee et al., 2014).

    CLRV를 검출하기 위한 등온 증폭 primer의 선별 을 위하여, CLRV 및 참고바이러스 9종의 cDNA를 주형으로 각각 반응을 수행하였다. 등온증폭법의 시 약조성은 주형 cDNA 1.5μL(100ng/μL), LAMP reaction buffer 2μL(1X; 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4)2SO4, 10mM KCl, 2mM MgSO4, 0.1% TritonX- 100), 10mM dNTP 2μL(2.5mM each), F3와 B3 primer(10pmol) 각각 0.6μL, FIP 및 BIP primer (10pmol) 각각 1.4μL, Bst. polymerase 1.5μL(8U/μL, New England Biolabs, USA)를 포함하였다. 조건 은 95℃ 10분, 4℃ 1분 후, Bst. Polymerase를 첨 가하였고, 그 후 62℃에서 1시간 동안 반응하였다. CLRV LAMP 반응의 증폭 산물 4μL을 Midori Green Nucleic Acid Staining Solution(Nippon genetics, Japan) 0.4μL와 섞어, 30분 동안 2% 아 가로오스 겔(New England Biolabs, USA)에서 전 기영동장치 Mupid-α(Advance, Japan)를 사용하여 전개하였으며, 증폭 산물은 Gel DocTMXR+Imaging System(BioRad,USA)을 사용하여 확인하였다.

    결과 및 고찰

    CLRV를 특이적으로 진단할 수 있는 Inner 프라 이머(FIP and BIP) 2개와 Outer 프라이머(F3 and B3) 2개가 제작되어 총 2개의 조합을 설계하였다 (Table 2). 총 2개의 프라이머 조합을 대상으로 특 이적 분석을 수행한 결과 1번의 조합은 CLRV에서만 증폭 산물이 나타났으며, 9종의 유연관계가 있는 바 이러스에서 특이적인 반응이 나타나지 않았다. 반면 2번 조합은 CLRV에서 증폭이 되지 않았으며, 9종의 유연관계가 있는 바이러스에서 8종(TRSV, ToRSV, TBRV, GFLV, RpRSV, CRSV, LchV, PDV)의 바이 러스들과 negative가 증폭이 되었다. 이러한 결과가 나타난 이유로는 LAMP의 민감성 때문에 유연관계 에 있는 바이러스가 증폭되었거나 loop를 형성하는 프라이머의 self annealing으로 인한 증폭을 의심할 수 있다. 따라서 2번 조합의 프라이머를 제외하고 1번 조합의 프라이머를 선별하였다(Fig. 1A).

    선별된 1번 프라이머 조합을 대상으로 LAMP의 검출감도를 분석하기위해 RT-nested PCR 방법과 비교하고자 하였다. 이를 위해 CLRV의 cDNA 원액 을 희석하여(100 - 10-9), 위 두 가지 방법으로 반응 을 진행했다. 먼저, LAMP의 증폭산물의 경우 연쇄동 일방식으로 증폭하기 때문에 겔 상에서 사다리 모양 으로 확인된다. Lane 4(10-3), 5(10-4), 9(10-8)의 경 우 증폭된 산물처럼 보이지만 사다리 모양으로 끌림 현상이 없고, 다른 lane(6, 7, 8, 9)에 있는 dimer와 비교하였을 때 비슷한 현상을 나타내기 때문에 증폭 하였다고 말할 수 없다[Fig. 1B(1)]. RT-nested PCR 의 경우 lane 1(100), 2(10-1), 3(10-2) band 위에 non-specific band처럼 보이지만 nested PCR의 경 우 1차 증폭, 2차 증폭을 하는데 1차 PCR 증폭산물 의 크기는 673bp이고, 2차 PCR 증폭산물의 크기는 313bp이다. 따라서 non-specific band는 1차 PCR 증폭 산물이며 농도가 진하기 때문에 끌림 현상처럼 보인다(Fig. 1B(2)). 결과적으로, 두 방법 모두 10-2 수준의 민감도를 가진 것으로 확인되었다(Fig. 1B).

    2007년 이후, 종자전염검역바이러스를 진단하기 위해 개발된 PCR 기반 검사법들은 검역현장에 적용 되어 사용되고 있다. 이전에 사용하였던 ELISA 검 사법으로 검출할 수 없었던 바이러스들이 PCR 기반 검사법이 시행되며 검출 실적이 크게 향상되었다 (Lee et al., 2013). 하지만 국내에서 시행되고 있는 PCR 기반 검사법의 경우 시간이 오래 걸리기 때문 에 좀 더 빠르고 정확하게 증폭이 가능한 방법의 개 발 필요성이 증가하고 있다. 본 연구에서 개발한 LAMP는 특수한 온도조절장치 없이 동일한 온도를 유지시켜 줄 수 있는 항온 수조나 오븐과 같은 간단 한 장비가 있으면 실험실 외부 현장에서도 반응할 수 있다. 이를 통하여 특별한 교육 없이 시약의 배 합만을 이용해 증폭을 가능하게 함으로써, 사용자에 대한 편리성을 높일 수 있다는 장점을 갖고 있다 (Ahn et al., 2008). 또한, 동시에 반응할 수 있는 튜브 수가 증가하기 때문에, 검출과정에 있어 다양 한 시료를 빠르게 모니터링할 수 있을 것이다(Ahn et al., 2008, Cho et al., 2013). 그리고 CLRV 특 이적 LAMP 프라이머 조합은 기존의 RT-nested PCR 검사법과 비교하였을 때, 동일한 검출 감도를 보이는 것으로 확인되었다. 그러나 LAMP assay는 정성적 양성 진단에 필요한 분석 시간을 약 10시간 이상에서 약 2시간으로 단축하였고, CLRV에 대한 특이성이 높다는 결과를 확인하였다. 이러한 결과는 이번 연구뿐만 아니라 이전에 연구된 Wheat Streak Mosaic Virus(WSMV)와 SLRSV 검출을 위한 연구 에서도 확인한 바 있다(Lee et al., 2015; Kim et al., 2016). 하지만 이 연구는 실제 감염이 된 종자 시료를 얻을 수 없어 구매한 표준 시료에서 진행하 였기 때문에, 모니터링 및 교차실험을 통해 문제점 들을 보완한다면 이번 연구에서 개발한 LAMP 진단 법이 현장에서 사용가능한 CLRV 검출 방법으로 활 용할 수 있을 것이라 기대된다.

    Figure

    JALS-51-39_F1.gif

    Optimal selection of LAMP conditions for detecting Cherry leaf roll virus (A) and compare sensitivity of LAMP and RT-nested PCR assay for detecting Cherry leaf roll virus (B).

    (A) - Lane M, 100bp step DNA Ladder maker; lane 1 and 2, CLRV; lane 3 and 4, Tobacco ringspot virus; lane 5 and 6: Tomato ringspot virus; lane 7 and 8: Tomato black ring virus; lane 9 and 10: Grapevine fanleaf virus; lane 11 and 12: Raspberry ringspot virus; lane 13 and 14: Carnation ringspot virus; lane 15 and 16: Little cherry virus; lane 17 and 18: Prune dwarf virus; lane 19 and 20: Strawberry latent ringspot virus; lane N1: Negative control of primer set 1; N2: Negative control of primer set 2. Lane1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 and N1, LAMP product with primer set 1; Lane2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 and N2, LAMP product with primer set 2.(B) – Amplicons of LAMP assay (1) and amplicons of RT-nested PCR method using CLRV cDNA dilution series. Same lane numbers are same diluted value in (1) and (2), respectively. Lane M, 100bp step DNA Ladder maker; lane 1, 100; lane 2, 10-1; lane 3, 10-2; lane 4, 10-3; lane 5, 10-4; lane 6, 10-5; lane 7, 10-6; lane 8, 10-7; lane 9, 10-8; lane 10, 10-9; lane N, Negative control.

    Table

    List of plant viral genes for using the loop-mediated isothermal amplification primers design

    Information of LAMP primer sets for the rapid and specific detection of Cherry leaf roll virus

    Reference

    1. Ahn Y.C. , Nam Y.H. , Park S.M. , Cho M.H. , Seo J.W. , Yoon I.K. , Park Y.H. , Jang W.C. (2008) Detection of Mycobacterium tuberculosis by loop-mediated isothermal amplification. , J. Korean Chem. Soc., Vol.52 ; pp.273-280
    2. Buchhop J. , von Bargen S. , BA1/4ttner C. (2009) Differentiation of Cherry leaf roll virus isolates from various host plants by immunocapture-reverse transcription-polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism according to phylogenetic relations. , J. Virol. Methods, Vol.157 ; pp.147-154
    3. Caruso P. , Bertolini E. , Cambra M. , LA3pez M.M. (2003) A new and sensitive co-operational polymerase chain reaction for rapid detection of Ralstonia solanacearum in water. , J. Microbiol. Methods, Vol.55 ; pp.257-272
    4. Cho M.H. , Jang W.C. , Choi J.G. (2013) Detection for methicillin resistant Staphylococcus aureus in using bio-chip based loop mediated isothermal amplification assay. , J. Korean Chem. Soc., Vol.57 ; pp.81-87
    5. Eastwell K.C. , Mekuria T.A. , Druffel K.L. (2012) Complete nucleotide sequences and genome organization of a cherry isolate of Cherry leaf roll virus. , Arch. Virol., Vol.157 ; pp.761-764
    6. Gallas-Lindemann C. , Sotiriadou I. , Plutzer J. , Noack M.J. , Mahmoudi M.R. , Karanis P. (2016) Giardia and Cryptosporidium spp. dissemination during wastewater treatment and comparative detection via immunofluorescence assay(IFA), nested polymerase chain reaction(nested PCR) and loop mediated isothermal amplification(LAMP). , Acta Trop., Vol.6 ; pp.43-51
    7. Jones A.T. (1985) Cherry leaf roll virus. AAB Descriptions of plant viruses No. 306., Association of Applied Biologists,
    8. Kim J.H. , Lee S. , Choi J.Y. , Kim S.K. , Jang W.C. (2016) Development of simple and rapid diagnostic method for Strawberry latent ring-spot virus in plants using loop-mediated isothermal amplification assay. , J. Plant Pathol. Microbiol., Vol.7 ; pp.377
    9. Lee S. , Kim J.H. , Choi J.Y. , Jang W.C. (2015) Loop-mediated isothermal amplification assay to rapidly detect Wheat streak mosaic virus in quarantined plants. , Plant Pathol. J., Vol.31 ; pp.438-440
    10. Lee S. , Cha M.J. , Kim S.M. , Heo N.Y. , Shin Y.G. , Lee S.H. (2014) Development of nucleotide primers for dignostic RT-PCR and nested PCR detection of three seed-transmitted viruses(CRLV, SpLV and WClMV) in quarantine. , J. Agric. Life Sci., Vol.48 ; pp.75-83
    11. Lee S. , Kang E.H. , Shin Y.G. , Lee S.H. (2013) Development of RT-PCR and nested PCR for detecting four quarantine plant viruses belonging to Nepovirus. , Res. Plant Dis., Vol.19 ; pp.220-225
    12. Notomi T. , Okayama H. , Masubuchi H. , Yonekawa T. , Watanabe K. , Amino N. , Hase T. (2000) Loopmediated isothermal amplification of DNA. , Nucleic Acids Res., Vol.28 ; pp.E63
    13. Parida M. , Sannarangaiah S. , Dash P.K. , Rao P.V. , Morita K. (2008) Loop mediated isothermal amplification(LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. , Rev. Med. Virol., Vol.18 ; pp.407-421
    14. Priou S. , Gutarra L. , Aley P. (2006) An improved enrichment broth for the sensitive detection of Ralstonia solanacearum(biovars 1 and 2A) in soil using DAS-ELISA. , Plant Pathol. J., Vol.55 ; pp.36-45
    15. Sanfaçon H. , Wellink J. , Le Gall O. , Karasev A. , van der Vlugt R. , Wetzel T. (2009) Secoviridae: a proposed family of plant viruses within the order picornavirales that combines the families sequiviridae and comoviridae, the unassigned genera cheravirus and sadwavirus, and the proposed genus torradovirus. , Arch. Virol., Vol.154 ; pp.899-907
    16. Sidoti F. , Bergallo M. , Costa C. , Cavallo R. (2013) Alternative molecular tests for virological diagnosis. , Mol. Biotechnol., Vol.53 ; pp.352-362
    17. SPHDS (2016) National diagnostic protocol for Cherry leaf roll virus, CLRV(cherry and walnut strains)., Australian Government Department of Agriculture,
    18. Suwancharoen D. , Limlertvatee S. , Chetiyawan P. , Tongpan P. , Sangkaew N. , Sawaddee Y. , Inthakan K. , Wiratsudakul A. (2016) A nationwide survey of pathogenic leptospires in urine of cattle and buffaloes by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method in Thailand, 2011-2013. , J. Vet. Med. Sci., Vol.78 ; pp.1495-1500
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