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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.47 No.6 pp.137-144
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2013.47.6.137

닭의 NRAMP-1 유전자 내 변이의 경제형질과의 연관성 분석

공홍식*
한경대학교 유전정보연구소

Association of SNPs from NRAMP-1 Genes with Economic Traits in Chicken

Hong Sik Kong*
Genomic Informatics Center, Hankyong National University, Anseong 456-749, Korea
Received: JUN. 4. 2013, Revised: SEP. 10. 2013, Accepted: OCT. 24. 2013

Abstract

NRAMP-1 (Natural Resistance Associated Macrophage Protein 1) plays a role in restriction ofmicrobe replication in macrophages. It is involved in the genetic control of Salmonella spp. loadin chicken spleen. NRAMP-1 gene is located on chromosome 17. This study was performed toinvesti gate the effect of a NRAMP-1 SNP (C3229T) on the economic traits in Rhode Island Red(RIR). C3229T changed amino acid from serine to phenylalanine. Statistical analyses revealed thatthe C3229T polymorphism in the PLTP gene were significantly associated with average bodyweight at 150 days in RIR (P < 0.05). Therefore, NRAMP-1 SNP (C3229T) will be useful for thegenetic improvement of body weight in chicken as well health trait.

0090-01-0047-0006-16.pdf208.6KB

Ⅰ. 서론

 선천성 면역은 인간, 가축, 가금 등에 바이러스, 병원성 미생물 등이 체내 또는 체외에 침입하였을 때 일어나는 일차 방어체계로서 간, 폐, 비장 등에서 대식세포 및 수지상세포와 같은 선천성 면역세포에 의해 수행되며 위험인자에 반응하여 이들을 제거하고 싸이토카인, 키모카인 등을 생성하여 생체 내 감염을 알리는 역할을 수행한다(Malek et al ., 2003, 2004).

 NRAMP-1 (Natural resistance associated macrophage protein 1) 유전자는 백서에서 세포 내 병원체에 대한 감수성 및 내성을 가지고 있는 유전자로서 발견되었다. NRAMP-1 단백질은 약 60kD의 분자량을 가진 소수성 단백질이며 대식세포의 초기 활성화 과정에 영향을 주어 항암, 항균 작용을 조절하고, 대식세포의 막 운반에 있어서 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2007). NRAMP-1 유전자는 닭의 경우 7번 염색체에 존재하고 있으며 레그혼 종에서 살모넬라에 감염되었을 때 NRAMP-1 유전자내 변이가 비장의 면역반응에 영향을 주어 맹장의 장내 균총의 변화를 주는 것으로 보고되었다(Liu et al, 2003; Kramer et al., 2003). 또한 NRAMP-1유전자는 103.6 cM에 위치하고 있으며, 44 cM에서 165 cM 사이에서 몸무게와 연관된 QTL이 존재하고 있다고 보고되었다(Jacobsson et al., 2005).

 NRAMP-1 유전자는 이 QTL 영역 내에 위치하고 있으며, 이는 NRAMP-1 유전자는 닭의 면역과 관련된 중요한 역할을 수행하고 있고, 몸무게와 관련된 주요 형질에도 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다.

 한국 재래닭은 육용으로 이용하기에는 성장률이 낮아 사육기간이 길고, 출하체중이 낮아 경제적이지 못하기 때문에 한국 재래닭의 성장관련 형질의 개량이 필요하다(Kang et al., 2012; Park et al., 2010; Kweon et al., 1995).

 따라서 본 연구는 3개의 품종(로드아일랜드 레드, 코니쉬, 한국 재래닭)을 대상으로 NRAMP-1 유전자 내 변이지역 분석을 통해 각 품종의 유전특성 및 경제형질과의 연관성 분석을 실시하고 분석된 결과를 분자육종 기술 개발의 기초자료로 활용하고자 실시하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

2.1 공시 재료

 본 연구에 사용된 공시재료는 국립축산과학원 가금과에서 사육 중인 닭 288수(로드아일랜드 레드 96수, 코니쉬 96 수, 한국 재래닭 96 수)를 제공 받아 공시 재료로 활용하였다. Table 1은 본 연구에 사용된 공시 축군의 품종별 각 경제형질(시산일령, 시산난중, 산란수, 150일령 몸무게, 270일령 몸무게, 270일령 난중)에 대한 평균 값 등을 제시하였다.

Table 1. Mean and Standard deviation of each economic traits in populations.

2.2 Genomic DNA 분리

 혈액으로부터 genomic DNA 분리는 채취되어진 혈액을 chemagic DNA Blood 100 Kit(Chemagent, Germany)를 이용하여 지첨서에 따라 추출하였으며, 실험 전 까지 -20℃에서 보관하였다.

2.3 NRAMP-1 유전자 증폭 및 유전자형 분석

 NRAMP-1 유전자 내 변이지역을 포함한 유전자 증폭을 위해 사용된 primer는 Lamont 등(2002)의 논문과 NCBI의 유전자 정보 NC_006094를 참고하여 제작하였다(Table 2, Fig. 1). PCR(polymerase chain reaction) 반응액은 25 ng의 주형 DNA와 200 nM의 dNTP, 25 pmole 농도의 유전자의 primer, 2.5 U의 Taq polymerase, 및 10X PCR buffer(10mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.4 mM MgCl2 및 1% Triton X-100)을 포함하여 총 20 ㎕로 조제하였다. 반응조건은 94℃, 5분 denaturation 과정 및 94℃, 30초, 각 유전자별의 조건에 맞는 annealing 온도에서30초, 72℃ 40초간의 과정을 각 유전자별 조건에 맞춰 35회 반복하였으며 최종적으로 72℃의 extension 과정을 거쳐 유전자의 증폭을 실시하였다.

Fig. 1. Single nucleotide polymorphism(SNP) map of the avian NRAMP-1 gene. The coding exon is marked by white block, 5’ and 3 UTRs by Gray.

Table 2. Primer design for PCR-RFLP analysis of avian NRAMP-1 gene.

 NRAMP-1 유전자내 변이(C3229T)를 확인하기위해 PCR product 2 ㎕에 1 U의 제한효소(SacI), 10X 제한효소 버퍼 1 ㎕ 그리고 증류수를 첨가하여 총 10 ㎕로 조제하였다. 제한효소 반응 온도와 시간에 맞춰 반응 시킨 후 EtBr이 첨가된 1.5% 아가로즈에서 전기영동을 실시하고 확인된 단편에 따라 유전자형을 결정하였다.

2.4 통계분석

 NRAMP-1의 C3229T변이지역과 경제형질과의 연관성 분석은 SAS 9.1(SAS. USA)의 일반선형모형(GLM)을 이용하여 실시하였다. 전체 축군에 대한 유전자형과 경제형질간의 연관성 분석은 다음의 통계분석 모형을 이용하였다.

 

 상기모형에서.
Yijk = 대상형질에 대한 관측치
μ =  대상형질의 전체 평균
Breedi = 품종효과(i = 로드아일랜드 적색계, 코니쉬, 재래닭)
Gj = 유전자형(Genotype)의 효과
eijk = 임의 오차

각 품종(로드아일랜드 레드, 코니쉬, 재래닭)에 대한 유전자형과 경제형질간의 연관성 분석은 다음의 통계분석 모형을 이용하였다. 

 

Yij = 대상형질에 대한 관측치
μ = 대상형질의 각 품종 (로드아일랜드 레드, 코니쉬, 재래닭)별 전체 평균
Gi = 유전자형(Genotype)의 효과
eij = 임의오차

Ⅲ. 결 과

3.1 NRAMP-1의 유전자형 분석

 전체 288수(한국 재래닭 96수, 로드아일랜드 레드 96수, 코니쉬 96수)를 대상으로 NRAMP-1 유전자의 변이지역(C3229T)에 대한 유전자형을 결정하였다. NRAMP-1 유전자형 결정을 위해 제한효소(SacI)를 이용하여 확인한 결과 CC, CT 그리고 TT였다. 제한효소로 절단된 유전자형은 총 3개의 단편(801 bp, 721 bp 그리고 80 bp)이 확인되었고, CC유전자형은 801 bp, TT 유전자형은 721 bp와 80 bp로 확인되었으며, CT 유전자형은 801 bp, 721 bp 그리고 80 bp로 단편이 확인되었다(Fig. 2).

Fig. 2. The C3229T SNP variation in the avian NRAMP-1 gene visualized by 1.5% agarose gel. Agarose gel displaying a SacI restriction digeston an amplified portion of Chicken NRAMP-1 gene. M:100 bp ladder; TT: 720 bp and 79 bp; CT: 801 bp, 720 bp and 79 bp; CC: 801 bp.

 닭의 NRAMP-1 유전자 내에서 분석된 유전자형의 출현 빈도를 분석한 결과 로드아일랜드 레드는 CC유전자형이 0.2, CT 유전자형은 0.083 그리고 TT유전자형이 0.717로 나타났으며, 코니쉬의 경우 CC형이 0.054, CT 유전자형이 0.203 그리고 TT 유전자형이 0.743으로 확인되었다. 한국 재래닭에서는 CC유전자형이 0.195, CT 유전자형은 0.364 그리고 TT 유전자형이 0.441로 나타났다(Table 3).

Table 3. Genotype frequencies of the C3229T in the avian NRAMP-1 gene.

3.2 전체 축군에 대한 경제형질과의 연관성 분석

 전체 공시축을 하나의 분석 대상 축군으로 하여 품종 효과를 고려해 NRAMP-1 유전자 내 변이지역(C3229T)과 경제형질간의 연관성을 분석하여 Table 4에 제시하였다. 전체 축군에서 NRAMP-1 유전자의 변이와 경제형질간의 연관성을 분석한 결과 유의적인 연관성(p<0.05)은 검출되지 않았다.

Table 4. Effect of the polymorphism in the avian NRAMP-1 gene on the economic traits in the population

3.3 각 품종별 축군에 대한 경제형질과의 연관성 분석

 각 품종(로드아일랜드 레드, 코니쉬, 재래닭) 각각에 대한 유전자형과 경제형질에 따른 연관성 분석을 수행하였다.

 Table 5는 로드아일랜드 레드에서 변이지역과 경제형질간의 연관성 분석 결과를 제시하였으며, 150일령 몸무게에서 유의적인 연관성이 검출되었다(p<0.05), 로드아일랜드 레드의 유전자형별 150일령 몸무게를 분석한 결과 CC 유전자형이 179.17±7.778, CT유전자형이 191.00 ± 19.052 그리고 TT유전자형이 159.17 ± 4.157 것으로 확인되었으며, CC유전자형(179.17 ±7.778)과 TT 유전자형(159.17 ± 4.157) 간의 차이가 유의적인(p<0.05) 것으로 나타났다.

Table 5. Effect of the polymorphism (avian NRAMP-1) on the economic traits in Rhode Island Red chickens.

 코니쉬 품종에서 NRAMP-1 유전자의 변이지역과 각 경제형질과의 연관성을 분석한 결과 유의적인 연관성이 확인되지 않았으며(Table 6), 재래닭 품종에서도 경제형질과의 연관성을 분석한 결과 모든 형질에서 큰 차이를 보이지 않았으며, 유의적인 연관성도 확인되어지지 않았다(Table 7).

Table 6. Effect of the polymorphism (avian NRAMP-1 gene) on the economic traits in Cornish chickens.

Table 7. Effect of the polymorphism (avian NRAMP-1) on the economic traits in Korea Native chickens.

Ⅳ. 고 찰

 NRAMP-1의 유전자는 백서에서 최초 발견되었고, 인간에서는 백서와 상동성을 비교하여 발견하였다. 사람과 가축 등을 대상으로 NRAMP-1 유전자를 연구한 결과 대식세포의 초기 활성화 과정에서 다양한 영향을 나타내어 면역 반응을 조절하고, 대식 세포의 막 운반과정에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 감염 초기에 대식세포 세포질 내의 아질산염을 포식용해소체 내부로부터 2가 양이온을 제거하여 항산화효소의 작용을 억제하여 병원균을 사멸시키는데 중요한 역할을 한다. 닭에서의 NRAMP-1 유전자는 변이에 따라 살모넬라균에 감염되었을 시에 비장의 변화에 영향을 주고 맹장의 장내 균총의 변화에도 영향을 주는 것으로 보고되어 있다(Liu et al., 2003; Kramer et al., 2003). 또한 QTL D/B(www.animalgenome.org) 탐색 결과 NRAMP-1 유전자는 103.6 cM에 위치하고 있으며, 이 위치는 McElroy et al.,(2006), Nassar et al.,(2012) 그리고 Jacobsson et al.,(2005)에 의해 보고된 복강 지방 중량, 가슴 근 무게 그리고 몸무게와 연관된 QTL이 각각 86~109 cM, 72~109 cM 그리고 44~165 cM상에 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 NRAMP-1 유전자는 닭의 면역과 관련된 중요한 역할을 수행하고 있으며, 또한 몸무게와 관련된 주요 형질에도 영향을 미칠 수 있을 것으로 사료된다.

 NRAMP-1 유전자의 12번 exon 지역에 위치하고있는 C3229T 지역은non-synonymous SNP로 serine에서 phenyl-alanine으로 변하고, 본 연구 결과 로드아일랜드 레드 C3229T변이지역은 150일령 몸무게에서 유의적인 결과가 확인되었으며, 코니쉬와 한국 재래닭에서는 유의적인 결과가 확인되지 않았다. 이러한 결과는 특정 형질에 대한 QTL 영역 내에는 다양한 유전자와 유전변이들이 존재하고 있으며, 이들의 유전적 구조는 특정 형질에 다양한 영향을 주게된다. 특히 유전자내 변이들의 유전적 구조는 LD(Linkage Disequilibrium) 분석을 통해 확인할 수 있으며 유전적 구조에 따라 품종별로 그 특성이 분류 될 수 있다(Gautier et al, 2007; Amaral et al, 2008; Megens et al, 2009). 따라서 품종별 유전적 구조의 차이에 따라 동일한 유전변이가 형질에 미치는 효과가 다르게 나타날 수 있으며 분자 육종기술의 개발을 위해서는 품종에 따른 유전적 구조의 특성 및 효과에 대한 이해가 필요할 것으로 사료된다. 그리고 샘플의 좀 더 다양하고 많은 개체에서 추가적인 연구가 진행된다면 코니쉬와 재래닭에서도 좀 더 정확한 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다. 향 후 NRAMP-1 유전자를 포함하고 있는 QTL영역 내에 유전변이들에 대한 LD분석 및 유전 구조분석을 통해 질병 저항성 및 몸무게와 관련된 형질에 대한 주요 유전변이인자 탐색이 가능할 것으로 사료된다.

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