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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.47 No.6 pp.211-218
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2013.47.6.211

Enterococcus faecium 193이 생산하는 bacteriocin의 특성

이종현, 최충국*
경상대학교 동물생명과학과 (농업생명과학연구원)

Characteristics of a Bacteriocin Produced by Enterococcus faecium 193

Choong-Kuk Choi*, Jong-Hyun Lee
Dept. of Animal Bioscience (Insti. of Agric. & Life Sci.), Gyeongsang National Univ., Jinju 660-701, Korea
Received: NOV. 15. 2013, Revised: DEC. 1. 2013, Accepted: DEC. 2. 2013

Abstract

This study was conducted to investigate the possibility of using E. faecium 193 or itsbacteriocin as natural food preservative or feed supplement. E. faecium 193 was isolated from fecalsamples of piglets for its strong inhibition activity against Listeria monocytogenes.. During growthof E. faecium 193 in MRS broth at 37°C, inhibition activity of culture supernatant began toappear after 3 hours and increased to maximun value of 1280 AU/ml after 12 hours incubation.Enterocin 193, a bacteriocin produced by E. faecium 193, was sensitive to proteolytic enzymessuch as trypsin, pepsin and proteinase K, active over a wide range of pH being most stable at apH between 1 and 6, and resistant to heat (121°C, 15 min). The bacteriocin was very stable tothe treatment with solvents such as chloroform, ethanol, acetone and acetonitrile, but its activitywas decreased by 50% after being treated with 50% methanol. Enterocin 193 was purified byammonium sulfate precipitation, hydrophobic chromatography and gel filtration with 14.8-foldincrease in specific activity, and its molecular weight was determined to be 5 kDa by SDS-PAGE.

 

0090-01-0047-0006-23.pdf234.0KB

Ⅰ. 서론

 Enterococcus는 통성 혐기성 그람 양성 구균으로서 17종이 보고되어 있고, 젖산균에 포함된다. Enterococci는 사람과 동물뿐만 아니라 토양, 표층수, 식품 및 채소에도 존재하고, 다양한 생태적 적소에서 분리되며, 젖산발효식품의 우점균으로 나타나기도 하고, 위생상태의 지시균으로 간주되기도 한다(Franz et al., 2003).

 Enterococci는 유사한 박테리아에 대해 항균활성을 갖는 작은 펩타이드인 박테리오신을 생산한다. 박테리오신은 라이보좀을 통해 합성되고 세포외로 분비되는 생물활성 펩타이드로서 부패균, 식중독균, 전염병균 및 포자형성세균의 증식을 억제하거나 사멸시킨다. 단백질이므로 섭취 시 소화기관의 분해효소에 의해 분해되어 인체에 무독성이고 pH와 열에대한 안정성이 높아서 생물학적 보존제 내지 생물제 어제로서 그 효용이 크다.

 Enterococcus faecium 균종들에 의해 생산되는 enterocins중에서 enterocin A (Aymerich et al., 1966), B (Casaus et al., 1977), L50A와 L50B Cintas et al., 1998), I (Floriano et al., 1998), Q (Cintas et al., 2000) 등이 정제되었고 자세히 연구되었다. 항균범위는 다양하여 EntL50A와 EntL50B는 상승적으로 작용하고 넓은 항균범위를 나타내는데 Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens 및 Clostridium botulium 등의 식중독균과 Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguis, 및 Streptococcus agalactiae 등의 사람과 동물의 병원균을 포함한다. Enterocin 1071A와 1071B는 감수성 세균의 세포막을 투과하여 항균활성을 나타내며(Balla et al., 2000), enterocin AS-48는 Bacillus cereus의 성장 속도를 감소시키고, 균체내 독소 및 포자 생성을 억제시키는 것으로 알려져 있다(Abriouel et al., 2002). Franz et al., (2007)은 enterocins를 Class I enterocins (lantibiotic enterocins), Class II enterocins (pediocin 계열, 선도 펩타이드 없이 합성되는 enterocins, Class III enterocins (고리형 항균 펩타이드) 및 Class IV enterocins로 분류하였다.

 이 연구에서는 생균제 또는 천연 보존제로서 이용할 목적으로 자돈의 분변으로부터 분리한 Enterococcus faecium 193이 생산하는 박테리오신의 특성을 조사하였고, 황산암모늄 침전, 소수성 크로마토크래피 및 젤 여과 크로마토그래피로 부분 정제하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

2.1 박테리오신 생산 균주의 배양

 Enterococcus faecium 193은 자돈의 분변에서 분리된 균주로서, 식중독 균인 Listeria monocytogenes를 지시균주로 agar spot method (Tagg et al., 1976)로 억제여부를 검사 했을 때 다른 분리균주들보다 월등히 강한 억제력을 나타내어 이 실험에 사용하였다. Enterococcus faecium 193을 MRS 배지에 0.5% 접종하고 37℃에서 16시간 배양액을 원심분리(7000 rpm, 30 min, 4℃)하고, 0.2㎛ Nylon membrane filters(Gelman sciences, USA)로 여과 멸균한 것을 박테리오신 용액으로 사용하였다.

2.2 박테리오신의 활성 측정

 박테리오신 용액의 항균 활성은 한천확산법으로 측정하였다(Cintas et al., 2000). 즉 50 ㎕의 병원성 미생물의 배양액을 10 ㎖의 0.7% 반고체 tryptic soy medium과 혼합하여 준비된 tryptic soy medium plate의 표면에 중층하고, 직경 5 ㎜의 구멍을 내었다. 분리 균주의 배양 상등액 50 ㎕를 접종하여 31℃에서 24시간 동안 배양하였다. 억제환을 형성한 최대 희석배수의 역수에 환산계수를 곱하여 AU (arbitary unit)/㎖로 표기하였다(Liu and Hansen, 1990).

2.3 박테리오신 생산 최적조건 조사

 최적 배양온도를 확인하기 위해 검사 균주를 MRS broth에 0.5% 접종하고 20℃, 25℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃ 38℃, 39℃, 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃ 및 45℃에서 16시간 동안 배양하였다.

 초기 배지의 pH가 박테리오신 생산에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MRS broth의 pH를 1 M HCl과 1 M NaOH로 pH 2.0에서 11.0까지 pH 1간격으로 조절하고, 0.2 ㎛ Nylon Membrane Filters로 여과 멸균하였다.

 배양시간에 따른 균수 및 박테리오신 생산은 검사균주를 MRS broth에 0.5% 접종하고 37℃에서 24시간 배양하면서 일정 시간별로 시료를 채취하여 생균수와 항균활성(AU/㎖)을 측정하였다. 생균수는 MRS agar에서 37℃, 24시간 배양 후 생성된 colony를 계수하여 측정하였다.

2.4 박테리오신의 성상 검사

 효소 안정성을 확인하기 위하여 lysozyme, trypsin, pepsin, proteinase K 로 처리한 다음 항균활성을 조사하였다. 각 효소의 최종 농도를 20 ㎎/㎖로 하여 37℃에서 2시간 30분까지 반응시키면서 30분 간격으로 채취한 시료를 95℃, 5분간 가열하여 효소작용을 정지시켰다.

 pH 내성은 1 M HCl과 1 M NaOH로 pH 2에서 pH 11까지 조정하여, 상온에서 1시간 처리하여 조사하였다. 열처리에 대한 내성은 다양한 온도(50, 60, 70, 80, 100℃)에서 20분 및 121℃에서 15분 동안 가열하고 상온으로 냉각시켜 조사하였다.

 유기용매의 영향은 박테리오신과 유기용매를 동량 혼합한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 잔존항균활성을 측정하였다.

 박테리오신의 항균범위는 Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, B. subtilis, Salmonella enteritidis, S. typhimurium, Staphylococcus aureus, Lactobacillus bulgaricus, L. acidophilus, L. casei, L. brevis, L. plantarum등을 지시균주로 하여 측정하였다.

2.5 박테리오신의 분리 및 정제

 Enterococcus faecium 193의 MRS broth 배양액 1 L를 원심분리(7000 rpm, 30 min, 4℃)하여 회수하고 0.2㎛ Nylon Membrane Filters로 여과 멸균한 상등액에 황산암모늄을 80% 농도(w/v)로 첨가하여 4℃에서 12시간 정치한 다음 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 침전물을 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) 10 ㎖에 용해시켰다.

 황산암모늄 침전물 2 ㎖를 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)로 평형화 시킨 Octyl Sepharose CL-4B column에 주입하여 Gutié rrez et al.(2006)의 방법에 따라 소수성 크로마토그래피를 실시하고 항균활성이 있는 분획을 건조시킨 다음 증류수 2 ㎖에 용해시켜 보관하였다.

 상기 분획을 Sephadex G-50 column (30 × 1.5cm)에서 증류수로 0.2 ㎖/min의 속도로 용출시켜 1㎖씩 분획하였다. 항균활성이 있는 분획을 건조시킨 다음 증류수 1 ㎖에 용해시켰다.

2.6 Tricine SDS-PAGE 전기영동

 정제한 박테리오신의 순도와 분자량 측정을 위해 Schägger and von Jagow (1987)의 방법에 따라 Tricine SDS-PAGE를 실시하였다. Polypeptide SDS-PAGE standards (Bio-rad)를 사용하였다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

3.1 Enterococcus faecium 193의 항균활성

 MRS broth 배양상등액의 Listeria monocytogenes에 대한 항균활성을 한천확산법으로 측정한 결과 64배 희석액에서 분명한 억제 환이 나타나서 1280 AU/㎖의 활성을 나타내었고, 배양 상등액의 단백질량을 Lowry method로 정량한 결과 489 ㎍/㎖이었다.

3.2. 박테리오신 생산 최적조건

 배양온도가 박테리오신 생산에 미치는 영향을 조사한 결과 Fig. 1와 같이 30-42℃에서 가장 높은 활성을 나타내었다. E. casseliflavus IM416K의 박테리오신 생산 최적온도는 18-45℃였고(Sabia et al., 2002), E. faecium P13은 16-45℃의 광범위한 온도에서 최대의 활성을 나타내었다(Cintas et al., 1997)

Fig. 1. Effect of temperature on the production of bacteriocin.

 배지의 초기 pH가 항균활성(AU/㎖)에 미치는 영향을 조사한 결과 초기 pH 7에서 가장 높은 항균활성을 나타내었다(Fig. 2). 박테리오신 생산의 최적 pH는 균주에 따라 다른 것으로 보고되었다(Herranz et al., 2001).

Fig. 2. Influence of initial pH of MRS broth on the production of bacteriocin.

3.3 배양시간에 따른 항균물질 생산

 E. faecium 193의 배양시간에 따른 성장과 항균 활성은 Fig. 3와 같다. 12시간째에 최대 균수에 도달했으며 이때의 pH는 4.0이었다. 각 시간별로 배양 상등액의 항균활성을 측정한 결과 3시간부터 지시균에 대한 억제활성을 보이기 시작하였고, 12시간에 1280 AU/㎖의 최대 항균활성을 나타내었으며 지속적으로 유지되었다.

Fig. 3. Growth and bacteriocin production of Enterococcus faecium 193 in MRS broth.

3.4 박테리오신의 성상조사

 각종 처리가 억제활성에 미치는 영향은 Table 1과 같다.

Table 1. Effects of various treatments on the inhibitory activity of crude enterocin 193

 부분 정제된 Enterocin 193을 trypsin, pepsin, proteinase K로 처리한 결과 항균활성이 소실되었고, lysozyme의 처리는 항균활성에 영향을 미치지 않았다. 이는 E. faecium 193이 생산하는 항균물질이 단백질임을 나타낸다.

 이 박테리오신은 80℃에서 20분 처리하였을 때 50%의 항균활성이 유지되었고, 100℃, 20분과 121℃, 15분 처리시 25%의 항균활성이 유지되었다.

 pH 2-7에서 안정하였으나 pH 8-11에서는 50%의 항균활성이 소실되는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 E. faecium 193이 생산하는 박테리오신은 비교적 열과 pH에 안정한 Class IIa박테리오신임을 나타낸다(Klaenhammer et al., 1993).

 Enterocin 193은 50%(v/v) acetone, acetonitrile, chloroform 및 ethanol에 대해서는 매우 안정하였으나, methanol을 최종 농도 50%(v/v) 처리할 경우 항균활성이 50% 감소하였다. 따라서 시험한 용매 중 methanol은 박테리오신의 항균활성을 감소시켜 FPLC를 통한 박테리오신의 정제용 용매로는 부적합함을 알 수 있었다.

3.5 항균범위 조사

 E. faecium 193의 MRS 배양상등액을 사용하여 항균범위를 조사한 결과는 Table. 2와 같다. Listeria monocytogenes와 Enterococcus faecium을 강하게 억제하였고, Lactococcus lactis subsp. lactis는 약하게 억제 하였으며, Bacillus, Staphylococcus 및 Salmonella등 다른 병원성 균주들은 억제하지 못했다. 이는 이 박테리오신이 강한 항리스테리아 활성을 가지며 항균범위가 매우 좁고, 특히 Lactobacillus를 억제하지 않아서 유산균 발효식품에 보존제로 이용될 수 있음을 시사한다.

Table 2. Inhibitory spectrum of the cell-free supernatant of E. faecium 193

3.6. 박테리오신의 분리 및 정제

 E. faecium 193의 MRS broth 배양 상등액의 specific activity는 2617 AU/㎎이었고, 80% 황산암모늄에 의한 침전물의 specific activity는 4491 AU/㎎으로 1.71배 증가하였고 회수율은 약 80%였다(Table 3).

Table 3. Purification of enterocin 193 from Enterococcus faecium 193

 황산암모늄에 의한 침전물 2 ㎖을 Octyl Sepharose CL-4B에 흡착시킨 후 1 M ammonium sulfate-10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)로 resin에 흡착되지 않은 단백질을 용출시키고, 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)와 40% ethanol로써 결합된 단백질을 용출시켰다. 활성을 보인 용출물의 specific activity는 16496 AU/㎎으로 6.3배 증가하였고 항균활성 회수율은 68%였다. 이 분획을 Sephadex G-50 column (30 × 1.5cm)에 주입 후 증류수로 용출시킨 활성 용출물의 specific activity는 38697 AU/㎎로 14.8배 증가하였다.

 정제된 박테리오신의 순도와 분자량을 측정하기 위하여 20% tricine SDS-PAGE를 실시한 결과는 Fig. 4와 같다. 분자량 표준시료와 비교한 결과 약 5 kDa 부근에서 밴드가 나타난 것을 확인할 수 있었다. E. faecium sp. T7에서 분리된 enterocin A의 분자량은 4.829 kDa으로 보고되었다(Moon et al., 2000).

Fig. 4. Tricine SDS-PAGE of purified enterocin 193.

Ⅳ. 감사의 글

 본 연구는 농촌진흥청 지역전략작목산학연협력사업(과제번호: PJ009659)의 지원에 의해 이루어진 것임.

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