서론

도체중(Carcass Weight, CW)은 양돈 농가에게 있어 중요한 경제형질이다. 도체중은 돼지의 도축과 정에서 방혈, 내장 및 머리 등을 제거한 후 중량을 말하는데, 도체의 가격 형성에 직접적인 영향을 미 치는 형질 중 하나로 등지방두께와 함께 등급판정의 1차 기준이 된다.

Rohrer & Keele(1998)가 돼지의 도체중 Quantitative Traits Locus(QTL)을 최초로 보고한 이래로 여러 연구 자들의 연구가 이어져 왔으나, 대부분이 Microsatellite (MS) 마커를 이용한 linkage QTL 연구이다(Geldermann et al., 2003; Vidal et al., 2005; Rückert & Bennewitz, 2010; Yoo et al., 2014). MS 마커를 이용한 도체중과 연관된 QTL 분석은 마커 간의 간격 이 넓기 때문에 신뢰구간에 의한 위치상 후보 유전자 를 동정하기에는 어려움이 있다. 하지만, 최근들어 single nucleotide polymorphism(SNP)을 이용한 대 용량 고밀도의 commercial chip이 개발되고 이를 이용한 연구가 활발히 이루어지고 있어 가축의 경제 형질에 영향을 주는 DNA 마커(or gene)를 찾기 위 한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 돼지의 경우, 여러 축군에 대한 신체 조절 관련 형질, 혈액 형질, 육질 형질, 생산 형질, 구조적 건유사료 형질 등 다 양한 형질에 관한 연구가 이루어지고 있다(Fan et al., 2011; Fernandez et al., 2012; Luo et al., 2012; Jung et al., 2014; Sanchez et al., 2014; Fontanesi et al., 2015).

최근 국내에서는 재래가축을 이용한 신품종 개발 에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 이중 돼 지의 경우 한국재래돼지(Korean native pig, KNP) 가 대표적이다. 한국재래돼지를 포함한 돼지 축군을 대상으로 commercial chip을 이용한 도체중과의 관 련성 보고는 Kang et al.(2013)이 Landrace와 한국 재래돼지의 교잡축군을 이용한 보고가 유일하다.

한국재래돼지는 오랫동안 한반도의 기후와 풍토에 도 잘 적응하는 강건성을 가지고 있으며, 육질이 좋 아 한국 소비자에게 선호도가 높지만, 개량종에 비 해 체구가 작고 등지방두께가 두껍고 사료효율, 도 체중, 정육량 등이 낮아 생산성이 떨어져 상업적으 로 이용 가치가 낮은 단점이 있다(Jin et al., 2001; Kwon et al., 2001; Choi et al., 2005; Kwon, 2006). 이에 비해 Duroc은 빠른 성장과 높은 산자 수 등의 특성을 가지고 있다(Rohrer et al., 2006). Muhlishin et al.(2014)은 Duroc과 한국재래돼지의 이종교배로 태어난 offspring이 한국재래돼지보다 도체중과 도체율이 더 높았고, Duroc과 한국재래돼 지의 교배는 도체형질의 생산성이 증가한다는 결과 보고한 바 있다.

본 연구는 Duroc과 한국재래돼지의 3세대 교잡축 군을 이용하여 도체중과 관련된 유의적인 genome 상 위치를 확인하고, 도체중 개량에 도움을 줄 수 있는 위치상 후보유전자 탐색을 하고자 실시하였다.

재료 및 방법

1.공시 동물

본 연구는 Duroc과 한국재래돼지의 상호교배로 이루어진 3세대 교잡 축군을 공시동물로 사용하였 다. 9마리 순종 Duroc과 5마리의 순종 한국재래돼 지와 교잡 시켰고, F₁ 36두와 F₂ 346두(187 수컷, 158 암컷)를 생산하였다. 돼지의 도축은 제주시 애 월읍 소재의 제주축협 도축장에서 24시간 계류 후 상업적 방법으로 도축하였으며, 도축 시 채혈을 실 시하였다. 혈액에서 genomic DNA(gDNA) 추출은 Sucrose-proteinase K법을 이용하였다(Birren et al., 1997). 추출된 gDNA는 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer(Thermo, USA)로 흡광도를 측 정하였고, A₂₆₀/A₂₈₀ 1.8이상인 DNA를 50ng/ul로 희석하여 분석에 이용하였다.

2.도체중 형질 측정

Duroc과 한국재래돼지 교잡축군의 F₂ 346두 도체 중은 190일령에 도축하여 측정하였다. 통계분석에 앞서 측정된 형질은 MINITAB 프로그램(Minitab Inc., USA)에서 구현이 되는 Ryan-Joiner 방법 (1976)을 이용하여 normality test를 실시하고 이상 치를 제거하였다. 결측치와 이상치를 제외한 295두 가 본 연구에 사용 되었다.

3.데이터 기초분석 및 Genome-wide association study

MINITAB 프로그램을 이용하여 고정효과와 데이터 의 정규성을 검증하였으며(Table 1), 교잡축군의 공 시축 혈액에서 추출된 gDNA를 이용하여 commercial chip의 유전자형 분석을 실시하였다. Illumina(USA) 에서 제공하는 Porcine SNP 60K bead chip의 61,565 SNP 마커를 분석하였고, 분석된 SNP 마커 data는 Plink 프로그램 version 1.06(Purcell et al., 2007)을 이용하여 quality control하였다. Minor allele 빈도 5% 미만, 유전자형분석 오류 10% 초과, Hardy-Weinberg 평형 오류 0.000001%(P-value) 이하에 해당되는 SNP 마커들을 제거 하였다. 최종 적으로 상염색체상의 39,306개 SNP 마커를 선발하 여 F₂ intercross 내 가계보정을 Genome-wide Complex Trait Analysis(GCTA, Yang et al., 2011) 프로그램의 mlma command를 이용하여 GWAS 분 석을 하였다. 선형 회귀 분석 식을 이용하여 SNP 마커와 도체중과의 관련성 분석을 하였다.

y = X b + Z 1 a + Z 2 u + e

여기서, y는 도체중 표현형 벡터, b는 성 및 배치 의 고정효과, a는 SNP 마커의 고정효과, u는 임의 상가적(random additive)효과벡터이며 그 평균과 분산은 u~N(0, σ a 2)을 따른다. 여기서, G는 유전 체 관계 행렬(genomic relationship matrix, 39,306 SNP 마커s), σ_a²는 상가적 유전 분산이다. e 는 임의잔차 벡터이며 그 평균과 분산은 e~N(0, I σ_e²)를 따른다. 여기서, I는 항등행렬, σ_e²는 잔차 분 산이다. Z₁은 a에 대한 빈도 벡터이며, X와 Z₂는 각 각 b와 u에 대한 빈도 행렬이다.

GWAS분석에서 쓰인 SNP 마커는 additive model 로 분석하였으며, suggestive 임계수준(suggestive threshold level)은 Bonferroni adjusted chromosomewide suggestive 유의수준(Bonferroni adjusted thresholds: 1/각 염색체별 SNP 마커의 수)으로 하 였다(Table 2). 따라서 본 연구의 suggestive 유 의 수준은 각 염색체를 검색 할 때 1회의 위양성 (false positive)이 검출 될 수 있는 수준으로 정하 였다. 각 염색체 별 SNP 마커를 Bonferroni threshold를 넘는 유의성 있는 SNP 마커에서 가장 근접한 후보 유전자를 탐색하였다.

GWAS를 통해서 동정한 QTL이 설명 할 수 있는 F₂ 교배집단의 상가적 표현형 분산(r²)를 아래의 공 식을 통해서 추정하였다.

r 2 = [ 2 p ( 1 − p ) a 2 / σ p 2 ]

여기서, σ p 2 는 ASReml(VSN international, UK) 프로그램을 이용하여 추정하였고, QTL의 상가적 유 전효과 a는 GCTA 프로그램을 이용하여 추정하였 다. p는 QTL의 minor allele frequency이다.

주어진 임계수준(alpha)과 검정력(1-beta)과 동정 된 QTL이 설명 할수 있는 r²에서, 유효 표본수 크 기(n)를 구하기 위하여 아래의 공식을 사용하였다 (Lynch & Walsh, 1998).

n = ( 1 − r 2 r 2 ) ( z ( 1 − [ α / 2 ] ) 1 − r 2 + z ( 1 − β ) ) 2

여기서, z값은 각 확률별 표준정규분포표의 해당 수치이다.

결과 및 고찰

Duroc과 한국재래돼지의 F₂ 교잡축군 295두(51두 의 데이터는 이상치에서 제거) 도체중의 평균 및 표 준편차는 69.7±11.63Kg이고, 최소값은 35Kg, 최대 값은 95Kg이었다(Table 1).

Porcine 60K beadchip 분석을 통하여 생성된 61,565개의 SNP 마커 중 minor allele frequency (MAF)<0.05, genotyping error>0.01, Hardy Weinberg equilibrium(P-value≤0.000001)을 만 족시키는 39,306개 상염색체의 SNP 마커를 확인 하였다. 이 SNP 마커와 도체중 형질 사이의 관련성 분석을 통하여 SNP 마커의 Manhattan plot, Quantile-quantile(QQ) plot 및 regional plot을 분석 하였다(Fig. 1).

Bonferroni 임계수준(chromosome-wide)을 넘는 SNP 마커는 Sus scrofa chromosome(SSC) 2, 4에 서 SNP 마커가 동정 되었다. SSC2에서 1개의 SNP 마커[ALGA0015365(P=0.0002)], SSC4에서 1개의 SNP 마커[ALGA0023678(P=0.00025)]로 전체 2개의 SNP 마커가 동정 되었다(Table 3). 도체중과 관련하 여 기존에 보고된 QTL은 SSC15, 17, 18, Y을 제외 한 나머지 염색체에 보고되어 있다(Animal QTLdb, http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/S S/index). 보고된 QTL 중 Rückert & Bennewitz (2010)은 Meishan×Pietrain, European wild boar× Pietrain, 그리고 European wild boar×Meishan cross에서 도체중과 관련성을 보이는 12개 염색체 (SSC1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16)를 보고하였다. 보고된 SSC4의 QTL은 27.1-87 cM(12.6-110.5Mbp)에 위치하고 있어 본 논문의 결 과와 overlapping되어 있었으며, ALGA0023678은 LOC100737583 위치상 후보유전자로 탐색을 하였다. LOC100737583은 유전자의 기능에 대한 정보가 없 었다. 또한 SSC2에서 ALGA0015365 SNP 마커와 가장 근접한 위치상 후보유전자 LOC100519538은 60S ribosomal protein L23a pseudogene이다.

적절한 크기의 표본수(sample size)가 본 연구에 사용 되었는지 살펴보기 위해서 Lynch & Walsh (1998)가 제시한 방법으로 통계적 검정력(statistical power) 분석을 수행하였다. 전체 F₂ 교배집단 표현형 분산 중에서 동정된 QTL이 설명 가능한 비율(r²)은 0.0831(ALGA0015365, 돼지 염색체 2번)과 0.0835 (ALGA0023678, 돼지 염색체 4번)으로서 상당히 비 슷한 수치를 보였다. 따라서, r²을 0.08이라고 설정 하고, alpha값이 0.0083(돼지 염색체 2번 및 4번에 서의 임계치)일때 QTL 동정을 위한 90%의 검정력 (1-beta)을 확보하기 위한 유효 표본크기를 구해 보 면, 285두로서, 295두인 본 연구에서 사용된 표본 크기가 위의 주어진 조건하에서 작은 표본크기라고 보기는 어렵다고 할 수 있다. 따라서, 본 연구에 쓰 인 295 두의 표본크기는 돼지 염색체 2번과 4번에 서의 임계치(alpha= 0.0083) 하에서 동정한 ALGA 0015365와 ALGA0023678들이 false positive signal 로 부터 구별 할 수 있는 표본 크기지만 더 큰 표본 수의 연구를 통해서 본 연구의 결과를 확정할 필요 가 있다고 생각된다.

Rückert & Bennewitz(2010)이 보고한 결과와 Qiu et al.(2010)는 Berkshire×Yorkshire에서 SSC2에서 QTL을 보고 하였는데, 본 논문의 결과와 overlapping 되지 않았으며, 이는 기존의 보고된 MS 마커를 이용한 linkage analysis의 경우 genomewide를 cover하는 마커들 간의 간격이 넓기 때문에 형질에 영향을 미치는 유전자를 직접적으로 규명하 는 것이 어려울 것으로 생각된다. 따라서 SSC2에서 나타난 실험결과와 기존에 보고된 QTL이 차이가 난 것으로 사료된다.

이전 연구에서, Kang et al.(2013)은 Landrace 와 한국재래돼지 교잡축군 1,233두를 이용하여 도 체중과 관련된 genome 상 위치를 보고한 바 있 다. 이들은 SSC12의 49Mb에 위치한 2개의 유전자 (LOC100621652, LOC100523510)를 후보유전자로 선정하였고, 이들이 통계적으로 도체중과 관련성이 있다고 보고하였다. 본 논문의 결과는 SSC2, 4에서 2개의 유의적인 SNP 마커가 확인되었지만 이들과 유사한 chromosome의 SNP 마커는 확인 되지 않았 다. 이러한 차이점을 보이는 이유는 연구 집단(표본 수, 번식, 환경)의 차이도 있겠지만, 순종 수컷 한국 재래돼지와 순종 암컷 Landrace 교잡축군을 연구한 Kim et al.(2007)이 보고에 따르면 무게와 관련하 여 도체중, 앞다리, 갈비의 무게는 모계로부터 유전 적 영향을 더 받는다고 보고 한바 있다. 따라서 Duroc의 모계로부터의 유전적 영향을 많이 받았을 것으로 사료된다.

본 연구에서 Duroc과 한국재래돼지 교잡축군 F₂ 의 도체중 형질에 대한 GWAS 분석을 수행한 결과, chromosome-wide 수준에서 관련성을 보이는 SSC2, 4의 2개의 유전자(LOC100519538, LOC100737583) 는 다른 독립적인 축군에서의 반복 실험 및 추가적 인 기능 연구를 통하여 도체중의 위치상 후보 유전 자로서 돼지 체중을 선발할 수 있는 기초연구 자료 가 될 수 있을 것이다.