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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.51 No.1 pp.115-128
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2017.51.1.115

Effects of Medicinal Plant Bark Extract on Rumen Fermentation, Microbial Growth and Methane Emission

Su Kyoung Lee1, Shin Ja Lee1, Sung Sill Lee1,2*
1Institute of Agriculture & Life Science(University-Centered Labs), Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea
2Division of Applied Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea

† These authors contributed equally to this work.

Corresponding author: Sung Sill Lee +82-55-772-1883, +82-55-772-1889, lss@gnu.ac.kr
March 21, 2016 October 17, 2016 December 18, 2016

Abstract

This study was conducted to evaluate the effects of bark extracts of medicinal herb on rumen fermentation, microbial growth and methane emission. The extracts of bark extracts of medicinal herb, as rose of sharon, castor aralia, chinese hackberry, hardy rubber tree and the silver magnolia were used in this study. The 20 mL of mixture, comparing McDougall’s buffer and rumen fluid in the ratio 2 to 1, was dispensed anaerobically 50mL serum bottles containing 0.3g of timothy substrate and extracts of bark extracts of medicinal herb. The serum bottles were incubated 39°C for 3, 6, 9, 12, 24, 48 and 72 hours. Supplementation of the bark extracts of medicinal herb extracts did not affect the fermentation characteristics(pH, dry matter digestibility, ammonia concentration, rumen microbial growth), but not effect of reducing the methane. Acetate concentration was lower(p<0.05) for hardy rubber tree compared with control. Carbon dioxide production as a substrate for methane production in the rumen was lower (p<0.05) for hardy rubber tree compared with control whereas methane reduction effect did not exist. Methanogenic archaea diversity decreased in the rose of Sharon extract treatment compared with control whereas methane production was no differences between treatments. Therefore, further detail study may need to investigate of dose level dependence of the extracts, considering the flavonoid concentration of the extracts on the reduction of methane production and methanogenic archaea.


약용식물 수피 추출물이 반추위 발효와 미생물 성장 및 메탄 발생에 미치는 영향

이 수경1, 이 신자1, 이 성실1,2*
1경상대학교 부속 농업생명과학연구원(중점연구소),
2경상대학교 응용생명과학부

초록

본 연구는 약용실물 수피 추출물을 이용하여 in vitro 반추위 발효성상 및 반추위 메탄 발생에 미치 는 영향을 알아보기 위해 수행되었다. 공시재료는 무궁화, 음나무, 팽나무, 두충 및 후박나무 추출물을 사용하였다. McDougall’s buffer와 반추위액을 2:1 비율로 혼합한 발효액을 티모시 0.3g과 식물 추출 물이 담긴 50mL serum bottle에 혐기상태로 20mL 분주한 뒤, 39°C에서 3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72시 간 동안 발효하였다. 약용식물 수피 추출물을 첨가하였을 때 반추위 발효 성상(pH, 건물소화율, 암모니 아태 질소, 미생물 성장량)에는 영향을 미치지 않았다. 배양 6시간대에 두충 추출물 첨가구에서 acetate의 농도가 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮고, 메탄의 기질인 이산화탄소의 발생량이 대조 구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮아 메탄 저감 효과를 기대하였으나 메탄 저감효과는 없었다. 메탄생성 박테리아인 Methanogen archaea의 경우 무궁화 추출물 첨가구를 제외한 전 추출물 첨가구에서 대조구 에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으나 메탄발생량에는 유의적(p<0.05)인 차이가 없었다. 추후 첨가 농 도를 달리하거나 flavonoid 함량을 측정하는 실험이 필요한 것으로 사료되며, 메탄생성박테리아를 감소 시키는 연구도 추가적으로 필요할 것으로 생각된다.


    Rural Development Administration
    PJ011060012015

    서론

    메탄은 지구 온난화에 영향을 주는 온실가스 중 하나로, 온난화지수가 이산화탄소에 비해 21배가량 높은 것으로 알려져 있다(Tyler, 1991). 특히 동물 장내발효에 의해 생성되는 메탄은 총 메탄 발생량의 16%를 차지하며(Johnson & Johnson, 1995), 이렇 게 생성된 메탄은 사료 에너지 손실(Johnson et al., 1991)로 이어져 동물의 생산성을 감소시키기 때 문에 반추위 내 메탄 발생량의 억제가 필요하다. 반 추위내 메탄을 저감시키기 위해 수행되었던 이전의 연구에서는 monensin 같은 항생제(Van Nevel et al., 1992), chloroform과 같은 할로겐 화합물(Goel et al., 2009) 등 화학물질을 사용하였다. 이들의 연 구는 메탄을 저감시키는데 성공하였으나, 화학적 합 성물에 의한 동물 체내 독성(Lee et al., 2013)과 축 산물 잔류(Mitsubashi et al., 1961) 그리고 항생제 내성(Park et al., 2000) 등의 문제점이 발견되었고, 이로 인해 자연유래 성분으로 이루어진 천연 물질 첨가제 개발에 대한 관심이 증대되고 있는 실정이 다.(Wallace, 2002; Wenk, 2003). 일부 연구자들은 식물에서 유래한 천연 식물 추출물(Broudiscou et al., 2000; Bodas et al., 2008) 들을 이용하여 메 탄생성에 미치는 영향을 검토하였고, 일부 물질은 메탄저감에 효과가 있다는 것을 입증하였다. 약용식 물은 이들이 가지고 있는 항균작용에 따라 지금까지 다양한 목적으로 사용되고 있으며, 그 중 대부분은 사람이 이용 가능한 안전한 물질(GRAS; Generally Recognized as Safe Substance)로 분류되어있다 (FDA, 2004). Kim et al.(2011)은 약용식물을 반추 동물에게 급여하였을 때 증체량 및 두당 사료 섭취 율이 증가되며 면역력이 향상되어 송아지의 설사 발 병률을 감소시킨다고 보고하였고, Tamara et al. (2009)은 착유우의 유생산량이 증가되며 소화율을 향 상시킨다고 보고하였다. 또한 Rowe et al.(1983)의 연구에 따르면 약용식물은 휘발성지방산의 조성을 변 경시키며 메탄생성박테리아와 공생관계인 protozoa 를 사멸시킨다고 보고하였다.

    본 연구에 사용한 무궁화는 뿌리나 수피 뿐만 아 니라 꽃, 열매, 잎 등 모든 부위가 한약재로 사용되 며, 무궁화 수피에는 flavonoid가 24.84±0.08mg 포함되어 있다(Jang et al., 2015). 음나무의 수피 를 해동피라 부르며, 여러 종류의 saponin과 lignin 그리고 페놀성 항산화 물질이 포함되어 있다. 특히, 음나무에서 추출되는 saponin은 트리페노이드계 saponin으로 kalosaponin이라 일컬으며 건물당 30.59mg의 kalosaponin이 포함되어 있다(Lee et al., 2000). 팽나무는 잔가지를 약재로 사용하며 팽 나무의 수피를 박유피 또는 박수피라 하는데, 팽나무 의 수피에는 Skatol, indole, saponin 및 alkaloid 성분이 포함되어 있다(Jang, 2009; Lee, 2012). 두 충은 두충과에 속하는 낙엽 교목으로 tannin 및 flavonoid(quercetin, kaempherol, astragalin)등 이 포함되어 있으며, 두충을 반추동물에게 급여하 였을 때 생산성이 증대되고 육질이 개선된다(Kim et al., 2005). 후박나무의 수피를 후박피라 부르 며, 후박피에는 flavonoid, lignin, alkaloid 및 terpenoid 등 최소 255가지 성분이 포함되어 있다 (Kazuo et al., 1982; Tachikawa et al., 2000). 그 중 magnolol, honokiol, obovatol 등의 noelignan 이 약리학적 효능에 대해 초점이 맞춰져 있다(Lee et al., 2011). 이처럼 약용식물의 특유의 쓴맛과 떫 은 맛은 saponin과 tannin 등 polyphenol 물질이 포함되어 있기 때문이며, 이들은 미생물의 세포벽을 녹이거나 칼슘 채널을 차단함으로써 미생물을 사멸 시키거나 미생물 성장을 억제시킨다(Cheeke, 1988; Wanapat et al., 2013).

    따라서 본 연구는 식물 추출물이 반추위 발효 성 상과 메탄 발생에 미치는 영향을 조사하고, 메탄저 감 사료 첨가제로서 이용가능한지 알아보기 위해 본 연구를 수행하였다.

    재료 및 방법

    1.공시축 및 사양관리

    국립 경상대학교 야생동물보호센터에서 사육중인 반추위 cannula가 장착된 암소 한우(체중 450kg± 30kg)로부터 in vitro 반추위 발효 시험을 위한 시 험용 위액을 채취하였다. 공시동물의 사료는 농후사 료와 조사료(티모시)를 40:60으로 하여 체중의 2% 를 1일 2회(09시 및 17시) 분할 급여하였고, 물과 미네랄 블록은 자유섭취토록 하였다.

    2.식물추출물 및 in vitro 시험설계

    본 연구에 사용한 식물 추출물은 무궁화(Hibiscus syriacus), 음나무(Kalopanax pictus), 팽나무(Celtis sinensis), 두충(Eucommia ulmoides), 후박나무 (Machilus thunbergii)로 한국식물추출물은행(충청 북도 청주시 소재)에서 methyl alcohol 99.9%로 추 출하여 동결건조 된 상태로 20mg씩 분양 받았다. 기질인 티모시는 65°C dry oven에서 24시간 건조시 킨 다음 2mm screen으로 분쇄 한 후 3cmx3.5cm 크기로 자체 제작한 Nylon bag(Ankom forage bag: R1020)에 넣어 heat sealing하였다. AOAC법(2012)으로 분석한 티모시의 화학적 조성은 수분 8.87(%), 조단백질 13.37(% DM), 조지방 2.25(% DM), 조섬유 21.87(% DM), 조회분 8.62(% DM), NDF 53.18(% DM), ADF 30.57(% DM) 및 Hemicellulose 22.61(% DM)이다. 혐기상태를 유지하기 위해 in vitro 시험 내내 질소 가스를 계속 주입하였다. 50mL serum bottle에 질소로 bubbling한 McDougall’s buffer (NaHCO3 9.80g/L, Na2HPO4·2H2O 4.62g/L, KCl 0.57g/L, NaCl 0.47g/L, MgSO4·7H2O 0.12g/L, 4% CaCl2 solution 1.00g/L)와 반추위액을 2:1 비율로 섞은 용액 20mL, 티모시 0.3g을 각각 넣고 대조구를 제외한 첨가구에 Dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) 1mL로 희석한 약용식물 수피 추출물(20mg/mL)을 기질의 5%(v/w) 씩 첨가한 후 butyl rubber stopper와 aluminum cap으로 밀봉하였다. 각 처리구별 배양은 39°C의 Shaking incubator (Jeio Tech, SI-900R, Daejeon, Korea; 120rpm)에서 시간대별(3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72 시간)로 3반복으로 수행하였다.

    3.조사 항목 및 조사 방법

    3.1.pH

    가스 발생량 측정 및 가스 포집 후 Weaton decapper (Weaton Co., USA)를 이용하여 serum bottle의 aluminum cap 및 butyl rubber를 제거 한 후, 발 효액의 pH를 pH meter(Mettler Toledo, MP230, Columbus, Ohio, USA)를 이용하여 측정하였다.

    3.2.건물 소화율

    발효 상등액 채취 후 nylon bag을 수거하여 물을 채운 수조에 넣고 Heidolphs rotamax 120(Heidolph Instrument, Germany)를 이용하여 100rpm으로 30 분씩 2회 씻은 후 65°C의 Dry oven(Jeio tech, Daejeon, Korea)에서 약 24시간 건조시켜 건물 잔 량을 측정하였다. 건물 소화율은 투입한 기질량과의 차이를 구하고 이 차이를 투입한 기질량의 백분율로 환산하여 구하였다.

    3.3.미생물 성장량

    pH 측정 후, 발효액을 1.5mL E-tube에 채취하 여 사료입자를 제거하기 위해 3,000rpm에서 3분간 원심분리 하였다. 상등액을 취하여 14,000rpm에서 3분간 재 원심분리하여 미생물 pellet을 침전시킨 후, 상등액은 제거하고 pellet에 sodium phosphate buffer(pH 6.5)를 1mL 첨가하여 vortex로 교반시 키는 세척 과정을 3회 반복 후 Spectrophotometer (BIO-RAD, Model 680, California, USA)를 이용 하여 550nm에서 O.D.(Optical density) 값을 구하 여 미생물 성장량을 측정하였다.

    3.4.암모니아

    Chaney & Marbach(1962)의 방법에 따라 phenol color reagent와 alkali-hypochlorite reagent로 발효액의 암모니아를 발색한 후 Spectrophotometer (BIO-RAD Model 680, California, USA)를 이용하 여 630nm에서 O.D(Optical density) 값을 구하여 측정하였다.

    3.5.휘발성지방산(VFA)

    발효액을 1.5mL E-tube에 채취하여 3,000rpm에 서 3분간 원심 분리하여 사료입자를 제거하고, 상등 액을 0.20μm Syringe filter로 여과 후 HPLC(High Performance Liquid Chromatography, Agilent- 1200, Germany)를 이용하여 분석하였다. 시료의 주 입량은 20μℓ였고, 이동상 용액은 0.0085N H2SO4을 사용하였으며, 유속은 0.6mL/min이었다. Column은 300mm×7.8mm I.d. MetaCarb 87H(Varian, Palo Alto, San Francisco, USA)를 사용하였으며, Column 온도는 35°C에서 사용하였다.

    3.6.총 가스, 이산화탄소 및 메탄 발생량

    Serum bottle을 shaking incubator에서 꺼낸 후, Theodorou et al.(1994)의 방법으로 serum bottle 의 head space에 있는 가스 발생량을 Detachable pressure transducer 및 Digital read-out voltmeter (Laurel Electronics, Inc., CA, USA)를 사용하여 측정하였고, 9mL 진공시험관(Vaccutainer)에 가스 를 포집하여 GC(HP 5890 Gas Chromatography, Wilmington, Delaware, USA)를 사용하여 가스 내 메탄 함량 및 이산화탄소 함량을 측정하였다.

    3.7.Real-Time PCR

    배양액 1mL을 E-tube에 채취하고, 3,000rpm, 3 분간 원심 분리하여 사료 입자를 제거한 후, Soil Kit(Macherey-Nagel, Düren, Germany)를 이용하 여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA의 농도를 측 정하기 위하여 Nano-drop(Thermo Scientific, Wilmington, Delaware USA)을 사용하였다. 사용 한 primer는 Table 1와 같으며, 시험에 사용하기 전 10pmol로 희석하였다. 0.2mL PCR tube(PCR- 0208-FCP-C, Corning Axygen, New York, USA) 에 10mg/μℓ로 보정한 DNA와 증류수를 섞어 9μℓ 분주하고, primer 1μℓ와 SYBR Green(Code: QPK- 201, Toyobo Co., LTD., Japan) 10μℓ를 섞은 pre-mixture 를 11μℓ 분주하여 총 20μℓ가 되게 하였 다. Real-Time PCR(CFX96TM Real-Time system, BIO RAD)을 이용하여 Ct 값을 구하였고, total bacteria를 reference gene으로, 섬유소 박테테리아 (Ruminococcus albus, Ruminocuccus flavfaciens, Fibrobacter succinogenes)와 Methanogenic archaeaCiliate associated methanogen을 target gene 으로 하였고, 2-ΔCt(Target) - ΔCt(Control) 계산법으로 미 생물 군집변화를 비교하였다.

    4.통계처리

    통계처리는 SAS package program의 general linear model(GLM) procedure에 따라 처리하였으 며, 각 처리구간의 유의성 검증을 위해 분산분석을 실시 후, Duncan’s multiple range test로 5% 수 준에서 유의성을 검정하였다.

    결과 및 고찰

    1.발효성상 및 미생물 성장량

    약용식물 수피 추출물을 처리한 in vitro 실험에 서 발효시간대에 따른 발효성상 및 미생물 성장량 은 Table 2과 같다. pH는 발효가 진행됨에 따라 점점 떨어지고 있으며, 발효 3시간대에 음나무 추 출물 첨가구와 후박나무 추출물 첨가구에서 대조구 에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았다. 또한 발효 48 시간대에서는 후박나무 추출물 첨가구에서, 발효 72시간대에서는 두충 추출물 첨가구와 후박나무 추 출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으 로 높았다. 반추위내 pH는 발효가 진행될수록 미생 물 발효에 의해 생성되는 휘발성지방산과 당이 축 적됨에 따라 점점 감소하며, 발효산물들로 인해 상 당히 산성화 될 수 있지만 자체의 중화력이 높고 휘발성지방산이 제1위벽을 통해 상당량 흡수되기 때 문에 pH는 6~7로 유지된다(Maeng, 1998). 본 연구 에서 pH는 7.54~6.13 사이로, 정상범위에 포함되었 으며, 발효가 진행됨에 따라 처리구와 대조구간 큰 유의차가 없는 것으로 보아 약용식물 수피 추출물은 반추위 pH에 영향을 미치지 않는 것으로 생각된다.

    건물소화율은 시간이 지날수록 증가하고 있으며 발효 3시간대 무궁화 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았고, 그 외 다른 발효 시간대에서는 대조구와 첨가구는 유의적(p<0.05)인 차이가 없었다. 섬유소 분해 박테리아는 pH 6.8 부 근에서 활력이 가장 높으나(Terry et al., 1969), 본 연구에서 pH 6.8 부근은 발효 12시간대에서는 건물 소화율이 대조구와 추출물 첨가구간 유의적인 차이 가 없었다. pH 6 이하일때는 섬유소 분해가 저해를 받는다고 하였는데(Stewart, 1977), 본 연구에서는 pH가 정상범위에 포함되어 있고, 약용식물 추출물의 항균능력이 반추위 내 섬유소 박테리아에 별 다른 영향을 미치지 않았기 때문에 건물 소화율 또한 반 추위 발효에 영향을 미치지 않는 것으로 생각된다.

    미생물 성장량은 발효 3시간대 팽나무 추출물 첨가 구와 후박나무 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유 의적(p<0.05)으로 낮았고, 그 외 다른 발효시간대에 서는 추출물 첨가구와 대조구간 유의적(p<0.05)인 차 이는 없었다. 약용식물 추출물에 포함된 flavonoid 는 미생물의 세포막이나 세포벽 합성을 저해함으로 써 항균 활력을 나타내며(Cushnie & Lamb, 2005), 메탄생성박테리아에게 독성물질로 작용한다(Patra & Saxena, 2010)고 하였으나 본 연구의 미생물 성 장량에는 영향을 주지 않았다.

    암모니아태 질소 농도는 발효 9시간대에 무궁화 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으 로 낮았으며, 그 외 다른 발효 시간대에서는 대조구 와 추출물 첨가구간 유의적인(p<0.05) 차이가 없었 다. 본 연구에서 발효 48시간대에 암모니아 질소태 농도가 급격히 증가하는데, 이는 미생물 성장량에서 볼 수 있듯 미생물 사멸에 의한 영향이라 판단되며 미생물 분해도가 높아지면 반추위 내 암모니아 농도 또한 증가한다(Armentano et al., 1993). 약용식물에 많이 함유하고 있으며 특유의 쓴맛을 내는 saponin 은 protozoa 세포막의 sterol과 결합하여 세포 용해를 일으켜 protozoa 수를 감소시킨다. protozoa 총 반추 위 질소의 10~40%를 생성하며(van Soest, 1994), protozoa의 감소는 암모니아 농도의 감소를 의미한 다(Makkar & Becker, 1996; Pen et al., 2006). 그 러나 본 연구에서는 암모니아 질소태 농도가 대조구 와 추출물 첨가구간 유의적인 차이가 없는 것으로 보 아 protozoa의 감소는 기대하기 힘든 것으로 판단되 며, 약용식물 수피 추출물은 미생물의 암모니아태 질 소 이용 효율과 반추위내 단백질 분해효율에 영향을 미치지 않는 것으로 생각된다.

    2.휘발성지방산(VFA)

    약용식물 수피 추출물을 처리한 in vitro 실험에서 발효 시간대에 따른 acetate, propionate 및 A/P ratio는 Table 3와 같다. Acetate 농도는 발효 3시 간대 음나무 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의 적(p<0.05)으로 높았고, 발효 6시간대 팽나무 추출 물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으나 두충 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유 의적(p<0.05)으로 낮았다. 발효 9시간대 무궁화 추 출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으나 두충 추출물 첨가구에서는 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 발효 72시간대 두충 추 출물 첨가구와 후박나무 추출물 첨가구에서 대조구 에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았고, 그 외 발효시 간대에서는 대조구와 첨가구간 유의적(p<0.05)인 차 이는 없었다. Propionate 농도는 발효 3시간대 음나 무 추출물 첨가구와 두충 추출물 첨가구에서 대조구 에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으며, 발효 72시간 대 무궁화 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 높았으나 두충 추출물 첨가구에서 대 조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 그 외 시 간대에서는 대조구와 첨가구간 유의적(p<0.05)인 차 이는 없었다. A/P ratio는 발효 3시간대 두충 추출 물 첨가구가 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮 았고, 발효 9시간대 음나무 추출물 첨가구에서 대조 구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았다. 발효 12시간 대 전 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 높았던 반면 발효 72시간대 전 추출물 구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 그 외 시간대에서는 대조구와 첨가구간 유의적 (p<0.05)인 차이는 없었다. 반추동물이 섭취한 사료 에너지의 약 70~80%는 휘발성지방산으로 전변되며, 이는 반추위 미생물에게는 필요 없는 최종 발효 산 물이나 숙주동물에겐 주요 에너지원으로 사용된다. Jouany & Morgavi(2007)에 의하면 acetate가 생성 될 땐 반추위 내 수소 이온 농도가 증가하고, 반대 로 propionate 생성될 땐 반추위 내 수소 이온 농도 를 감소시킨다. 그래서 acetate의 생성이 감소하거 나 propionate의 생성이 증가하면 메탄으로 전변될 수소 이온의 농도가 감소되기 때문에 간접적으로 메 탄이 줄어드는 결과를 얻을 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서 발효 6시간과 9시간대 그리고 72시간대 에 두충 추출물 첨가구에서 acetate 농도가 대조구 에 비해 유의적으로 낮아 메탄이 저감 될 것이라 기대하였으나 메탄 저감 효과(Table 4)는 없었다. 또한 발효 3시간대 음나무 추출물 첨가구와 두충나 무 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 propionate 농 도가 높아 메탄 저감 효과를 기대하였으나 메탄 저감 효과(Table 4)는 없었다. 뿐만 아니라 발효 72시간대 전 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 A/P ratio가 낮 아 메탄 저감 효과를 기대하였으나, 이 또한 메탄 저 감 효과(Table 4)는 없었다. 따라서 약용식물 수피 추출물이 메탄 저감에 효과는 없었으나 대조구와 추 출물 첨가구간 유의차가 크지 않은 것으로 보아 발효 성상에는 이상이 없는 것으로 판단된다.

    3.총 가스, 메탄 및 이산화탄소 발생량

    약용식물 수피 추출물을 처리한 in vitro 실험에 서 발효시간대에 따른 총 가스, 메탄 및 이산화탄소 발생량은 Table 4와 같다. 발효 시간이 지남에 따라 총 가스 생성량의 양은 점점 증가하고 있으며, 발효 6시간대와 9시간대 무궁화 추출물 첨가구와 팽나무 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으 로 높았다. 발효 12시간대에서는 대조구와 추출물 첨가구간 유의적(p<0.05) 차이가 없었고, 발효 24시 간대에는 음나무 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으며, 발효 48시간대와 72 시간대에는 전 추출물 첨가구가 대조구에 비해 유의 적(p<0.05)으로 높았다. 메탄 발생량은 발효 3시간 대 팽나무 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 높았으나 그 외 다른 시간대에서는 대 조구와 추출물 첨가구간 유의적(p<0.05)인 차이는 없었다. 이산화탄소 발생량은 발효 9시간대 음나무 추출물 첨가구와 두충 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았으나 그 외 다른 시간 대에서는 대조구와 추출물 첨가구간 유의적(p<0.05) 인 차이는 없었다. 약용식물에 포함되어 있다고 알 려진 활성 물질들은 메탄생성균의 세포벽에 칼슘 채 널을 차단하거나(Cheeke, 1988) 세포벽을 녹임으로 써 항균 효과를 나타낸다(Wanapat et al., 2013). 본 연구에 사용된 약용식물에는 polyphenol 중 하나 인 flavonoid가 공통적으로 포함되어 있는데(Kazuo et al., 1982; Tachikawa et al., 2000; Park et al., 2006; Ko et al., 2007; Hwang et al., 2011; Jang et al., 2015), 이 물질은 그 자체로도 항산화 및 항균 능력이 있다. 본 연구에 공통적으로 포함된 flavonoid는 protozoa 및 메탄생성박테리아를 제거 (Broudiscou et al., 2000; Oskoueian et al., 2013)하며 propionate와 마찬가지로 수소를 흡수하 는 hydrogen sink로서 기능도 한다고 알려져 있어 (Becker et al., 2014) 직·간접적으로 메탄을 감소 시킬 수 있다. 그러나 본 연구에서는 메탄 저감 효 과를 기대할 수 없었는데, 총 가스 발생량은 늘었으 나 메탄의 기질인 이산화탄소 발생량이 대조구와 추 출물 첨가구간 유의적(p<0.05)인 차이가 없었고, 약 용식물에 포함된 활성 물질들이 항균 효과 및 hydrogen sink로서 기능을 하지 못했기 때문이라 사료된다.

    4.Real-time PCR

    약용식물 수피 추출물을 처리한 in vitro 실험에서 발효시간대에 따른 Real-time PCR 결과는 Fig 1, 2 와 같다. 발효 12시간대 섬유소 박테리아인 R. albus 전 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 낮게 발현되었고, F. succinogenes는 대조구와 추출물 첨가구간 유의적(p<0.05)인 차이가 없었으며, R. flavefaciens는 팽나무 추출물 첨가구 에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮게 발현 되었다. M. archaea는 음나무 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높게 발현되었으 며 Ciliate associated methanogen(이하 CAM)은 대조구와 추출물 첨가구간에는 유의적(p<0.05)인 차이가 없었다. 발효 12시간대 real time PCR 결 과에서 섬유소 박테리아의 발현율이 대조구에 비해 추출물 첨가구에서 유의적(p<0.05)으로 낮게 발현 되었지만, 건물 소화율(Table 2)에는 대조구와 추출 물 첨가구간 유의적(p<0.05)인 차이는 없었다. 이 는 반추위 내에는 R. albus, F. succinogenes, R. flavefaciens 뿐만 아니라 Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium longisporum, Clostridium locbeadii 등과 같은 수많은 섬유소 박테리아가 존재(Ha et al., 2013)하며 이들의 상호작용 때문이라 사료된다. 발효 24시간대 R. albus는 대조구와 추출물 첨가구간 유 의적(p<0.05)인 차이가 없었고, F. succinogens은 두충 추출물 첨가구, 후박나무 추출물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으며, R. flavefaciens는 후박나무 추출물 첨가구에서 대조 구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮게 발현되었다. M. archea 는 팽나무 추출물 첨가구와 두충 추출 물 첨가구에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으며, CAM은 대조구와 추출물 첨가구간 유의적 (p<0.05)인 차이는 없었다. Fig. 2에서 M. archaea가 높게 발현됐음에도 불구하고 메탄 발생량(Table 4)은 유의적(p<0.05)인 차이가 없었는데, 이는 반추위 내 미생물 중 메탄을 생성하는 박테리아가 M. archea를 제외하고도 Methanobrevibacter ruminantium, Methanobacterium formicicum, Methanomicrobium mobile 등이 존재하고(Ha et al., 2013) 이들의 상 호작용 때문에 이러한 결과가 나타나지 않았나 생 각된다. 결과적으로 본 연구에 사용한 5종의 약용 식물 수피 추출물은 반추위 발효에는 영향을 미치 지 않았다. 또한 메탄생성박테리아인 Methanogen archaea의 발현율은 대조구에 비해 첨가구에서 유 의적(p<0.05)으로 높았으나 메탄발생량에는 유의적 (p<0.05)인 차이가 없었다. 추후 첨가 농도를 달리 하거나 flavonoid 함량을 측정하는 실험이 필요한 것으로 사료되며, 메탄생성박테리아 발현율의 연구 도 추가적으로 필요할 것으로 생각된다.

    감사의 글

    본 논문은 농촌진흥청(과제번호: PJ0110600120 15)‘반추위 미생물 생태계를 응용한 항생제 대체 용 고기능성 올리고당 생산의 원천기술개발 및 산 업화’에서 지원을 받아 수행된 연구입니다.

    Figure

    JALS-51-1-115_F1.gif

    Relative quantification analysis of rumen microorganism population in vitro ruminal fermentation by the addition of different plant extracts after 12 h incubation.

    JALS-51-1-115_F2.gif

    Relative quantification analysis of rumen microorganism population in vitro ruminal fermentation by the addition of different plant extracts after 24 h incubation.

    Table

    PCR primers for Real-Time PCR assay

    aForward primer
    bReverse primer.

    Effect of medicinal plant extracts (Bark) on ruminal fermentation characteristics in vitro incubation

    abMeans with different superscripts in the same column differ significantly (p<0.05).

    Effects of medicinal plant extracts (Bark) on the concentration of total and individual VFAs in vitro incubation

    abcMeans with different superscripts in the same column differ significantly (p<0.05).

    Effect of medicinal plant extracts(Bark) on cumulative gas productions in vitro incubation

    abcMeans with different superscripts in the same column differ significantly (p<0.05).

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