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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.50 No.2 pp.161-173
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2016.50.2.161

Isolation and Identification of α-Glucosidase Inhibitory Compounds from Artemisia annua L. Leaves and Stems

Keon Hee Ko1,4*, Jun Young Kim2, Yun-Geun Kim1, Kyeong Yeol Oh1, Young-Min Goo1, Yong Hwi Son1, Bo Ram Park1, Gyeong Sun Kim1, Jung Haw Lim3, Sanghae Nam4
1Gyeongnam Oriental Medicinal Herb Institute, 52215, Korea
2Busan Regional Korea Food and Drug Administration, Ministry of Food and Drug Safety, 47366, Korea
3Department of Animal Bioscience College of Agriculture & Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea
4Division of Food Science, Gyeongnam National University of Science and Technology, 52725, korea
Corresponding author: Keon Hee Ko Tel: +82-55-970-1124Fax: +82-55-974-1067kosajang83@naver.com
October 21, 2015 February 2, 2016 March 10, 2016

Abstract

The purpose of this study is to identify and develop a natural resource with good α-glucosidase inhibitory activity. To this end, natural substances were separated and developed from Artemisia annua L., and its α-glucosidase inhibitory activity was measured. From Artemisia annua L. leaves and stems of the chloroform layer and the ethyl acetate layer, 6 and 5 compounds were separated, respectively. From the chloroform layer, the separated compounds were identified as follows: ArteCA(M.W. 316g/mol, C16H12O7) as isorhamnetin, ArteCB(M.W. 360 g/mol, C18H16O8) as chrysosplenol D, ArteCC(M.W. 316g/mol, C16H12O7) as rhamnetin, ArteCD(M.W. 374 g/mol, C18H16O8) as chrysosplenetin, ArteCE(M.W. 284g/mol, C21H20O12) as acacetin, and ArteCF(M.W. 270g/mol, C16H14O4) as imperatorin. From the ethyl acetate layer, the separated compounds were identified as follows: ArteEAA(M.W. 178g/mol, C9H6O4) as 6,7-dihydroxycoumarin, ArteEAB(M.W. 192g/mol, C10H8O4) as scopoletin, ArteEAC(M.W. 448g/mol, C21H20O11) as kaempferol-3-b-D-glucoside, ArteEAD(M.W. 464 g/mol, C21H20O12) as quercetin-3-b-D-glucoside, ArteEAE(M.W. 318g/mol, C15H10O8) as myricetin. Among these compounds, the ArteEAE(myricetin) shows a high level of α-glucosidase inhibitory activity (98.1%). Thus, this could be applied in research and development for blood sugar control supplements or medications. Furthermore, additional research is needed to demonstrate the effects and functions of 11 compounds separated from the leaves and stems of Artemisia annua L.


개똥쑥(Artemisia annua L.) 잎, 줄기로부터 α-Glucosidase 활성 저해물질의 분리 및 구조 동정

고 건희1,4*, 김 준영2, 김 윤근1, 오 경열1, 구 영민1, 손 용휘1, 박 보람1, 김 경선1, 임 정화3, 남 상해4
1경남한방약초연구소
2식품의약품안전처 부산지방식품의약품안전청
3경상대학교 동물생명과학과
4경남과학기술대학교 식품과학부

초록

본 연구에서는 α-glucosidase 저해활성이 우수한 천연 자원을 개발하기 위하여 개똥쑥으로부터 천연 물질을 분리·동정하고 분리된 물질에 대하여 α-glucosidase 저해활성을 측정하였다. 개똥쑥 잎과 줄 기의 chloroform층과 ethyl acetate층으로부터 각각 6개와 5개의 화합물을 분리하였다. 분리한 화합물 중 chloroform층으로부터 분리된 ArteCA(M.W. 316g/mol, C16H12O7)는 isorhamnetin, ArteCB(M.W. 360g/mol, C18H16O8)는 chrysosplenol D, ArteCC(M.W. 316 g/mol, C16H12O7)는 rhamnetin, ArteCD (M.W. 374g/mol, C18H16O8)는 chrysosplenetin, ArteCE(M.W. 284g/mol, C21H20O12)는 acacetin 그리 고 ArteCF(M.W. 270g/mol, C16H14O4)는 imperatorin으로 확인되었다. 한편 EtOAc층으로부터 분리된 ArteEAA(M.W. 178g/mol, C9H6O4)는 6,7-dihydroxy coumarin, ArteEAB (M.W. 192g/mol, C10H8O4) 는 scopoletin, ArteEAC (M.W. 448g/mol, C21H20O11)는 kaempferol-3-O-b-D-glucoside, ArteEAD (M.W. 464 g/mol, C21H20O12)는 quercetin-3-O-b-D-glucoside 및 ArteEAE(M.W. 318g/mol, C15H10O8)는 myricetin으로 확인되었다. 이 중에서 ArteEAE(myricetin)는 α-glucosidase에 대하여 97.3%의 높은 저해활성을 가지고 있었으므로, 혈당조절용 건강식품 또는 치료제 개발을 위한 물질로 활용될 수 있을 것으로 판단되었다.


    Small and Medium Business Administration
    S2148343

    서론

    쑥속(Artemisia spp.) 국화과 식물은 북방계 식물 로서 북아시아를 중심으로, 북반구의 극지방, 남반 구의 열대 및 아열대, 사막까지 광범위하고 다양한 환경적 조건에서 분포하고 있다(Lodari et al., 1989). 현재 국내에서 인진쑥, 약쑥, 참쑥, 산쑥, 개 똥쑥 등을 소재로 다양한 연구가 이루어지고 있으 며, 생리활성 또한 다양하게 보고되어 있다(Jin et al., 2008). 개똥쑥(Artemisia annua L.)은 우리나 라에서 전국 각지의 길가나 들판에 자생하고 있으며, 최근에는 재배도 많이 이루어지고 있다. 한방에서는 개똥쑥의 지상부를 청호(菁蒿)라는 이름으로 해열제, 지혈제, 피부병치료제 및 살충제 등으로 사용하고 있 으며, 그 외 항균, 항바이러스 및 항산화작용 등이 알려져 있다(Romero et al., 2006). 개똥쑥의 주요 성분으로는 arteannuin, arteannuin B, scopoletin, coumarin 및 eupatin 등이 알려져 있고, 이러한 성 분들이 항암 및 항균작용과 관계가 깊어 이들의 화 학적 구조를 밝혀내는 연구가 수행되었고(Schmid & Hofheinz, 1983; Avery et al., 1992), 최근 보고 에 따르면 chlorogenic acid, ρ-coumaric acid, coumarin, 6,7-dimethoxy-coumarin, luteolin- 7-glucoside, rutin, quercetin, luteolin 및 kaempferol 등의 페놀화합물이 분리․구조동정되었다(Cai et al., 2004). 중국에서는 예로부터 말라리아 치료를 위한 약초로 사용되어 왔는데, sesquiterpene의 주성분인 artemisinin이 강력한 항말라리아 효능을 지니므로 현재 의약품으로도 이용되고 있다(Klayman, 1985).

    최근 서구화된 식생활 및 생활습관의 변화에 따라 당뇨, 암, 뇌혈관 질환, 심혈관 질환 등 각종 성인 병의 발병이 증가되고 특히 당뇨병은 전 세계적으로 급증하는 추세이다. 노령화 사회, 비만, 운동부족, 불규칙한 식습관 등으로 발병률 또한 증가하고 있다 (Lim et al., 2001). 당뇨병은 체내에서 인슐린이 생성되지 않아 포도당이 축적되어 고혈당 상태가 지 속되어 발병되며 망막증, 고혈압 등의 합병증을 일 으킨다. α-Glucosidase는 탄수화물의 소화에서 마 지막 단계를 촉진시켜 포도당으로 전환시키는 효소 로서(Baynes, 1991; Bertozzi & Kiessling, 2001), α-glucosidase 저해제는 소장에서 이당류 분해효소 활성에 대해 경쟁적으로 작용하여 이당류에서 단당 류 분해되는 과정을 억제한다. 이러한 저해제의 활 성은 장내에서 당질의 소화 및 흡수를 지연시키고 식후 급격한 혈당 상승을 조절하고, 이에 따라 인슐 린이 과도하게 분비되는 것을 억제한다(Yoshio, 2005). 현재 시판중인 α-glucosidase 저해제는 α -amylase를 과다 억제함으로써 복부 팽만, 설사 및 소화장애 등의 부작용이 심하게 나타나는 문제점을 가지고 있다(Dvornik, 1987).

    따라서 본 연구에서는 기존의 α-glucosidase 저해 제의 부작용을 최소화하고 α-glucosidase 저해활 성이 우수한 천연 자원을 개발하기 위하여 개똥쑥 으로부터 천연 물질을 구조 동정하고 분리된 물질 에 대하여 α-glucosidase 저해활성을 측정하였다.

    재료 및 방법

    1시료 채취 및 조제

    본 실험에 사용한 개똥쑥(Artemisia annua L.)잎과 줄기 시료는 2013년 7~8월에 경상남도 산청군 생약농 업협동조합에서 채취한 어린잎과 줄기를 사용하였다. 채취한 잎과 줄기는 음건한 다음 마쇄하여 사용하였 다. 개똥쑥 시료 4kg에 40L의 100% methanol(SK Chemicals, Seongnam-si, Korea)을 첨가하고 3일 동안 상온 교반하여 2회 반복 추출하였다. 개똥쑥 100% methanol 추출물을 large scale rotaty evaporator(R-220SE, Bü chi, Flawil, Switzerland) 에 1차 농축시킨 후 rotaty vacuum evaporator (N-1200B, EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 methanol을 완전히 제거하였다. 농축이 완료된 methanol 조추출물은 -70℃의 deep freezer (CLN-70UW, Nihon, Tokyo, Japan)에 보관하면 서 사용하였다.

    2유기용매를 이용한 분획물 조제

    농축 건조된 개똥쑥 methanol 조추출물을 증류수 에 현탁시킨 후 용매의 극성에 따라 n-hexane, chloroform, ethyl acetate(EtOAc), n-butanol (BuOH)로 3회씩 반복하여 각 층으로 분획하였다 (Fig. 1). 각 분획층을 rotaty vacuum evaporator N-1200B, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 완 전히 농축하여 -70℃의 deep freezer에 보관하면서 α-glucosidase 저해 활성 측정 및 물질 구조 동정 을 위한 시료로 사용하였다(Fig. 1). 본 연구에 사용 된 분획 용매는 모두 1급 시약(SK Chemicals, Seongnam-si, Korea)을 사용하였다.

    3Chloroform 분획층의 물질 분리

    Chloroform 분획층(9.15g)은 MPLC(Combiflash Rf200, Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA)를 사 용하여 1차 분리하였다. Pre-packed silica gel column (Teledyne Isco, 30×220mm, 20×140mm) 에 chloroform 분획층을 약 500mg/mL의 농도로 조제하여 5mL 주입하고 Table 1의 조건으로 분리하 였다. MPLC상에서 순차적으로 분리된 분획을 TLC 로 확인하여 비슷한 Rf값을 나타내는 성분 패턴끼리 모아 농축하여 6개의 분획물을 선발하고 3개의 분획 물(fr.3, fr4, fr6) 각각을 Prep-LC(PLC2020, Gilson, Middleton, WI, USA)를 사용하여 Table 1 의 조건으로 분리․정제하였다. 분리된 화합물의 LC retention time과 분자량을 UPLC-TOF-MS(Xevo G2-S Q-TOF, Waters, Milford, MA, USA)를 통 해 확인하였으며, 그 결과 개똥쑥 잎의 chloroform 분획층으로부터 6개의 화합물(ArteCA~ArteCF)을 얻었다(Fig. 2).

    4EtOAc 분획층의 물질 분리

    EtOAc 분획층은 MPLC(Combiflash Rf200, Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA)를 사용하여 1차 분리하였다. Pre-packed silica gel column (Teledyne Isco, 30×220mm)에 EtOAc 분획층을 약 500mg/mL의 농도로 조제하여 5mL 주입하고 Table 1의 조건으로 분리하였다. MPLC상에서 순 차적으로 분리된 분획을 TLC로 확인하여 비슷한 Rf값을 나타내는 성분 패턴끼리 모아 농축하여 4개 의 분획물을 선발하고 3개의 분획물(fr.1-3) 각각 을 Prep-LC(PLC2020, Gilson, Middleton, WI, USA)를 사용하여 Table 2의 조건으로 2차 분리하 였다. LC 분석 크로마토그램에서 비슷한 retention time을 가지는 화합물들은 정확한 분리를 위하여 recycling LC(LC-9130NEXT, JAI, Tokyo, Japan) 를 활용하여 한번 더 분리․정제하였다. 분리된 화 합물의 LC retention time과 분자량을 UPLCTOF- MS(Xevo G2-S Q-TOF, Waters, Milford, MA, USA)를 통해 확인하였으며, 그 결과 개똥쑥 잎의 EtOAc 분획층으로부터 총 5개의 화합물 (ArteEAA~ArteEAE)을 얻었다(Fig. 3).

    5구조동정

    개똥쑥 추출물의 chloroform 분획층, EtOAc 분획층으로부터 최종 분리된 화합물의 화학구조 를 규명하기 위하여 1H-NMR(500 MHz, Bruker DRX-500, Rheinstetten, Germany). 13C-NMR을 사용하여 proton 및 carbon signal을 얻었으며 분 리된 구조는 Fig. 4에 나타내었다.

    6α-Glucosidase 저해활성 측정

    α-Glucosidase 저해 활성은 Matsui et al.(2001) 이 사용한 nitrophenol 분석법을 변형하여 측정하였 다. 0.5U/mL α-glucosidase 효소액 50μL, 2.4mM p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside 75μL, 시료 50μL 및 50mM potassium phosphat buffer(pH 6.8) 825μL를 혼합하여 Multimicroplate reader (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 405nm에서 10초 간격으로 10분간 흡광도 값을 측정하였다. 이때 활성 비교를 위하여 acarbose를 사용하였으며 효소 활성의 저해 정도는 다음 식에 의하여 산출하였다. 생리 활성 검 증에 대한 시약은 Sigma chemical co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

    α Glucosidase   저해활성 % = ( 1 시료첨가군의흡광도 무첨가군의흡광도 ) × 100

    7통계처리

    분석결과는 측정치의 평균±표준편차로 표시하 였고, 통계처리는 SAS package program(1996)의 General Linear Model(GLM) procedure에 따라 처리하였으며, 각 처리구간의 유의성 검증은 분산 분석을 실시 후, Duncan's multiple range tests (Duncan, 1955)로, 5% 수준(p<0.05)에서 실시하 였다.

    결과 및 고찰

    1NMR에 의한 chloroform 분획층 물질 구조 및 동정

    ArteCA: yellow powder : TOF-MS(m/z ): 317.06534 [M+H]+, Rt : 11.00 min: 1H NMR(500 MHz, DMSO, δ ppm): δ 7.31(d, J=2.5Hz, 1H, H-2'), 7.25(dd, J=2.5Hz, 8.0Hz, 1H, H-6'), 6.49(d, J=8Hz, 1H, H-5'), 6.03(d, J=2.0Hz, 1H, H-8), 5.75(d, 2.0Hz, 1H, H-6), 3.40(s, 3H, 3'-OMe); 13C NMR(125 MHz, DMSO, δ ppm): δ 175.9(C-4), 164.0(C-7), 160.7(C-5), 156.2 (C-9), 148.8(C-4'), 147.4(C-3'), 146.6(C-2), 135.8(C-3), 122.0(C-6'), 121.7(C-1'), 115.6(C-5'), 111.7(C-2'), 103.3(C-10), 98.2(C-6), 93.6(C-8), 55.8(3'-OMe). 이상의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료(Lee et al., 2008)와 비교하여 화합 물 ArteCA는 분자량 316, 화학구조식 C16H12O7인 isorhamnetin (Fig. 2)로 구명되었다.

    ArteCB: yellow powder : TOF-MS(m/z ): 361.09300 [M+H]+, Rt. 12.43min : 1H NMR(500 MHz, DMSO, δ ppm): δ 7.61(d, J=2.0Hz, 1H, H-2'), 7.50(dd, J=2.0Hz, J=8.5Hz, 1H, H-6'), 6.92(d, J=8.5, 1H, H-5'), 6.86(s, 1H, H-8), 3.92(s, 3H. 7-OMe), 3.80(s, 3H. 3-OMe), 3.73 (s, 3H. 6-OMe); 13C NMR(125 MHz, DMSO, δ ppm): δ 178.7(C-4), 159.1(C-7), 156.5(C-9), 152.2(C-5), 152.1(C-2), 149.4(C-4'), 145.8(C-3'), 138.1(C-3), 132.0(C-6), 121.2(C-1'), 121.1(C-6'), 116.2(C-2'), 116.0(C-5'), 106.0(C-10), 91.7(C-8), 60.5(6-OMe), 60.1(3-OMe), 56.9(7-OMe). 이상 의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료(Ling et al., 2010)와 비교하여 화합물 ArteCB는 분자량 360, 화학구조식 C18H16O8인 chrysosplenol D(Fig. 2)로 구명되었다.

    ArteCC: yellow powder : TOF-MS(m/z): 317.06534 [M+H]+, Rt. 12.91min :1H NMR(500 MHz, DMSO, δ ppm): δ 7.73(d, J=2.5Hz, 1H, H-2'), 7.58(dd, J=2.5Hz, J=8.5Hz, 1H, H-6'), 6.89(d, J=8.5Hz, 1H, H-5'), 6.70(d, J=2.5Hz, 1H, H-8), 6.35(d, J=2.5Hz, 1H, H-6), 3.87(s, 3H, 7-OMe); 13C NMR(125 MHz, DMSO, δ ppm): δ176.4(C-4), 165.4(C-7), 160.8(C-5), 156.5(C-9), 148.3(C-4'), 147.7(C-2), 145.6(C-3'), 136.5(C-3), 122.3(C-1'), 120.5(C-6'), 116.0(C-5'), 115.7(C-2'), 104.5(C-10), 97.9(C-6), 92.4(C-8), 56.5(7-OMe). 이상의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료(Lee et al., 2008)와 비교하여 화합 물 ArteCC는 분자량 316, 화학구조식 C16H12O7인 rhamnetin(Fig. 2)로 구명되었다.

    ArteCD: yellow powder : TOF-MS(m/z ): 375.10947 [M+H]+, Rt. 13.43min : 1H NMR(500 MHz, DMSO, δ ppm): δ 7.71(m, 1H, H-2'), 7.67(m, 1H, H-6'), 7.00(m, 1H, H-5'), 6.50(s, 1H, H-8) 3.99(s, 3H, 3'-OMe), 3.96(s, 3H, 7-OMe), 3.92(s, 3H, 6-OMe), 3.87(s, 3H, 3-OMe); 13C NMR(125 MHz, DMSO, δ ppm): δ 178.9(C-4), 158.8(C-7), 156.0(C-2), 152.8(C-5), 152.3(C-9), 148.4(C-4'), 146.4(C-3'), 138.7(C-3), 132.3(C-6), 122.6(C-6'), 122.4(C-1'), 114.6(C-5'), 110.9(C-2'), 106.6(C-10), 90.4(C-8), 60.9(6-OMe), 60.2(3'-OMe), 56.3(3-OMe), 56.1(7-OMe). 이상 의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료(Maria et al., 2010)와 비교하여 화합물 ArteCD는 분자 량 374, 화학구조식 C19H18O8인 chrysosplenetin (Fig. 2)로 구명되었다.

    ArteCE: white powder : TOF-MS(m/z): 285.07560 [M+H]+, Rt. 13.48min : 1H NMR(500 MHz, DMSO, δ ppm): δ 8.03(dd, J=2.0Hz, J= 7.0Hz, 2H, H-2' and H-6'), 7.11(dd, J=2.0Hz, J=7.0Hz, 2H, H-3' and H-5'), 6.87(s, 1H, H-3), 6.51(d, J=2.0Hz, 1H, H-8), 6.21(d, 2.0Hz, 1H, H-6), 3.87(s, 1H, 4'-OMe); 13C NMR(125 MHz, DMSO, δ ppm): δ 182.2(C-4), 164.7(C-2), 163.8(C-4'), 162.8(C-7), 161.9(C-5), 157.8(C-9), 128.8(C-2' and C-6'), 123.3(C-1'), 115.0(C-3' and C-5'), 104.2(C-10), 104.0(C-3), 99.4(C-6), 94.5(C-8), 56.0(4'-OMe). 이상의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료(Ashour, 2015; Samy et al., 2009) 와 비교하여 화합물 ArteCE는 분자량 284, 화학구 조식 C16H12O5인 acacetin(Fig. 2)로 구명되었다.

    ArteCF: white powder : TOF-MS(m/z): 271.09733 [M+H]+, Rt. 14.64min : 1H NMR(500 MHz, Acetoned6, δ ppm): δ 8.05(d, J=9.50Hz, 1H, H-4), 7.96(d, J=2.0Hz, 1H, H-2'), 7.63(s, 1H, H-5), 7.01(d, J=2.0Hz, 1H, H-3'), 6.36(d, J=9.50Hz, 1H, H-3), 5.57(m, 1H, H-3"), 4.98 (d, J=7.0Hz, 2H, H-2"), 1.72(S, 3H, Me-6"), 1.70(S, 3H, Me-5"); 13C NMR(125 MHz, Acetone-d6, δ ppm): δ 159.6(C-2), 148.6(C-7), 147.2(C-2'), 144.7(C-4), 144.0(C-9), 139.0(C-4"), 131.2(C-8), 126.0(C-6), 120.0(C-3"), 116.7(C-10), 114.3(C-3), 113.9(C-5), 106.9(C-3'), 69.5(C-2"), 24.9(C-6"), 17.2(C-5"). 이상의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료(Ganbaatar, 2013)와 비 교하여 화합물 ArteCF는 분자량 270, 화학구조식 C16H14O4인 imperatorin(Fig. 2)로 구명되었다.

    2NMR에 의한 EtOAc 분획층 물질 구조 및 동정

    ArteEAA: yellow powder : TOF-MS(m/z): 179.03492 [M+H]+, Rt. 2.48min : 1H NMR(500 MHz, DMSO, δ ppm): δ 7.87(d, J=9.5Hz, 1H, H-4), 6.99(s, 1H, H-8), 6.75(s, 1H, H-5), 6.17(d, J=9.5Hz, 1H, H-3); 13C NMR(125 MHz, DMSO, δ ppm): δ 161.3(C-2), 150.9(C-7), 149.0(C-9), 144.9(C-4), 143.3(C-6), 112.8(C-5), 112.0(C-10), 111.2(C-3), 103.1(C-8). 이상의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료(Marlena, 2013)와 비교하여 화합물 ArteEAA는 분자량 178, 화학구조식 C9H6O4인 6,7-dihydroxycoumarin(Fig. 2)로 구명되었다.

    ArteEAB: yellow powder : TOF-MS(m/z): 193.05001 [M+H]+, Rt. 3.79min : 1H NMR(500 MHz, DMSO, δ ppm): δ 7.91(d, J=9.50Hz, 1H. H-4), 7.22(s, 1H, H-5), 6.78(s, 1H, H-8), 6.22 (d, J=9.5Hz, 1H, H-3), 3.82(s, 3H, 6-OMe); 13C NMR(125 MHz, DMSO, δ ppm): δ 161.1(C-2), 151.6(C-7), 150.0(C-9), 145.7(C-6), 144.9(C-4), 112.1(C-3), 111.0(C-10). 110.1(C-5). 103.2(C-8), 56.5(6-OMe). 이상의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료(Darmawan et al., 2012)와 비교하여 화합물 ArteEAB는 분자량 192, 화학구조식 C10H8O4 인 scopoletin(Fig. 2)로 구명되었다.

    ArteEAC: yellow powder : TOF-MS(m/z): 449.10827 [M+H]+, Rt. 5.95min : 1H NMR(500 MHz, DMSO, δ ppm): δ 8.04(d, J=2.0Hz, 2H, H-2' and H-6'), 6.89(d, J=9.0Hz, 2H, H-3' and H-5'), 6.44(d, J=2.0Hz, 1H, H-8), 6.21(d, J=2.0Hz, 1H, H-6), 5.46(d, J=7.5Hz, 1H, glc-H-1), 3.58-3.09(5H, glucose); 13C NMR(125 MHz, DMSO, δ ppm): δ 177.9(C-4), 164.7 (C-7), 161.7(C-5), 160.4(C-4'), 156.9(C-2), 156.7(C-9), 133.6(C-3), 131.4(C-2' and C-6'), 121.4(C-1'), 115.6(C-3' and C-5'), 104.4(C-10), 101.3(glc-C-1), 99.2(C-6), 94.1(C-8), 78.0(glc-C-3), 76.9(glc-C-5), 74.7(glc-C-2), 70.3(glc-C-4), 61.3(glc-C-6). 이상의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료(Shahat et al., 2005)와 비 교하여 화합물 ArteEAC는 분자량 448, 화학구조 식 C21H20O11인 kaempferol-3-O-b-D-glucoside (Fig. 2)로 구명되었다.

    ArteEAD: yellow powder : TOF-MS(m/z): 465.10423 [M+H]+, Rt. 4.20min : 1H NMR(500 MHz, DMSO, δ ppm): δ 7.59(d, J=2.0Hz, 1H, H-2'), 7.57(dd, J=2.0Hz, J=9.0Hz, 1H, H-6'), 6.85(d, J=9.0Hz, 1H, H-5'), 6.41(d, J=2.0Hz, 1H, H-8), 6.21(d, 2.0Hz, 1H, H-6), 5.47(d, J=7.5Hz, 1H, glc-H-1), 3.60-3.10(5H, glucose); 13C NMR(125 MHz, DMSO, δ ppm): δ 177.9 (C-4), 164.6(C-7), 161.7(C-5), 156.8(C-9), 156.6 (C-2), 148.9(C-4'), 145.3(C-3'), 133.8(C-3), 122.1(C-6'), 121.6(C-1'), 116.7(C-5'), 115.7(C-2'), 104.4(C-10), 101.3(glc-C-1), 99.1(C-6), 94.0(C-8), 78.0(glc-C-3), 77.0(glc-C-5), 74.6(glc-C-2), 70.4(glc-C-4), 61.4(glc-C-6). 이상의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료(Li et al., 2008)와 비 교하여 화합물 ArteEAD는 분자량 464, 화학구조식 C21H20O12인 quercetin-3-O-b-D- glucoside(Fig. 2)로 구명되었다.

    ArteEAE: yellow powder : TOF-MS(m/z): 319.04459 [M+H]+, Rt. 6.59min : 1H NMR(500 MHz, DMSO, δ ppm): δ 7.25(s, 2H, H-2' and H-6'), 6.38(d, J=2.0Hz, 1H, H-8), 6.19(d, J=2.0Hz, 1H, H-6); 13C NMR(125 MHz, DMSO, δ ppm): δ 176.2(C-4), 164.4(C-7), 161.2(C-5), 156.5(C-9), 147.3(C-2), 146.2(C-3' and C-5'), 136.3(C-3 and C-4'), 121.2(C-1'), 107.6(C-2' and C-6', 103.4(C-10), 98.6(C-6), 93.7(C-8). 이상의 NMR spectral data와 이에 관한 문헌자료 (Li et al., 2013) 비교하여 화합물 ArteEAE는 분 자량 318, 화학구조식 C15H10O8인 myricetin(Fig. 2)로 구명되었다.

    3α-Glucosidase 저해활성

    식품으로부터 체내로 흡수된 당은 각 조직의 세 포가 잘 이용할 수 있도록 α-amylase에 의해 이당 류로 분해되고, 최종적으로 단당류로 분해되어 소 장의 융털로 흡수되어 혈관으로 이동하게 된다(Van et al., 2005). α-Glucosidas는 소장 상피세포의 brush-border membrane에 존재하는 효소로서 이 당류나 다당류를 가수분해하는 촉매역할을 한다. α-Glucosidase에 대한 저해활성은 탄수화물 식이 후 포도당의 흡수를 억제시켜 혈당상승을 억제시킨 다(Kim et al., 2009). 따라서 α-glucosidase 저해 활성은 제 2형 당뇨와 같은 당질 관련 질병 치료제 개발에 이용될 수 있다.

    본 연구에서는 개똥숙 잎, 줄기 100% methanol 추출물로부터 분리된 11개의 compound의 제 2형 당뇨병 환자의 당질가수분해와 흡수를 지연시켜 식 후 혈당을 조절할 수 있는 기능성을 찾고자 α- glucosidase 저해활성 결과를 Table 2에 나타내었 다. 대조구인 acarbose 500uM에서는 64.1%의 저 해활성을 나타내었고, 같은 농도에서 11개의 compound 중 ArteEAE가 97.3%로 높은 저해활성 을 보였다. ArteEAE는 분자량 318.2, 화학구조 식 C15H10O8인 myricetin으로 확인되었다. 따라서 myricetin에 대한 효소반응 속도에 따른 기작과 저 해양상을 확인한 결과를 Fig. 5를 통해 나타내었다. 그 결과 Fig. 5에서 볼 수 있듯이 myricetin의 농도 (✕; 0uM, ▲; 10uM, ■; 25uM, ◆; 50uM)가 높 아짐에 따라 기울기 값이 증가하는 선들이 Y-축이 나 X-축이 아닌 분면에서 만남으로써 mixed 유형 의 저해제인 것을 확인할 수 있었다. 최근 연구보고 에 따르면, Matsuoka et al.(2006)은 플라보노이드 류의 항당뇨 효능, 특히 α-glucosidase 저해활성은 myricetin이 가장 우수한 것으로 보고하였다.

    본 연구결과는 개똥쑥이 탄수화물의 소화 과정에 서 α-glucosidase에 의한 단당류 생성을 저해함으 로써 식사 후 혈당이 급격히 상승하는 등의 증상을 제어할 수 있음을 간접적으로 시사하고 있다.

    감사의 글

    본 연구는 중소기업청 중소기업융복합기술개발사 업 연구과제인 지리산 개똥쑥을 이용한 항비만 기능 성 식품개발(과제번호: S2148343)의 지원에 의해 이루어진 연구결과의 일부로 이에 감사드립니다.

    Figure

    JALS-50-161_F1.gif

    A scheme of solvent fractionation of methanol extract from Artemisia annua L. leaves and stems.

    JALS-50-161_F2.gif

    Isolation of 6 compounds(ArteCA-ArteCF) from the CHCl3 layer of Artemisia annua L. leaves and stems.

    JALS-50-161_F3.gif

    Isolation of 5 compounds(ArteEAA-ArteEAE) from the EtOAc layer of Artemisia annua L. leaves and stems.

    JALS-50-161_F4.gif

    Chemical structures of compounds(ArteCA~ArteCG, ArteEAA~ArteEAE) isolated from Artemisia annua L. leaves and stems.

    JALS-50-161_F5.gif

    Kinetics of inhibition(A: The catalytic activity of α-glucosidase as function of enzyme concentrations of myricetin)(✕; 0μM, ▲; 10μM, ■; 25μM, ◆; 50μM).

    Table

    Analytical conditions of MPLC and prep-LC for isolation of effective compounds from chloroform layer and ethyl acetate layer

    Inhibitory effects of α-glucosidase of isolated compounds from Artemisia annua L. leaves

    1)All compounds were examined in a set of experiments repeated three times; IC50 values of compounds represent the concentration that caused 50% enzyme activity loss.
    2)Values of inhibition constant.
    3)Each value is mean ± SD(n=3)
    4)Mean with the same letters(a-d) are not significantly by Duncan’s multiple range test(p<0.05)

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