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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.50 No.1 pp.83-93
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2016.50.1.83

Etablishment of High Throughput Screening for High Protein Content corn inbred lines from Indian using FT-IR spectroscopy and lysine, tryptophan analysis

Suel Hye Hur1,3, Seok Hyeon Nahm2, Seung Gyun Yang2, Suk Weon Kim1, Byung Whan Min3*
1Microbiological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB), 125 Gwahangno, Yuseong-gu, Daejeon, 34141, Korea
2Breeding Institute, Nong Woo Bio Co., Ltd., Yeoju, Gyeonggi, 12655, Korea
3Division of Ecological & Environmental System Kyungpook National University, Sangju, 37224, Korea
Corresponding author: Byung Whan Min +82-54-530-1203+82-54-530-1209minbw@knu.ac.kr
August 24, 2015 January 20, 2016 January 22, 2016

Abstract

This study aims to develop of high throughput screening system for high-protein corn inbred lines from Indian using FT-IR spectroscopy and lysine, tryptophan analysis. Total 48 corn inbred lines and cultivars were subjected to FT-IR spectroscopy. 24 lines out of total corn samples were randomly selected and examined the total protein contents in seed powder using Bradford assay. The inbred line H4 showed the highest total protein content (10.26 ± 0.1mg/L-1) and the content of total protein from Gwangpyeongok maternal line (GPO1) which is domestically evaluated as superior silage corn was 9.34 ± 0.1mg/g. The PLS prediction of total protein contents was performed from FT-IR spectra and conducted the cross-validation test for PLS prediction of total protein content. Regression coefficient (R2) was 0.77 indicating that prediction accuracy was reached to be about 80% after linear regression analysis between predicted and estimated value from 24 inbred lines. Using this PLS prediction modeling, inbred line H4, H6, H11 and H12 were selected for the highest protein content line. The results shown in this study could be applied for screening and selection system of high proteins lines in breeding of silage corn cultivar. Furthermore, this spectroscopic screening system successfully applied for quality evaluation and elite line breeding of corn cultivars.


FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 이용한 고단백질 인도 옥수수계통 신속선발체계 확립 및 라이신과 트립토판 분석

허 설혜1,3, 남 석현2, 양 승균2, 김 석원1, 민 병환3*
1한국생명공학연구원 미생물자원센터
2농우바이오 육종연구소
3경북대학교 생태환경대학 생태환경시스템학부

초록

본 연구에서는 FT-IR 스펙트럼데이터의 다변량 통계분석 기법을 활용하여 인도수집 옥수수 계통 및 품종으로부터 단백질 함량이 높은 옥수수를 신속하게 선발할 수 있는 선발체계를 확립함과 동시에 lysine과 tryptophan의 함량분석을 목적으로 연구를 수행하였다. 총 48시료의 인도수집 옥수수 계통 및 품종과 국내산 품종을 이용하여 종자로부터 FT-IR 스펙트럼을 조사하였으며, 무작위로 선발된 24시 료를 대상으로 총 단백질 함량을 조사하였다. 대조구로 사용한 광평옥 모계(GPO1)의 경우 단백질 함량 이 9.34 ± 0.3mg/g dw인데 비하여 H4 계통의 경우 단백질 함량이 10.26 ± 0.5mg/g dw로 48개 옥 수수 시료 중에서 가장 높게 나타났다. 특히 옥수수 H4, H6, H11, 그리고 H12 계통의 경우 총 단백질 함량이 각각 10mg/g dw 이상으로 측정되어 광평옥 모계(9.34mg/g dw)와 부계(9.36mg/g dw) 및 이 들의 F1(9.14mg/g dw)보다 총 단백질 함량이 높은 계통으로 판명되었다. Cross-validation test에서 옥수수 종자 내 총 단백질 함량예측 PLS regression model의 regression coefficient(R2) 는 0.77로 비교적 정확하게 총 단백질 함량예측이 가능한 것으로 나타났다. 따라서 본 PLS regression model을 이용하여 단백질 함량이 높은 사일리지 옥수수 계통의 선발이 가능할 것으로 기대되며, 더 나아가 다양 한 옥수수 계통의 신속한 대사체 수준 평가가 가능할 것으로 예상된다.


    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs
    Ministry of Oceans and Fisheries
    Rural Development Administration
    Korea Forest Service

    서론

    옥수수(corn, maize. Zea mays L.)는 벼과 (Gramineae)에 속하는 1년생 작물로서 원산지는 남 아메리카이며 쌀과 밀을 포함한 세계 3대 작물 중 하나이다(Hyun et al., 2008). 옥수수의 종실은 전 분 77% 당 2%, 단백질 9%, 지방 5%, 펜토산 5% 및 회분 2%로 구성되어, 소량의 지방성분이 포함되 어 있지만 주성분은 전분으로 구성되어 있다 (Constantinos et al., 2000). 고품질 옥수수 품종 개발을 위해 단백질 즉 아미노산 조성 변화의 연구 들이 시도되고 있는데(CIMMYT, 1985; Bryan & Larkins, 2005; Son et al., 2012), 이러한 신품종 개발 연구는 식용 옥수수뿐만 아니라 가축 사료용 옥수수에 대해서도 고단백 사일리지 옥수수 품종 개 발에 대한 연구가 이루어지고 있다(Kim et al., 2006). 현재 국내에서 사용되고 있는 사일리지용 옥 수수는 대부분 수입되거나 또는 수입된 옥수수종자 를 재배하여 조사료로 이용하고 있다(Son et al., 2006). 따라서 사료용 사일리지 옥수수의 안정적인 국내 수급과 이에 따른 수입 의존도를 효과적으로 낮추기 위해서는 고품질 사일리지용 옥수수의 국내 품종 육성이 시급하게 이루어져야 할 것이며 나아가 수출용 옥수수의 품종개발에도 모든 노력을 경주해 야 할 것이다.

    적외선 분광분석 즉 FT-IR(fourier transform infrared spectroscopy)을 이용한 대사체 지문분석 기술(metabolite fingerprinting)은 시료의 전세포 추출물로부터 혼합된 전반적인 대사체 정보를 얻을 수 있는 광학적 분석기술이다(Kos et al., 2003). FT-IR 분석은 비교적 간편한 전세포 추출과정을 통 해 매우 빠르고 쉽게 시료에 대한 조사가 이루어진 다는 장점을 가지고 있다(Monferrere et al., 2012). 또한 얻어진 FT-IR 스펙트럼 데이터는 스펙 트럼 부위에 따라 아미노산이나 단백질에 존재하는 amide Ⅰ, Ⅱ bond, 지방이나 핵산에 존재하는 phosphodiester bond, 그리고 soluble sugar 등 탄 수화물계열 화합물들의 질적, 양적인 정보를 전체적 으로 파악할 수 있다(Dunn et al., 2005). 따라서 이와 같은 대사체 분석의 편리성으로 인해 FT-IR 스펙트럼 데이터를 기반으로 실시된 대사체 지문분 석기술은 유연관계가 높은 미생물 종의 식별 (Goodacre et al., 1998), 식물세포벽의 당성분 등 화학적 조성차이에 따른 돌연변이주 식별(Chen et al., 1998), 고등식물의 종 구분(Kim et al., 2004) 및 품종 식별(Kim et al., 2007; 2009), 과일 주스 에 대한 품질 평가(Leopold et al., 2011), 재배 환 경에 따른 품종 식별(Luca et al., 2012), 해바라기 종자내 올레인산 함량에 따른 분류(Monferrere et al., 2012) 등 다양한 분야에서 응용 연구가 이루어 지고 있다. 최근 이와 같은 적외선 스펙트럼 데이터 기반 대사체 지문분석기술은 식품이나 식물에 있어 여러 조직과 기관에 존재하는 유용한 기능성 성분들 의 함량예측 모델링 개발 연구(Marinovic et al., 2012; Sills & Gossett, 2012) 및 특정 성분이 높은 우수 계통을 선발하는 연구(Pillonel et al., 2007; Yuan et al., 2013) 분야에도 활용이 이루어지고 있다.

    따라서 본 연구에서는 남부아시아 수출용 사일리 지 옥수수의 고단백 품종 육성을 위하여 인도 현지 에서 수집한 39계통의 옥수수와 6개의 시판종 옥수 수로부터 FT-IR 스펙트럼 데이터와 단백질 함량 데 이터를 기반으로 옥수수 종자내의 단백질 함량을 정 량분석 하였으며 나아가 동일한 계통에 있어서 lysine과 tryptophan의 함량을 분석하여 사료용 고 단백 옥수수 계통 육성의 육종발판을 구축하고자 한 다.

    재료 및 방법

    1식물재료

    본 실험에서는 총 48개의 옥수수 시료가 사용되 었다. 실험에 이용된 45개 옥수수 계통 및 품종은 ㈜농우바이오 육종연구소 인도 현지에서 수집한 유 전자원을 분양 받았으며, 대조구로 사용한 광평옥 (모계:GPO1, 부계:GPO2 및 F1: GPO3)은 국내 품 종으로 농촌진흥청에서 종자로 분양 받아 실험에 사 용하였다. 총 48개 시료의 옥수수 종자를 막자 사발 에 넣고 분쇄하여 powder library를 제조하였으며, 마쇄된 분말을 이용하여 총 단백질 정량분석 및 FT-IR 스펙트럼 조사분석을 실시하였다.

    2옥수수 종자로부터 총 단백질의 추출 및 함량분석

    총 48개의 옥수수시료를 이용하여 종자 내 총 단백 질 함량을 조사하였다. 옥수수분말 20mg을 Eppendorf tube (1.5ml)에 넣은 다음, Shewry법(Shewry et al., 1995)을 기준으로 총 단백질을 추출하였다. 단 백질추출 buffer(1M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 1M DTT(dithiothreitol), 100% Glycerol, MilliQ water) 400ul를 첨가하여 잘 섞은 후 13000rpm에 서 20분간 원심분리 한 후 상층액을 회수하여 상온 에서 1시간 30분간 반응하였으며, 변성 과정은 10 0°C에서 2분간 실시하였다. 단백질의 함량분석은 Bradford assay(Bradford, 1976)방법에 준하여 수 행하였으며, UV-spectrophotometer를 이용하여 595nm에서 흡광도를 조사하였다. 각 시료의 보다 정확한 통계적 분석을 위해 모든 시료는 3회 반복 조사하였다.

    3옥수수 추출물 제작 및 FT-IR 스펙트럼 데이터 다변량 통계분석

    총 48개의 옥수수 종자 시료로부터 FT-IR 스펙 트럼 조사를 위해 옥수수 분말 시료 20mg을 Eppendorf tube (1.5ml)에 담아 20% MeOH 50ul 를 첨가하여 잘 섞어준 다음 50°C 항온수조에서 20 분간 반응 하였다. 반응 종료 후 13,000rpm에서 15 분간 원심 분리하여 불순물이 섞이지 않도록 상층액 을 조심스럽게 새 tube로 옮겨주었으며, 동일한 방 법으로 원심분리 및 회수과정을 반복 수행하였다. 준비된 옥수수 추출물을 384-well 실리콘 plate (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany)에 5ul씩 분주한 다음 slide warmer(C-SL, Chang Shin Science co.,Korea)를 이용하여 37°C에서 약 30분간 건조하였다. 건조된 plate는 Tensor 27에 장착된 HTS-XT(Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany) 고효율 자동화 장치를 이용하여 스펙트 럼을 측정하였으며, FT-IR 스펙트럼 조사는 Tensor 27을 사용하여 DTGS(deuteratedtriglycine sulfate) 검출기로 분석하였다. FT-IR 스펙트럼 조 사는 총 4,000 - 400cm-1 범위에서 4cm-1 간격으 로 총 128회 반복 측정된 평균 스펙트럼을 다변량 통계분석에 사용하였다. 각 시료의 통계적 분석을 위해 모든 시료는 3회 반복 조사하였다. FT-IR 스 펙트럼 조사 및 데이터 변환에 사용된 프로그램은 Bruker에서 제공하는 OPUS Lab(ver 7.0, Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany)을 사용하였 다. 옥수수 종자시료로부터 얻어진 FT-IR 스펙트럼 데이터는 베이스계통 교정과 실험상의 오차를 최소 화하기 위해 표준화 과정(normalization)을 실시하 였다. 이러한 가공과정을 거친 FT-IR 스펙트럼데이 터로부터 1,800 - 800cm-1 부분을 절취하여 양 끝 점의 흡광도를 0으로 조정 후 데이터의 mean centering 과정을 거쳐 2차 미분을 실시하였다. 2차 미분이 이루어진 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용하여 NIPALS 알고리즘(Wold, 1966)을 통하여 프로그램 R(ver 2.15.3)에서 주성분 분석(principal component analysis, PCA) 및 PLS 회귀분석(partial least square regression, PLS)을 수행하였다.

    4옥수수 종자 FT-IR 스펙트럼으로부터 단백질함량 예측 PLS 모델링 개발 및 고단백 옥수수 계통 선발

    옥수수 종자시료의 FT-IR 스펙트럼 데이터로부 터 단백질 함량 예측 PLS 모델링을 확립하기 위 해, 총 48개 옥수수 계통 및 품종 종자의 FT-IR 스펙트럼 데이터와 단백질 정량분석 데이터간의 상 관분석을 실시하였다. 총 단백질 함량 예측 정확성 은 검량식 결정계수(R2), 검량식 예측 오차(root mean square error of prediction, RMSEP)를 기 준으로 결정계수가 가장 높고 오차가 낮은 PLS 예 측 모델을 선정하였다. 확립된 단백질 함량 예측 PLS 모델을 이용하여 총 단백질 함량 분석을 수행 하지 않은 옥수수 48개 계통 및 품종으로부터 총 단백질 함량 값을 예측하였다. 이중 24개 계통(H4, H12, H19, H26, H27, H29, H41, H43, H44, H45, H46, H50, H51, NK6240 ♂, NK6240 ♀, NK6240 F1, NK30 ♂, NK30 ♀, NK30 F1, 900M Gold ♂, 900M Gold ♀, 900M Gold F1, P3394, 31N27, 32P75, 32W86, 31P41, GPO1, GPO2, GPO3)을 무작위로 선발하여 예측된 총 단 백질 함량 값과 실제 조사된 단백질 함량 값의 차 이가 이루어지는지 external validation을 통해 예 측모델의 실측검정을 수행하였다. External validation 을 통한 단백질 함량 예측 PLS 모델의 예측정확도 는 실측 값과 예측 값에 대한 선형회귀분석을 통하 여 상관계수를 조사하여 예측모델의 정확도를 확인 하였다.

    5아미노산 분석법(lysine, tryptophan)

    아미노산의 분석은 이온 교환 크로마토그래피법 (Ninhydrin 법)에 의해 정량분석 하였으며 lysine 은 stable계열에 속하는 아미노산으로 시료는 50~300mg(조단백질로 30mg 정도)을 취해서 분해 병에 넣은 후 6N HCl 40ml를 가하고 질소가스를 주입한 후 마개를 막고 110°C에서 24시간 가수분해 시킨 후 농축증발 플라스크에 옮기어 로타리 증발 기에 연결 50°C에서 염산을 제거시키는데, 증발이 다 되면 증류수로 분해병을 씻어 증발 플라스크에 옮기어 다시 증발시키는 것을 3회 반복하여 증발 건조시키는데 최종적으로 증발 건조되어 있는 증발 플라스크에 시료희석 완충액(pH 2.2)이나 증류수를 소량씩 가하면서 아미노산을 용해시키고 No.5B 여 과지로 여과하여 50ml로 만든 후 아미노산분석기를 통하여 측정하였다. Tryptophan의 경우 100mg의 단백질 함량 정도가 되게 시료를 취해서 분해병에 넣은 후 10ml의 4.2N NaOH를 가하고 산소를 제거 하기 위해 질소가스를 주입한 후 마개를 막고 11 0°C에서 20시간 가수분해 시킨다. 가수분해 후 시 료를 충분히 냉각시키고 50 ml의 메스플라스크에 가수분해물을 No.5B 여과지로 걸러서 넣고 0.2N sodium citrate buffer(pH 4.2)로 채운다. 여기서 다시 1~5ml을 비이커에 취하여 70°C로 보정된 항 온수조에서 수분을 증발 시킨다. 건조가 완결된 후 sodium citrate buffer(pH 4.2)와 HCl을 첨가하여 pH를 4.2로 맞추면서 25ml이 되게 한다. HCl을 첨 가 시 찌꺼기가 형성될 수도 있으나 tryptophan의 회수율에 영향을 미치지는 않는다. 25ml의 용액을 분석 전에 여과하여 아미노산 자동 분석기(Hitachi co. Ltd, Japan)에 200ul의 시료를 넣어서 분석을 수행하였다.

    결과 및 고찰

    1옥수수 시료 별 총 용해단백질 함량 비교

    단백질 함량이 높은 옥수수 계통의 신속한 선발체 계를 확립하고 남부아시아 수출용 옥수수의 육종을 위해 48개 옥수수 계통의 FT-IR 스펙트럼으로부터 총 단백질 분석을 실시하였다. 단백질 측정을 실시 한 45계통의 인도 수집계통 및 품종은 모두 국내시 판종인 광평옥에 비해 높은 단백질의 함량을 보였으 며 앞에서 언급한 7계통의 옥수수는 단백질함량이 10mg/g dw 이상을 나타내었다.

    총 48개 옥수수 시료의 종자 내 총 단백질 함량 을 3반복으로 조사하였다(Table 1). 조사된 총 48개 옥수수 시료의 종자 내 총 단백질 함량의 평균값은 9.62 ± 0.3mg/g dw 였으며, 39개 옥수수 계통과 6개의 시판종 및 대조구로 사용한 광평옥(부계, 모 계, F1)의 단백질 함량은 최저 9.04mg/g dw에서 최고 10.26mg/g dw 범위로 나타나 48개 옥수수간 의 총 단백질 함량 변이는 약 11.9% 가량 차이가 이 루어짐을 알 수 있었다. 대조구로 사용한 광평옥 모 계(GPO1)의 경우 단백질 함량이 9.34 ± 0.3mg/g dw인데 비하여 H4 계통의 경우 단백질 함량이 10.26 ± 0.5mg/g dw로 48개 옥수수 시료 중에서 가장 높게 나타났다. 특히 옥수수 H4, H6, H8, H10, H12, H35 그리고 H37 계통의 경우 총 단백질 함량이 각각 10.26, 10.02, 10.15, 10.06, 10.05, 10.10 그리고 10.02mg/g dw로 측정되어 광평옥 모 계 (9.34mg/g dw)와 부계(9.36mg/g dw) 및 F1 (9.14mg/g dw)보다 총 단백질 함량이 높은 계통으 로 판명되었다. 이러한 계통을 육성재료로 사용하면 고단백질 옥수수 품종육성도 가능할 것으로 사료된 다. 특히 이러한 계통은 현재 인도에서 시판되고 있 는 시판종인 P3394(9.35mg/g), P1184(9.47mg/g), 31N27(9.44mg/g), 32P75(9.22mg/g), 32W86 (9.39mg/g), 31P41(9.04mg/g) 등과 비교하면 월등하게 많은 단 백질 함량을 보여주었다. 이러한 계통은 단백질 함 량이 많은 사료용 옥수수의 개발을 목표로 하는 연 구팀의 연구방향에 부합되는 시료로 이러한 45계통 의 옥수수는 앞으로의 연구에 있어서 좋은 육종재료 로 활용할 가치가 높다고 사료된다.

    2옥수수 FT-IR 스펙트럼 비교분석 및 스펙트럼 데 이터 다변량 통계분석

    옥수수종자 추출물로부터 FT-IR 스펙트럼 분석을 수행한 후, 각 옥수수 계통 별로 스펙트럼의 차이를 비교 분석하였다(Fig. 1). 총 단백질 함량이 가장 높 았던 H4 계통과 반대로 총 단백질 함량이 가장 낮 았던 시판종 31P41, 그리고 대조구로 사용한 광평옥 모계(GPO1)의 FT-IR 스펙트럼 비교 분석 결과 이 들 옥수수 계통 사이에는 FT-IR 스펙트럼의 영역 중 1,750 – 1,550cm–1, 1,500 - 1,290cm-1 그리고 1,190 – 980cm–1 부위에서 큰 차이가 이루어지는 것 을 알 수 있었다(Fig. 1). FT-IR 스펙트럼의 1,750 – 1,550cm–1 부위는 주로 화합물에 존재하는 amide Ⅰ과 Ⅱ bond를 인식하는 부위로 주로 아미노산이 나 단백질의 질적, 양적 차이를 반영하는 부위이다 (Parker, 1983; Dumas & Miller, 2003). 본 연구 에서 총 단백질 함량이 높았던 H4 옥수수 계통과 함량이 낮았던 시판종 31P41 사이에는 amide부위에 서 스펙트럼의 양적 차이가 크게 이루어짐을 알 수 있었다. 따라서 이 결과는 FT-IR 스펙트럼의 amide 부위에서 나타난 양적 차이는 총단백질 함 량의 양적 변화와 양의 상관관계를보여주는 결과 라 사료된다. 두 번째 FT-IR 스펙트럼부위는 1,500 - 1,290cm-1 부위로 주로 핵산 및 인지질의 phosphodiester bond가 검출되는 부위이다 (Parker, 1983; Dumas & Miller, 2003; Lopez-Sanchez et al., 2010). 마지막으로 1,190 - 980 cm–1부위는 단 당류나 복합 당류가 검출되는 부위로 조직 내 carbohydrates 계열의 화합물들의 질적, 양적 차이 에 관한 정보를 반영하는 부위이다(Parker, 1983; Dumas & Miller, 2003; Lopez-Sanchez et al., 2010). 옥수수의 각 계통 별 스펙트럼 비교 분석 결 과 carbohydrates 부위에서도 스펙트럼의 양적 차 이가 크게 이루어짐을 알 수 있었으며 이 결과는 옥 수수 계통 별로 carbohydrates 계열 물질들의 양적 차이가 있음을 보여주는 결과라 사료된다. 따라서 FT-IR 스펙트럼의 비교분석을 통해 옥수수 계통 별 로 총 단백질 함량은 물론 carbohydrates 계열 물 질들의 양적, 질적인 차이가 크게 나타나고 있음을 알 수 있었다.

    총 48개 옥수수 시료 별 FT-IR 스펙트럼 데이 터를 기반으로 PCA분석을 수행하였다(Fig. 2). PCA 분석 결과에 따르면 PC 1과 2의 score는 각 각 11.9% 와 0.2%로 나타나 전체 변이량의 약 12.1%를 반영하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 2). PCA plot 상에서 각각의 옥수수 계통 별로 반복구 는 비교적 가까운 거리에 위치하여 FT-IR 스펙트 럼 조사의 재현성은 높은 것으로 나타났지만, 각 시료별로 뚜렷한 군집 구분은 이루어지지 않았다. 이는 옥수수 종자 내에 존재하는 대사산물의 전체 적인 패턴차이가 크지 않아서 나타나는 결과라 사 료된다. 또한 48개 옥수수 시료들의 총 단백질 함 량 값을 기준으로 단백질 함량이 높은 계통과 낮은 계통들의 분포를 조사한 결과, 단백질 함량이 높았 던 옥수수 계통들(H4, H8 및 H35)이 PCA plot 좌 측에 분포하는 반면에 31P41 옥수수 품종을 포함 한 단백질 함량이 낮았던 계통들은 PCA plot 우측 에 분포함을 알 수 있었다(Fig. 2). 이 결과는 PCA plot의 score 1번과 2번을 축으로 옥수수 시료들의 분포 위치와 이들 계통의 총 단백질 함량 사이에 상관관계가 있음을 보여주는 결과로 사료된다. 따 라서 PCA 분석을 통해 옥수수 계통 별로 총 단백 질 함량의 차이에 따른 시료 구분이 가능할 것으로 기대된다.

    옥수수 PCA 분석을 통해 총단백질 함량에 따른 그룹 구분에 중요한 역할을 하는 FT-IR 스펙트럼 부위를 알아보기 위하여 PC loading value를 조사 하였다(Fig. 3). PC 1 score와 PC 2의 score 값 결정에 중요한 변수들은 FT-IR 스펙트럼의 비교분 석에서 보여졌던 계통간에 차이가 큰 부위들(Fig. 1) 과거의 동일한 스펙트럼 부위들이, 시료의 구분 에 중요한 역할을 하는 부위임을 알 수 있었다 (Fig. 3). 즉 PC 1을 축으로 옥수수 계통 구분에 중요한 역할을 하는 부위들은 주로 carbohydrates 부위이었으며, PC 2 축은 주로 amide 부위이었다. 이 결과는 총 48개 옥수수 시료들이 PC 1을 축으 로 즉 carbohydrates 계열 물질들의 질적, 양적 차이로 PCA score plot상에서 좌우구분이 이루어 지며, 반면에 PC 2의 축 즉 amide bond를 가진 물질들의 질적, 양적 차이에 의해 PCA score plot 상에서 상하구분이 이루어지고 있음을 보여주는 결 과라 여겨진다. 따라서 옥수수 시료 별로 종자 내 에 존재하는 carbohydrates 계열 및 amide 계열 물질들의 양적차이가 존재하며 이들의 차이에 의해 시료 별 구분이 가능할 것으로 예상된다.

    3옥수수 종자 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 단백질 함량 예측 PLS모델링 확립

    총 48개 옥수수 계통 및 품종 별 FT-IR 스펙트 럼 데이터와 단백질 함량 데이터를 이용하여 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 단백질 함량 예측 PLS 모델을 개발하였다(Fig. 4). 일반적으로 PLS 예측 모델의 정확도는 검량식 결정계수(R2)가 높을 수록 우수한 모델로 알려져 있다(Adesogan et al., 1998). 따라서 단백질 함량분석이 이루어진 48개의 옥수수 계통 및 품종 중 24개의 계통을 training set로 이용하여 단백질 함량 예측모델을 개발한 결과, 단백질 함량 예측 값과 실측 값 사이 의 상관계수(R2)는 0.77로 나타나 옥수수 종자의 FT-IR 스펙트럼데이터로부터 단백질 함량예측이 매우 정확하게 이루어질 수 있음을 확인하였다 (Fig. 4).

    4옥수수 계통 및 품종의 lysine과 tryptophan분석

    옥수수는 다른 식량작물에 비하여 필수아미노산 인 lysine과 tryptophan의 함량이 미량인 것으로 알려져 있다. 단백질함량 분석에 사용한 것과 동일 한 48개의 옥수수시료를 사용하여 아미노분석기로 lysine과 tryptophan의 함량을 분석해 본 결과 다 양한 결과를 나타내었다(Table 2). Lysine의 함량 에 있어서 인도 시판종인 P3394의 경우 88.17mg/ 100g으로 최저치를 나타내었으며 국내 시판종인 광평옥 부계의 경우 351.05mg/100g으로 4배정도 많은 함량을 보였다. Tryptophan의 경우는 H33계 통이 23.20mg/100g으로 최저치를 보인 반면 인도 시판종인 NK6240은 143.80mg/100g을 나타내 6 배의 높은 함량을 보였다. 특히 앞에서 단백질의 함량분석의 결과 H4, H6, H8, H10, H12, H35, H37 계통의 경우 총 단백질 함량이 각각 10.26, 10.02, 10.15, 10.06, 10.05, 10.10 그리고 10.02mg/g dw로 측정되어 광평옥 모계 (9.34mg/g dw)와 부계 (9.36mg/g dw) 및 F1(9.14mg/g dw)보다 총 단백질 함량이 높은 계통으로 판명되었는데, lysine의 함 량에 있어서는 각각 238.95, 264.95, 275.24, 237.95, 263.77, 301.03 및 273.27mg/ 100g으로 광 평옥 모계(324.64mg/100g), 광평옥 부계(351.05mg/g), 광평옥 F1(321.75mg/100g)보다 낮은 함량을 보 였으며, tryptophan의 경우도 동일한 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 총 단백질의 함량과 lysine과 tryptophan의 함량과는 상관관계가 없 으며 비록 lysine과 tryptophan의 함량이 몇 배 포함되어 있다고 하더라도 미량의 아미노산이기 때문에 영양학적으로 큰 의미가 없다고 사료된다.

    감사의 글

    본 연구는 농림축산식품부, 해양수산부· 농촌진흥 청· 산림청 Golden Seed 프로젝트사업에 의해 이루 어진 것임.

    Figure

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    Representative FT-IR spectra from corn lines. Arrows represent the FT-IR spectral regions showing significant variations between corn lines. 2 and 45 represent the inbred corn lines. Gwangpyeong represent the maternal line of Gwangpyeongok.

    JALS-50-83_F2.gif

    PCA score plot from FT-IR spectra of 44 corn lines. Numbers and capitals represent each corn line. Dotted circles represent the cluster of higher protein content lines(red) and lower protein content lines(blue).

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    PC Loading values from FT-IR spectra of 44 corn lines. Arrows represent the significant spectral regions for determining the PC 1 and 2.

    JALS-50-83_F4.gif

    Cross validation of PLS modeling for total protein contents. Linear regression analysis of predicted values from FT-IR spectra and measured values of total protein contents from 22 corn lines. Regression coefficient was 0.77. Numbers and capitals represent each corn line.

    Table

    Quantitative analysis of total soluble protein from individual corn seed lines by Bradford assays. All samples were run in three replicates. Total protein contents were represented with average ± sd. Capital letters and numbers represent each corn line. GPO1: Gwangpyeongok maternal line, GPO2: Gwangpyeongok paternal line, GPO3: Gwangpyeongok F1

    Quantitative analysis of amino acid from individual corn seed lines by Ninhydrin assays. GPO1: Gwangpyeongok maternal line, GPO2: Gwangpyeongok paternal line, GPO3: Gwangpyeongok F1

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