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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.49 No.5 pp.195-210
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2015.49.5.195

Effects of Tannin-Riching Plant Extracts on Rumen Fermentation, Microbial Growth and Methane Emission

Su Kyoung Lee1, Shin Ja Lee1, Il Dong Lee2, Hyun Sang Kim2, Da Som Oh2, Jun Sik Eom2, Jung Hwa Lim2, Sung Sill Lee1*
1Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea
2Division of Applied Life Science(BK21 program), Gyeongsang National University, Jinju, 52828, Korea

† These authors made an equal contribution to this paper.

Corresponding author : Sung Sill Lee Tel: +82-55-772-1883 Fax: +82-55-772-1889 lss@gnu.ac.kr
April 7, 2015 October 12, 2015 October 14, 2015

Abstract

This study was conducted to investigate effects of tannin-rich plant extracts on In vitro rumen fermentation characteristics, microbial growth and methane emission. The rumen fluid was collected from a cannulated Hanwoo cow fed a 40:60 concentrate:timothy diet. Five plant extracts, selected for their high tannin content, Sawtooth(Quercus acutissima), Chestnut(Castanea crenata), Myrsinaleaf(Quercus salicina), Konara(Quercus serrata) and Daimyo(Quercus dentata) were used in experiment. Plant extracts were obtained from Plant Extract Bank(PEB) at Korea research institute of bioscience and biotechnology. The 15mL of mixture, McDougall’s buffer and rumen fluid in the ratio 2 to 1, was dispensed anaerobically into 50mL serum bottles. The plant extracts were added at the level of 5% against 300mg of timothy as a substrate(v/w). The serum bottles were incubated at 39°C, 120rpm for 3, 6, 9, 12, 24, 48 and 72h with triplicate. The pH value was decreased with the increasing incubation times, and all values were in the normal range for ruminal fermentation. The dry matter digestibility significantly(p<0.05) lower in treatment than in control. Ammonia-NH3, total gas and carbon dioxide emissions were not different significantly(p<0.05) in treatment and control. The methane emissions at 24 h incubation times was significantly(p<0.05) lower in treatments than in control. The rumen microbial growth rate was showed a different pattern depending on treatments, The concentrations of acetic acid and propionic acid was significantly(p<0.05) lower in treatment than in control. Real-Time PCR at 24h incubation times significantly(p<0.05) decreased R. albus, R. flavefaciens and Ciliate associated methanogen in treatment than in control. In conclusion, during ruminal fermentation, the tannin-rich plant extracts were shown to decreased methane emission and without adversely affecting ruminal fermentation. The tannin-rich plant extracts from Sawtooth(Quercus acutissima) was shown to decreased methanogenesis and this is potential candidates to reduce methane emission for ruminants.


탄닌 함유 식물 추출물이 반추위 내 발효와 미생물 성장 및 메탄 발생에 미치는 영향

이 수경1, 이 신자1, 이 일동2, 김 현상2, 오 다솜2, 엄 준식2, 임 정화2, 이 성실1*
1경상대학교 농업생명과학연구원
2경상대학교 응용생명과학부(BK21 program)

초록

본 연구는 탄닌 함유 식물 추출물을 이용하여 In vitro 반추위 발효성상, 미생물 성장 및 메탄생성에 미치는 영향을 알아보고자 수행하였다. 반추위액은 농후사료와 조사료(timothy)를 40:60의 비율로 급 여한 반추위 cannula가 시술된 한우 암소에서 채취하였다. 본 실험에 사용한 식물 추출물은 상수리나 무(Quercus acutissima), 밤나무(Castanea crenata), 참가시나무(Quercus salicina), 졸참나무 (Quercus serrata) 그리고 떡갈나무(Quercus dentata)를 사용하였으며, 식물 추출물은 한국식물추출물 은행에서 분양받아 사용하였다. 반추위액과 McDougall buffer를 1:2의 비율로 혼합한 배양액을 0.3g timothy와 식물 추출물(기질의 5%)이 담긴 50mL serum bottle에 혐기상태로 15mL를 분주하였다. Serum bottle은 39°C, 120rpm으로 3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72시간 동안 배양하였다. 본 실험 결과 배 양 시간이 지날수록 pH는 점점 감소하였으며, 정상범위에 포함되었다. 건물소화율은 대조구에 비해 첨 가구에서 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 암모니아, 총 가스 생산량 및 이산화탄소 발생량은 대조구에 비 해 첨가구에서 유의적(p<0.05)으로 차이가 없었으나, 24시간 메탄 발생량은 대조구에 비해 전 첨가구에 서 유의적(p<0.05)으로 낮았다. 미생물 성장량은 첨가구에 따라 각각 다른 양상을 나타내었고, acetic acid 및 propionic acid는 대조구에 비해 첨가구에서 유의적(p<0.05)으로 낮았다. Real-Time PCR에서 섬유소 박테리아(R. albus, R. flavefaciens) 및 메탄 생성균(Ciliate associated methanogen)은 대조 군에 비해 유의적(p<0.05)으로 감소하였다. 결과적으로 본 실험에 사용한 탄닌 함유 식물 추출물 5종 모두 반추위 발효에 영향을 미치지 않으며, 메탄저감 효과를 나타내었다. 특히 상수리나무에서 반추위 발효성상에 악영향을 미치지 않으며 메탄 발생을 저감하는 식물 추출물로 적합하다고 생각된다.


    Rural Development Administration
    PJ011060

    서론

    탄소 배출량의 증가로 인해 지구 평균 기온이 상 승하는 지구 온난화가 초래 되었다. 이에 따라 온대 기후 지역이 점차 아열대 지역으로 변한다거나 건조 기후가 늘어나는 등 기후대에도 큰 변동이 일어나고 있다. 또한 가뭄, 태풍, 홍수 등과 같은 자연재해 발생률이 빈번해질 뿐만 아니라 그 강도가 점점 강 해지고 있으며, 동물의 개체수가 줄거나 2만 5천여 종의 식물이 멸종되는 등 생태계에도 큰 영향을 미 치고 있다. 이에 따라 전 세계적으로 온실가스배출 거래제 등을 시행하여 온실가스 감축을 의무화 하고 있으며, 정부에서는 저탄소 농업실현 등의 친환경 산업을 육성하기 위해 노력하고 있다.

    온실효과를 일으키는 6대 온실기체에는 이산화탄 소(CO2), 메탄(CH4), 아산화질소(N2O), 수소불화탄 소(HFCs), 과불화탄소(PFCs), 육불화황(SF6) 등이 있다. 이산화탄소의 지구온난화지수를 1로 보았을 때 메탄은 21로, 이산화탄소에 비해 메탄은 21배 높 은 온실가스 효과를 가지고 있으며 반추동물에서 발 생되는 메탄은 연간 81~92만 톤에 이른다고 한다 (IPCC, 2007). 반추동물에서 발생되는 메탄은 사료 에너지와 사료 이용 효율의 감소(Johnson et al., 1991; Ha et al., 2005)로 인해 동물의 생산성 저하 를 일으켜 반추위내 메탄 발생량의 억제가 요구되고 있다.

    많은 연구자들은 온실가스인 메탄을 줄이기 위해 항생제를 투여하였는데, 발효성상에 이상 없이 메탄 이 억제 되었다. 그러나 항생제 내성(Park et al., 2000)과 잔류(Mitsubashi et al., 1961; Smith, 1962; Smith, 1975) 등의 문제로 항생제 사용을 금 지하고 있으며, 우리나라에서도 2011년 7월 1일부터 구충제를 제외한 항생제의 사용이 전면 금지되었다. 이러한 이유로 에센셜 오일(Chaves et al., 2008; Macheboeuf et al., 2008), 탄닌 함유 식물 추출물 (Zeleke et al., 2006; Hariadi & Santoso, 2010), 사포닌 함유 식물 추출물(Hess et al., 2003; Patra et al., 2006), 유기황 화합물 함유 식물 추출물 (Busquet et al., 2005; Kamel et al., 2008) 등 천연 물질을 첨가하여 메탄을 억제하고자 하였다.

    그 중 탄닌은 특유의 떫은 맛 때문에 기호성과 섭 취량이 낮아 항영양인자로 알려져 있으며(Lu & Bennick, 1998), 단백질 및 미량 광물질이 소화율 을 저하시키기도 한다(Ramírez-Restrepo et al., 2006). 그러나 최근 베트남에서 진행된 연구에서 탄 닌은 항기생충제로 사용이 가능하다고 하였으며 (Nguyen et al., 2005), 또 다른 연구에서는 단백 질과 결합하는 탄닌은 장내 필수 아미노산의 흡수량 을 증가시킨다고 하였다(McSweeney et al., 2001, Min et al., 2003). 탄닌을 반추동물에 급여하였을 때 양모 성장, 유 단백질 증가, 번식효율 개선, 고 창증 발병률 감소 등의 효과(Barry & McNabb, 1999)가 있다. 탄닌이 독성을 일으켜 미생물을 사멸 시키는 자세한 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았으나, 섬유소 분해균을 제거하여 수소와 이산화탄소를 감 소시켜 메탄을 줄이는 간접적인 방법과 메탄생성균 을 사멸시켜 메탄을 줄이는 직접적인 방법으로 나눌 수 있다(Tavendale et al., 2005).

    식물에는 다량의 탄닌을 함유하고 있다. 공시 수 종의 탄닌 함량은 건물기준 상수리나무는 10.92%, 졸참나무는 10.86%, 떡갈나무는 9.33%(Lee et al., 1993), 밤잎은 1.98%(Cho & Cho, 2003)으로 알려 져 있다. 본 실험은 탄닌 함유 식물 추출물을 이용 하여 반추위 내 발효와 메탄 발생 저감에 미치는 영 향을 알아보고자 수행되었다.

    재료 및 방법

    1.공시축 및 사양관리

    국립 경상대학교 야생동물보호센터에서 사육중인 반추위 cannula가 장착된 한우(체중 450kg±30kg) 로부터 in vitro 반추위 발효 시험을 위한 시험용 위액을 채취하였다. 공시동물의 사료는 농후사료와 조사료(timothy)를 40:60으로 하여 체중의 2%를 1 일 2회(09:00 및 17:00) 분할 급여하였고, 물과 미 네랄 블록은 자유섭취토록 하였다.

    2.식물 추출물 및 in vitro 시험설계

    공시재료는 65℃ dry oven에서 24시간 건조시킨 timothy를 2mm screen으로 분쇄 한 후 3cm× 3.5cm 크기로 자체 제작한 nylon bag(Ankom Forage bag: R1020)에 넣어 heat sealing한 다음 기질로 사용하였다. AOAC법(2012)으로 분석한 timothy의 화학적 조성은 Table 1과 같다. 본 실험 에 사용한 식물 추출물(Table 2)은 상수리나무, 밤 나무, 참가시나무, 졸참나무 그리고 떡갈나무를 사 용하였다. 식물 추출물은 한국식물추출물은행에서 methyl alcohol 99.9% 로 추출한 것을 분양 받아 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) 1mL에 희석 후 사용하였다. 시험용 위액 준비는 오전 사료 급여 시간 전에 반추 위에 장착된 cannula를 통하여 채취하였고, 4겹의 cheese cloth에 걸러서 O2-free N2가 충진 된 보온 용기에 담아 실험실로 운반하였다. 잔여 사료 입자 를 제거하기 위해 2겹의 cheese cloth로 다시 걸러 낸 반추위액과 McDougall’s buffer(Table 3)를 1:2 의 비율로 혼합한 배양액을 0.3g timothy와 식물 추출물(기질의 5% v/w)이 담긴 50mL serum bottle에 혐기상태(O2-free N2)로 15mL를 분주하 고, butyl rubber stopper와 aluminum cap으로 밀 봉하였다. 각 처리구별 배양은 39℃의 shaking incubator(Jeio Tech, SI-900R, Daejeon, Korea; 120rpm)에서 시간대별(3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72h)로 3반복으로 수행하였다.

    3.조사 항목 및 조사 방법

    3.1.pH

    가스 발생량 측정 및 가스분석을 위해 포집을 한 후, Weaton decapper(Weaton Co., USA)를 이용 하여 serum bottle의 aluminum cap 및 butyl rubber를 제거하고 배양액의 pH를 pH meter(Mettler Toledo, MP230, Columbus, Ohio, USA)를 이용하여 측정하였다.

    3.2.건물 소화율

    배양 상등액 채취 후 nylon bag을 수거하여 물 을 채운 수조에 넣고 Heidolphs Rotamax 120 (Heidolph Instrument, Germany)를 이용하여 100rpm으로 30분씩 2회 씻은 후 65℃의 dry oven(Jeio tech, Daejeon, Korea)에서 약 24시간 건조시켜 건물 잔량을 측정하였다. 건물 소화율은 투입한 기질량과의 차이를 구하고 이 차이를 투입한 기질량의 백분율로 환산하여 구하였다.

    3.3.미생물 성장량

    pH 측정 후, 배양액을 1.5mL E-tube에 채취하 여 사료입자를 제거하기 위해 3,000rpm에서 3분간 원심분리 하였다. 상등액을 취하여 14,000rpm에서 3분간 재 원심 분리하여 미생물 pellet을 침전시킨 후, 상등액은 제거하고 pellet에 sodium phosphate buffer(pH 6.5)를 1mL 첨가하여 vortex로 교반시 키는 세척 과정을 3회 반복 후 spectrophotometer (BIO-RAD, Model 680, California, USA)를 이용 하여 550nm에서 O.D.(Optical density) 값을 구하 여 미생물 성장량을 측정하였다.

    3.4.암모니아

    Chaney & Marbach(1962)의 방법에 따라 phenol color reagent와 alkali-hypochlorite reagent로 배양액의 암모니아를 발색한 후 spectrophotometer (BIO-RAD, Model 680, California, USA)를 이용 하여 630nm에서 O.D.(Optical density) 값을 구하 여 측정하였다.

    3.5.VFA

    배양액을 1.5mL E-tube에 채취하여 3,000rpm 에서 3분간 원심 분리하여 사료입자를 제거하고, 상등액을 0.20㎛ syringe filter로 여과 후 HPLC (High Performance Liquid Chromatography, Agilent-1200, Germany)를 이용하여 분석하였다. 시료의 주입량은 20㎕였고, 이동상 용액은 0.0085N H2SO4을 사용하였으며, 유속은 0.6mL/min 이었다. Column은 300mm×7.8mm I.d. MetaCarb 87H (Varian, Palo Alto, San Francisco, USA)를 사용 하였으며, 온도는 35℃에서 사용하였다.

    3.6.총 가스, 이산화탄소 및 메탄 발생량

    Serum bottle을 shaking incubator에서 꺼낸 후, Theodorou et al.(1994)의 방법으로 serum bottle 의 head space에 있는 가스 발생량을 detachable pressure transducer 및 digital read-out voltmeter (Laurel Electronics, Inc., CA, USA)를 사용하여 측정하였고, 9mL 진공시험관(Vaccutainer)에 가스 를 포집하여 GC(HP 5890 Gas Chromatography, Wilmington, Delaware, USA)를 사용하여 가스 내 메탄 함량 및 이산화탄소 함량을 측정하였다.

    3.7.Real-Time PCR

    반추위 혼합 미생물의 in vitro 발효에 있어서 배양액 중 섬유소 박테리아 및 Methanogen의 수 는 발효 24시간의 Serum bottle으로부터 발효액 1mL를 E-tube에 취하고, 3,000rpm에서 3분간 원심 분리하여 사료 입자를 제거한 뒤, Soil Kit (Macherey-nagel, Germany)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 그 후 1㎕를 취하여 Nano-drop (Thermo scientific, Wilmington, Delaware USA)으로 DNA 농도를 측정하였고, 10ng/㎕로 보정하여 시험에 사용하였다. 사용한 Primer는 Table 4와 같으며 사용 전 FW, RV를 각각 10㎕와 증류수 180㎕을 섞어 10pmol로 희석하여 사용하였 다. Nano-drop(Thermo scientific, Wilmington, Delaware USA)으로 DNA 농도 측정 후, 10ng/㎕ 로 보정한 값과 증류수를 합쳐 9㎕ 분주하였으며, Primer 1㎕와 SYBR Green(Code: QPK-201, Toyobo Co., LTD., Japan) 10㎕를 섞어 Pre-Mixture로 만들어 11㎕ 분주하여 총 20㎕가 되게 하였다. Real-Time PCR(CFX96TM Real-Time system, BIO-RAD, California USA)을 수행하기 위 한 Primer 조건은 Table 5와 같다. Total bacteria를 reference gene으로 섬유소 박테테리아(Ruminococcus albus, Ruminocuccus flavfaciens )와 Ciliate associated methanogen 의 발현율을 측정하였고, 무첨가구인 control을 1로 보고 다른 첨가구를 상 대정량하였다.

    4.통계처리

    통계처리는 SAS package program(1996)의 General Linear Model(GLM) procedure에 따라 처리하였으며, 각 처리구간의 유의성 검증을 위해 분산분석을 실시 후, Duncan’s multiple range test(Duncan, 1955)로 5% 수준에서 유의성을 검정 하였다(p<0.05).

    결과 및 고찰

    1.pH 변화

    탄닌 함유 식물 추출물을 처리한 in vitro 실험에 서 발효시간대에 따른 pH 변화는 Table 6과 같다. 발효 시간이 지날수록 pH는 점점 낮아지고 있으며, 7.36~6.14로 in vitro 적정 pH인 5.0~7.8의 범위 를 유지하고 있다. 대체로 대조구에 비해 첨가구에 서 pH가 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났는데, 이 는 한국재래산양의 반추위 배양액과 condensed tannin을 첨가하였을 때, 탄닌 함량이 많을수록 pH 가 증가한다는 Choi et al.(1999)의 연구결과와 유사 하였다. Makkar & Becker(1996)Streptococcus bovisPrevotella ruminicola와 같이 pH 5~6에 서 성장할 수 있는 몇몇 종을 제외하고 대부분 반추 위 박테리아는 pH 6에서 정상적인 활성을 나타었 다. 특히 섬유소 박테리아는 pH 6 이하에서는 활성 을 나타나지 않는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서 최저 pH 6.14는 반추위 미생물의 생장에 부정적인 영향을 미치지 않을 것으로 판단된다.

    2.건물 소화율

    탄닌 함유 식물 추출물을 처리한 in vitro 실험에 서 발효시간대에 따른 건물 소화율은 Table 7과 같 다. 건물 소화율은 21.50~48.21 범위로 시간이 지 날수록 소화율은 증가하고 있는 추세이다. 발효 6시 간, 12시간 및 72시간은 대조구와 비교하여 유의적 (p<0.05)인 차이가 없었다. 전 발효시간을 보면 대 체로 상수리나무가 대조구보다 유의적(p<0.05)으로 높았고, 떡갈나무는 대조구와 유의적(p<0.05) 차이 가 없으며 나머지 첨가구는 대조구보다 유의적 (p<0.05)으로 낮았다. Choi et al.(1999)의 연구에 서 축합형 탄닌의 첨가수준이 증가할수록 비례적으 로 건물 소화율이 저하한다고 보고하였다. 또한, Lee et al.(1996)의 연구에서 평균 체중 9.9kg 산양 에게 37.6mg의 탄닌을 함유한 싸리나무 추출물 50%와 54.4mg의 탄닌을 함유한 갈참나무 잎 50% 를 각각 Grass와 50%씩 섞어 급여했을 때 탄닌 함 량이 높은 갈참나무 잎에서 싸리나무보다 건물 소화 율(58.3 vs 61.8)이 유의적(p<0.05)으로 낮았다고 보고하였다. 본 실험에서 사용한 식물 추출물에 함 유된 탄닌의 구조와 함량이 다르기 때문에 소화율에 서 차이가 나며, 탄닌을 함유한 식물 추출물을 첨가 하면 건물 소화율이 감소하는 것으로 사료된다.

    3.미생물 성장량

    탄닌 함유 식물 추출물을 처리한 in vitro 실험에 서 발효시간대에 따른 미생물 성장량에 관한 결과는 Table 8과 같다. 미생물 성장량은 성장곡선을 그리 고 있다. 3시간, 6시간 사이에 거의 증가하지 않는 데, 이를 유도기라고 하며 새로운 환경에 적응하는 시기로 세포 수는 그대로이나, 세포의 크기만 비대 해지는 시기이다. 그 이후 9시간, 24시간 및 48시간 에 미생물이 단위 시간당 배로 증가하는 시기인 대 수생장기로, 이분법으로 분열하는 반추위 박테리아 가 기하급수적으로 증가하는 시기이며, 48시간은 영 양소가 고갈되거나 미생물 생장에서 발생하는 노폐 물로 인해 생장을 저해는 정지기이다. 72시간은 48 시간에 비해 미생물 수가 감소하였는데, 이는 사멸 기로 사멸 세포가 증가하고 세포구조가 파괴되거나 효소 단백질의 변성 또는 세포내 에너지 물질의 고 갈되며 세포사멸과 함께 용균(lysis)이 일어나 세포 수와 세균수가 감소하나 흡광도는 일정하게 유지 될 수도 있다(Ha et al., 2005).

    탄닌에 관한 연구는 아직 확실하지 않으나, 탄닌 은 항균작용을 하는 화합물로 반추위내 미생물을 억 제하며 특히 그람 양성균의 세포벽에 독성으로 작용 한다(Jones et al., 1994; Bodas et al., 2012). 또 한 살균과 정균을 통하여, 미생물 단백질이나 효소 등이 탄닌과 결합하여 반추위 메탄 생성균의 성장과 활력을 감소시킨다(Tavendale et al., 2005; Liu et al., 2011; Tan et al., 2011). 본 실험에서 탄닌 함 유 식물 추출물은 12시간 24시간에 대조구와 유의 적(p<0.05)으로 차이가 있으나 대체로 대조구와 유 의적(p<0.05)인 차이가 없었다.

    4.암모니아

    탄닌 함유 식물 추출물을 처리한 in vitro 실험에 서 발효시간대에 따른 암모니아 변화에 대한 결과는 Table 9와 같다. 암모니아는 시간이 지날수록 증가 하고 있으며, 전 시간대는 대체로 대조구와 비교하 여 유의적(p<0.05)인 차이가 없었으나, 72시간 밤나 무에서 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮게 나 타났다. 반추위 암모니아 농도는 사료 중 반추위에 서 분해 가능한 단백질의 함량과 분해속도에 따라 달라질 수 있으며, 본 실험에서 기질을 timothy만 사용하였기 때문에 단백질의 반추위 분해 특성 차이 가 없었다.

    단백질 분해 패턴 또는 미생물에 의한 미생물태 단백질로 합성되는 패턴과 암모니아 농도를 관련지 어 살펴보면 사료내에 함유되어 있는 사료 단백질의 실제 이용 정도를 이해할 수 있다(Broderick & Kang, 1980). 사료 내 탄닌은 소장에 아미노산 유입 량과 흡수량이 증가(Jones & Mangan, 1977; Egan & Ulyatt, 1980; Waghorn et al., 1986)하며, 탄닌 에 다량 붙어 있는 수산화기와 NH2, SH, OH 그리 고 단백질의 COO-가 결합함(Siebert et al., 1996) 으로서 단백질 소화율이 줄어든다고 보고하였다. 그 러나 몇몇 연구자들은 제 4위는 pH가 낮기 때문에 (Jones & Mangan, 1977) 탄닌에 의한 단백질 소화 율에 영향을 미치지 않는다고 하였다. 일반적으로 반 추가축용 사료에는 단백질 수준이 최소 6% 이상이어 야 한다. 또한 최적 암모니아 농도는 8mg/100mL로 (Hoover, 1986), 140mg/100mL 이상일 경우에는 반 추위 미생물의 성장을 억제할 수 있다(McAllan et al., 1987). 본 실험에서 발효 24시간까지 미생물이 성장하 기에 최적 농도는 아니었으며, 48시간 이후에 미생물 의 성장이 억제될 만큼은 아니었다.

    5.VFA 분석

    탄닌 함유 식물 추출물을 처리한 in vitro 실험에 서 발효시간대에 따른 acetate(A), propionate(P), A/P 비율에 대한 결과는 Table 10과 같다. Acetate 는 대체로 대조군와 유의적(p<0.05)인 차이가 없었 으나 24시간, 48시간에서 밤나무 추출물 처리구(각 각 52.46mM, 54.76mM)와 졸참나무 추출물(각각 53.29mM, 56.17mM)에서 대조구(각각 56.80mM, 61.81mM)에 비해 유의적(p<0.05)으로 낮았다. Propionate도 대체로 유의적(p<0.05)인 차이가 없 었으나 9시간 상수리나무 추출물 처리구(15.66mM) 에서 대조구(13.96mM)에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았으며, 24시간 상수리나무 추출물 처리구 (25.08mM), 참가시나무 추출물 처리구(23.23mM), 떡갈나무 추출물 처리구(21.14mM)가 대조구(16.25mM) 에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았다. 만약 propionate 가 수소 싱크로 사용되었다면 메탄 발생량은 줄어들 었을 것이라 예상한다. 생성된 VFA의 생성량과 생 성비율을 비교 평가하는 지표인 A/P 비율은 발효 12시간과 48시간은 대조구와 비교하여 유의적 (p<0.05)으로 높았으나 24시간은 대조구에 비해 전 첨가구가 유의적(p<0.05)으로 낮았다. Carulla et al.(2005)에 의하면 72.5%의 탄닌을 함유한 Acacia mearnsii 추출물을 산양에게 급여하였을 때 발효 성상에는 영향을 미치지 않으나 A/P 비율은 감소하 였다는 연구결과와 본 실험의 24시간 결과와 비슷하 였다.

    6.총 가스, 이산화탄소 및 메탄 발생량

    탄닌 함유 식물 추출물을 처리한 in vitro 실험에 서 발효시간대에 따른 총 가스, 이산화탄소 및 메탄 발생량에 대한 결과는 Table 11과 같다. 시간이 지 날수록 총 가스량은 증가하고 있으며 이는 발효가 진행되고 있음을 의미한다. 대체로 대조구와 비교하 였을 때 유의적(p<0.05)인 차이가 없었으나 6시간, 9시간에서 첨가구간 비교하였을 때는 유의적 (p<0.05)인 차이가 있었다. 메탄발생량을 보면, 발 효 3시간, 9시간, 12시간, 72시간에는 대조구와 비 교하였을 때 유의적(p<0.05)인 차이가 없었다. 6시 간 상수리나무와 참가시나무 추출물 처리구에서 낮 았고, 24시간 대조구에 비해 전 첨가구에서 메탄 발 생량이 유의적(p<0.05)으로 감소하였다. 이는 총 가 스 발생량과 이산화탄소 발생량에 유의적(p<0.05)인 차이가 없는 것으로 보아 탄닌에 의한 효과라고 예 상할 수 있다. 그러나 48시간에서 참가시나무와 떡 갈나무 추출물 처리구에서 증가하였는데, 이는 총 가스 발생량이 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았기 때문이다.

    Simith et al.(2005)에 의하면 반추위 미생물은 탄닌의 독성을 해독할 수 있다고 하였으며, Tavendale et al.(2005)에 의하면 탄닌은 섬유소 분해율을 감 소시켜 메탄생성박테리아의 수소 이용성을 저해함으 로서 메탄을 간접적으로 줄인다고 보고하였다. Quebracho 탄닌은 메탄 억제에 효과적이며, Bhatta et al.(2009)은 Quebracho 탄닌이 투여량이 증가함 에 따라 13~45% 메탄을 억제한다고 하였다. Min et al.(2005)은 75%의 CT를 포함하는 Quebracho 탄닌은 in vitro상에서 12.3~32.6%의 메탄을 감소 시켰다고 보고하였다. 그러나 Min et al.(2005)Bhatta et al.(2009)의 같은 실험에서도 탄닌의 첨 가량과 종류 그리고 원천에 따라 메탄 억제 효과가 다르기 때문에 더 많은 연구가 필요하다. 본 연구에 서 탄닌을 함유한 식물 추출물은 총 가스와 이산화 탄소 발생량에는 유의적(p<0.05)인 차이가 없으나 24시간 메탄 발생은 대조구에 비해 유의적(p<0.05) 으로 줄었다.

    7.Real-Time PCR

    탄닌 함유 식물 추출물을 처리한 in vitro 실험에 서 24시간 발효시간대에 따른 미생물 군집 변화를 확인하기 위해 Real-Time PCR을 수행하였고, 결과 는 Fig 1과 같다. R. albusR. falvefaciens는 첨 가구에 유의적(p<0.05)으로 감소하였고, 특히 R. albus에서 졸참나무에서 대조구에 비해 유의적 (p<0.05)으로 가장 많이 감소하였는데, 이는 24시간 건물 소화율이 유의적(p<0.05)으로 낮은 결과와 유 사하였다. 발효 24시간에 총 가스와 이산화탄소 발 생량이 대조구와 유의적(p<0.05)인 차이가 없으나 메탄이 줄어든 것은, 섬유소 박테리아가 감소하여 수소 발생이 적었음이라 생각되며 메탄생성박테리아 또한 대조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 줄어 발생 한 결과라 생각한다. 저분자 탄닌은 고분자 탄닌에 비해 메탄생성박테리아와 같은 미생물을 더 효율적 으로 억제하는데, 이는 저분자 탄닌은 미생물 효소 와 강력하게 결합할 수 있기 때문이며, 고분자 탄닌 은 박테리아의 단백질에 침투할 수 없어 메탄생성균 에 적은 독성을 일으키기 때문이다(Field et al., 1989). 그러므로 메탄생성박테리아는 탄닌의 화학적 구성과 메탄생성박테리아의 종류에 따라 달라질 수 있다. 탄닌은 사포닌과 비교하여 항프로토조아 작용 에 대한 뚜렷한 결과를 나타내지는 않는데, Animut et al.(2008)은 염소에 L. striata만 급여하였을 때 프로토조아가 감소되었다고 보고하였다. 그러나 염 소는 다른 반추동물들과 달리 탄닌과 같은 항영양인 자에 적은 영향을 받기 때문에(Foley et al., 1999) 다른 반추가축에게도 효과가 있는지에 대한 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 탄닌을 함유한 식 물 추출물을 첨가하였을 때, 섬유소 박테리아와 메 탄생성균의 발현율이 억제된 것으로 보아 탄닌은 항 미생물로서 역할을 수행하고 있다 생각한다.

    Figure

    JALS-49-195_F1.gif

    Relative quantification analysis of rumen microorganism population at 24h of in vitro ruminal fermentation by the addition of different plant extracts. abcMeans with different superscripts significantly(p<0.05) differ.

    Table

    Chemical compositions of experimental feedstuff used as a substrate for the in vitro incubation

    The general information regarding of tannin-rich plant extracts used in the experimenta

    aPlant extracts were obtained from Plant Extract Bank(PEB) at Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
    bNature of solvent used for extraction: Methyl alcohol 99.9% for HPLC.

    The chemical composition of McDougall’s buffer

    aCaCl2 4g/100ml distilled water

    The PCR primers for Real-Time PCR assay

    aForward primer
    bReverse primer

    The PCR primers condition for Real-Time PCR assay

    Effects of tannin-riching plant extracts on the pH value in time-dependent fermentation

    abcMeans with different superscripts in the same column differ significantly(p<0.05).

    Effects of tannin-riching plant extracts on in vitro dry matter digestibility of substrate(%)

    abcMeans with different superscripts in the same column differ significantly(p<0.05).

    Effects of tannin-riching plant extracts on the growth rate of ruminal microbes in time-dependent fermentation(O.D. at 550nm)

    abcMeans with different superscripts in the same column differ significantly(p<0.05).

    Effects of tannin-riching plant extracts on rumen NH3-N concentration in time-dependent fermentation(mg/100mL)

    abMeans with different superscripts in the same column differ significantly(p<0.05).

    Effects of tannin-riching plant extracts on VFA concentration in time-dependent fermentation(mM/g)

    abcdMeans with different superscripts in the same column differ significantly(p<0.05).

    Effects of tannin-riching plant extracts on total gas production, methane emission and carbon dioxide emission from the time-dependent fermentation(mL/gDM)

    abcMeans with different superscripts in the same column differ significantly(p<0.05).

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