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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.49 No.2 pp.83-95
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2015.49.2.83

Antioxidant activity and PC12 cell protective effect of onion flesh and peel(Allium cepa L.) fraction on oxidative stress

Seon-Kyeong Park1,2, Dong-Eun Jin1, Chang-Hyeon Park1,2, Tae-Wan Seung1,2, Tian-Jiao Guoa1,2, Sung-Gil Choi1,2, Ho Jin Heo1,2*
1Division of Applied Life Science(BK21 plus), Gyeongsang National University, Jinju, Korea

2Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, Korea
Corresponding author: Ho Jin Heo Tel: +82-55-772-1907 Fax: +82-55-772-1909 hjher@gnu.ac.kr
March 6, 2015 April 10, 2015 April 16, 2015

Abstract

To examine physiological effects of onion flesh (OF) and peel (OP), the antioxidant activities and neuroprotective effects against H2O2-induced oxidative stress were evaluated in this study. The both ethyl acetate fractions of OF (EOF) and OP (EOP) extracts had the highest in vitro antioxidant activities than others in ABTS, DPPH radical scavenging activity, and MDA inhibitory effect. The cellular oxidative stress and neuroprotective effects were sequentially evaluated by DCF-DA assay, MTT assay, and LDH assay. Above results showed that EOP was better than EOF at lower concentration. Finally, we quantitatively analyzed quercetin (Q), and quercetin glycosides (Q-G) in the EOF and EOP by gas chromathography/mass (GC/MS). Q and Q-G contents are in the EOF (4.83, and 8.70 mg/100 g dry weight, respectively) and in the EOF (91.80, and 61.81 mg/100 g dry weight, respectively). Consequently, we suggest that onion with biologically active substances such as not only OP but also OF were efficacious in degenerative nervous system diseases by antioxidant activity and neuronal cell protective effect.


양파(Allium cepa L.) 과육과 과피 분획물의 항산화 효과 및 산화적 스트레스에 대한 PC12 cell 보호 효과

박 선경1,2, 진 동은1, 박 창현1,2, 승 태완1,2, 궈 텐자오1,2, 최 성길1,2, 허 호진1,2*
1경상대학교 응용생명과학부(BK21 plus)
2경상대학교 농업생명과학연구원

초록

양파 과육과 과피의 생리학적 효과를 평가하기 위하여, in vitro 항산화 활성과 H2O2로 유도된 산화적 스트레스에 대한 PC12 세포보호 효과를 확인하였다. 그 결과, 양파의 과육과 과피 모두 EtOAc 분획물에서 가장 높은 ABTS, DPPH 라디칼 소거활성과 MDA 저해활성을 나타냈다. 양파의 과육과 과피의 EtOAc 분획물을 이용하여, H2O2로 산화적 스트레스를 유발한 PC12세포에서의 ROS 함량과 세포보호효과를 DCF-DA assay, MTT assay 및 LDH assay를 통하여 확인한 결과, 과피가 과육 대비 약 10배 낮은 농도에서 비슷한 보호효과를 나타내었다. 최종적으로 GC-MS를 이용하여 주요 페놀성 화합물인 quercetin 함량과 quercetin 배당체 함량을 분석한 결과, 양파 과육(각각, 4.83, 8.70mg/100 g dry weight)과 과피(91.80, 61.81mg/100g dry weight, respectively) 함량을 나타내었다. 이러한 결과들을 종합해볼 때, 양파 과피뿐만 아니라 과육이 나타내는 항산화 효과 및 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보호효과는 퇴행성 신경질환과 같은 질병에서 효과적인 소재일 것이라고 사료된다.


    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs
    113023-3
    KRF-2011-0021664

    Ⅰ서론

    산소는 호기성 생물들의 호흡에 이용되어 에너지 를 획득하는 과정을 거치게 됨으로써 생명유지에 절 대적으로 필요한 원소이다(Fridovich, 1986). 하지 만, 인체 내의 대사과정에서 생성되는 superoxide anion(O2-), hydrogen peroxide(H2O2), singletoxygen (1O2), hydroxyl radical(·OH), peroxyl radical(ROO·) 과 같은 reactive oxygen species(ROS)의 생성은 세포나 세포 소기관에 손상을 초래할 뿐만 아니라 생체 내 단백질의 기능 저하를 초래함으로써 각종 질환의 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2012). 실제 발생되는 인체 내 질환 중에 90% 가 활성산소와 관련이 있다고 알려져 있으며, ROS 및 reactive nitrogen species(RNS)와 같은 유리기 의 과도한 생성은 생체 내 항산화 방어 시스템과 유 리기 생성계의 불균형을 유발하여 DNA, RNA, enzymes, 단백질 및 지질 등의 산화를 증가시킴으 로써 세포의 기능장애 및 세포막 유동성의 붕괴를 초래하여 necrosis(apoptosis)를 일으키게 되고 세 포의 항상성 상실을 일으켜 노화를 비롯하여 암, 동 맥경화증, 당뇨병 등 많은 질환들을 초래하는 것으 로 알려져 있다. 특히 구조적 특성상 불포화 지방산 및 구성 지방산의 함유량이 상대적으로 높은 신경세 포는 산화적 스트레스에 매우 취약하며, 특히 뇌 신 경세포의 사멸을 촉발함으로써 알츠하이머병, 파킨 슨병 및 뇌졸중과 같은 퇴행성 뇌신경 질환이 유발 되는 것으로 보고되고 있다 (Heo et al., 2004; Zhao, 2009; Bidchol et al., 2011).

    식물 내의 페놀성 화합물은 천연 항산화 물질로 알려져 있으며, shikimate 경로와 phenylpropanoid 대사 경로로부터 생성되는 이차대사산물로써 –OH group이 한 개 또는 그 이상 치환된 방향족성 물질 로 알려져 있다(Proestos et al., 2006). 이러한 페 놀성 화합물은 산화와 관련된 매우 다양한 유해산소 소거활성 효과 및 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 내재하고 있는 것으로 알려져 있다 (Kwon et al., 2006). 그렇기 때문에 생물학적 안 전성이 입증된 식품 자원을 포함한 천연 생물자원으 로부터 보다 안전하고 생리학적 효과가 뛰어난 페놀 성 화합물을 이용하여, 퇴행성 뇌신경 질환 등을 포 함한 다양한 질환의 예방 및 개선 효과에 대한 적극 적인 연구의 필요성이 대두되고 있는 실정이다.

    양파(Allum cepa L.)는 우리 식생활에서 널리 활 용되고 있는 식재료 중의 하나이지만, 고대 중국, 인도, 이집트에서는 암, 결핵, 치통뿐만 아니라 곤 충이나 뱀의 해독제, 정력제 등 매우 다양한 용도로 널리 이용되어 왔다(Jang & Lim, 2009). 최근 연 구로는 항산화 효과, 심혈관계 질환 예방, 혈전증 치료효과, 혈당저하 효과 및 납 독성의 해독에 효과 가 있는 것으로 알려져 있다(Kang et al., 1998). 양파의 주요 성분인 allyl propyl disulfide 및 dially disulfide와 같은 유기 황 함유 화합물은 체 내 지방 수준 저하에 효과적인 것으로 알려져 있으 며, quercetin, isorhamnetin, kaempferol, rutin 등의 flavonoids는 뛰어난 항산화 작용을 가지고 있 는 것으로 알려져 있다(Jang & Lim, 2009). 그렇 기 때문에 다양한 생리학적 효능을 갖는 고부가가치 유효 물질을 함유하고 있는 천연 식품 소재에 대한 연구는 건강기능식품 등으로서의 활용 가능성 측면 에서도 그 의미가 크다고 할 수 있다. 따라서 본 연 구에서는 양파(Allum cepa L.)의 불가식부인 과피 뿐만 아니라 과육의 in vitro 항산화 활성과 H2O2로 유도된 산화적 스트레스에 의해 손상된 PC12 신경 세포에 대한 보호효과를 비교·연구하여 고부가가치 식품 산업 소재로서의 잠재적인 가치를 알아보고자 하였다.

    Ⅱ재료 및 방법

    2.1.재료

    본 실험에 사용된 양파는 경상남도 창녕군에서 2013년 6월 수확된 양파(Allium cepa L.)를 구입하 여 사용하였으며, 과육과 과피로 분리하여 동결건조 기(IlShin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea)를 이용 하여 건조한 후, 분쇄하여 냉장보관(4℃) 하면서 사 용하였다. 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline- 6-sulfonic-acid)(ABTS),1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl( DPPH), potassium ferricyanide, trichloroacetic acid, 2',7'-dichloro-fluorescein diacetate(DCF-DA), H2O2, 3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyltetra-zoliumbromide (MTT) assay kit lactate dehydrogenase(LDH) assay kit은 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였다. PC12 신 경세포 배양을 위해 필요한 RPMI 1640 배지와 fetal bovine serum(FBS)은 Gibco BRL Co.(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, penicillin, streptomycin, sodium bicarbonate 와 HEPES 및 나머지 시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co. 제품을 구입하여 사용하였다.

    2.2.추출물의 제조

    동결건조 시킨 양파 과육과 과피를 각각 50 volumes의 70% ethanol을 첨가하여 환류 냉각 하 에 2시간 동안 추출하였으며, 이 추출액을 No. 2 여과지(Whatman plc, Kent, UK)로 여과하여 진공 농축기(N-N series, EYELA Co., Tokyo, Japan) 로 농축하였다. 그 후 이 추출물을 극성 차이를 이 용하여 분획하였다. 분획방법은 ethanol 추출물에 n-hexane과 증류수를 1:1 비율로 분획 깔때기에 넣 고 n-hexane 층과 증류수 층을 분획한 후, 증류수 층을 다시 chloroform과 1:1 비율로 분획깔때기에 넣고 chloroform과 증류수 층을 분획하였다. 위 과 정과 동일하게 ethyl acetate(EtOAc), butanol을 증류수 층과 분획을 실시한 후 농축하여 동결건조 (IlShin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea)하였고, 그 후 -20℃에서 보관하면서 각 실험에 사용하였다. 양 파 과육의 n-hexane, chloroform, EtOAc, butanol 및 증류수 분획물의 추출 수율(extraction yield)은 0.48%, 1.49%, 0.93%, 5.13% 및 58.00%로 나타났 으며, 양파 과피는 0.15%, 0.09%, 1.18%, 0.21% 및 0.26%로 나타났다.

    2.3.라디칼 소거 활성

    ABTS 라디칼 소거활성은 1.0 mM AAPH (2,2'- azobis-(2-amidinopropane)-HCl)와 2.5 mM ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfoni c acid)-diammonium salt)를 150 mM NaCl이 더 해진 100 mM phosphate buffer(pH 7.4)와 함께 혼합하여 68℃ water bath에서 30분 동안 열을 가 하고 실온에서 10분 동안 식혔다. ABTS 용액은 734 nm에서 흡광도(optical density, O.D.) 값이 0.650 ± 0.030이 나오도록 buffer로 희석시켜 사 용 하였다. 시료용액 20 μL에 흡광도 값을 맞춘 ABTS 용액 980 μL를 vortex mixer로 균일하게 혼 합한 후, 37℃에서 10분 반응시켜 734 nm에서 UV-spectrophotometer(UV-1201, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다(Kwak et al., 2010). Positive control로 사용한 vitamin C 는 과일과 채소에 많이 함유되어 있으며, 이를 기 준물질로써 나타내어 시료 간 항산화력을 비교하는 것은 우 편리한 방법으로 사용된다(Yoon et al., 2012).

    DPPH 라디칼 소거활성은 0.1 mM DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 80% methanol에 용 해시킨 후, 517 nm에서 흡광도 값이 1.000 ± 0.020이 나오도록 80% methanol에 희석시켜 사용 하였다. 시료용액 0.1 mL에 흡광도 값을 맞춘 DPPH 용액 2.9 mL를 가한 후 vortex mixer로 균 일하게 혼합한 다음 실온에서 30분 방치한 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Kim et al., 2002).

    2.4.지질 과산화물(malondialdehyde, MDA) 생성 억제효과

    지질 과산화물 생성 억제효과는 뇌 조직을 이용하 여 Chang et al.(2001)의 방법을 변형하여 사용하 였다. 4주령의 ICR-male mouse를 실험동물 공급 업체(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입 후, 항온 (22±2℃), 항습(50-55%)을 일정하게 유지하며 12 시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 환경에서 사육 하였다(경상대학교 동물실험인가번호 GNU-131105- M0067). 상기 환경에서 4주간 사육한 ICR mouse brain을 적출하여 실험에 사용하였다. 적출한 뇌 조 직은 10 volumes의 ice cold Tris-HCl buffer (20mM, pH7.4)에 균질화 시켜 원심분리(6,000×g, 10분) 하였다. 상등액 0.1 mL에 10 μM FeSO4 0.1 mL, 0.1 mM ascorbic acid 0.1 mL및 시료 0.2 mL를 혼합하여 37℃에서 1 시간동안 배양하였다. 배양 후 30% trichloroacetic acid 0.1 mL 와 1% thiobarbituric acid 0.3 mL를 첨가하여 80℃에서 20 분 가열한 후, 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    2.5.신경세포 배양 및 세포 내 산화적 스트레스 생성 억제효과

    본 실험에서 사용한 PC12 세포(KCLB 21721, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 신경세포의 특성을 나타내는 세포로써 rat의 pheochromocytoma 에서 유도된 것을 이용하여 실험을 진행하였다. PC12세포를 25 mM HEPES, 25 mM sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum, 50 units/ mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin을 포함 하는 RPMI 1640배지에 접종하여 37℃, 5% CO2조 건에서 배양하였다.

    세포 내 산화적 스트레스 생성량을 측정 하는 방 법으로써 DCF-DA(2‘7’- dichlorodihydro-fluorescein diacetate) assay를 이용하였다. 산화적 스트레스에 의해 세포 내에서 생성된 ROS는 비 형광성을 나타 내는 DCF-DA를 산화시켜 형광물질인 DCF로 전환 시키는데 이렇게 전환된 형광물질의 양을 측정함으 로써 세포 내 형성된 ROS를 측정하는 방법이다. 실 험 방법은 세포 105-106cell/mL에 시료 40 μL를 48 시간 동안 pre-incubation 한 후에, 200 μM H2O2 를 3시간 동안 처리하였고, 다음 10 μM DCF-DA를 넣어 50분 동안 배양하였다. 배양 후, 모든 용액을 제거하였고, PBS 100 μL를 첨가하여 최종적으로 fluorescence microplate reader(Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA)를 사용하여 485 nm(excitation wave)와 535 nm(emission wave)에 서 fluorescence level을 측정하였다(Kim et al., 2010).

    2.6.신경세포 생존율 및 세포막 손상 억제효과

    PC12 세포에 대한 신경세포 생존율은 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) reduction assay를 이용하였다. MTT reduction assay는 mitochondrial dehydrogenase에 의해 노란색의 수용성 기질을 청자색을 띄는 비 수 용성의 MTT formazan으로 환원시키는 mitochondria 의 활성을 이용하는 측정 방법이다(Kim et al., 2005). 실험 방법은 시료 30 μL를 PC12 cell에 4 시간 동안 pre-incubation한 후, 200 μM H2O2를 3 시간 동안 처리하였다. H2O2처리 3시간 후, MTT stock solution을 처리하여 37℃에서 3시간 incubation 후, DMSO 100 μL를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 최종적으로 microplate reader(680, Bio-Rad, Tokyo, Japan)를 이용하여 570 nm (determination)와 690 nm(reference wave)에서 측정하였다. Positive control은 vitamin C(200 μ M)를 사용하였고, 세포 생존율은 control에 대한 백 분율 단위로 변환시켜 나타냈다(Heo et al., 2001).

    세포막 손상 억제 효과를 알아보기 위하여, lactate dehydrogenase(LDH) assay를 이용하였다. 시료는 48 시간 동안 pre-incubation한 후, 200 μM H2O2를 처리하여 3시간 배양한 다음, 원심분리(250×g, 4분) 하였다. 원심분리 후, 100 μL의 상등액을 새로운 well로 옮긴 후 LDH assay kit (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 이용하여 세포막 손상효과를 측정 하였다(Heo et al., 2001).

    2.7.GC/MS를 통한 quercetin 및 quercetin glycosides 함량 분석

    Chung et al.(2011)의 연구에 따르면 양파 과육 에 존재하는 주요 페놀성 화합물은 quercertin-4' -glucoside와 quercertin-3,4'-glucoside라고 보고 하였다. 그리고 Suh et al.(1999)의 연구에 따르면 양파 과피에 존재하는 주요 페놀성 화합물은 quercetin과 quercertin-4'-glucoside이며, 이 두 물질을 분리해내어 in vitro 항산화 활성 테스트 결 과는 양파 과피 methanol추출물보다 활성이 증가한 다고 보고하였다. 이러한 연구들을 바탕으로 볼 때, 양파과육과 과피가 나타내는 in vitro 항산화 활성 과 세포 보호효과는 주요 생리활성물질인 quercetin 과 그 배당체 물질이라고 판단되어진다.

    이에 따라 quercetin과 quercertin-4'-glucoside 와 quercertin-3,4'-glucoside 등을 포함하는 quercetin 배당체를 정량 분석하기 위해 GC/MS (Agilent 7890N coupled with Agilent 5975C mass spectrometer, Santa Clara, CA, USA)를 이 용하여 분석을 실시하였다. Column은 HP-5MS(5% Phenyl Methyl Siloxane, 30 m×0.25 mm, thickness 0.25 μm; Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다. 양파의 과육과 과피의 quercetin을 분석하기 위하여, BSTFA(N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide) 와 10% TMCS(trimethylchlorosilane)가 혼합된 TMS 유도체시약을 이용하여 -OH, -COOH, =NH, -NH2및 -H와 같은 활성수소를 silyl group으로 치 환시켜 실험을 실시하였다(Proestos et al., 2006). 방법은 동결 건조된 EtOAc 분획물에 TMS 유도체 시약 1mL을 넣고 70℃ 에서 1 시간동안 반응 시킨 후, N2를 이용하여 건조하였다. 건조물은 methanol 로 회수하여 5 mL이 되도록 정용한 후, 그 중 1 mL을 취하여 0.25 μm membrane filter로 여과하 여 GC/MS 분석에 사용하였다. 또한, quecetin glycosides를 분석하기 위하여 산 가수분해법(Yoon et al., 2012)을 이용하여 비 배당체의 형태로 전환 시킨 후 분석하였다. 동결 건조한 추출물 50 mg을 methanol 5 mL에 녹인 후, 증류수 4.5 mL과 6 N 황산 0.5 mL을 첨가하여 90℃에서 1 시간동안 가열 하여 산 가수분해를 실시하였다. 가수분해물을 냉각 후 N2를 이용하여 건조하여, 위와 동일한 조건으로 TMS 유도체화 하여 실험에 사용하였다.

    2.8통계처리

    모든 실험은 3회 반복 실시하여 mean±SD로 나 타냈었다. 각 평균값에 대한 검증은 SAS version 9.1 software(SAS institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 를 실시하고, Ducan의 다중범위검정법(Duncan's multiple range test)으로 각 시료간의 유의차를 5% 수준에서 검증하였다.

    Ⅲ결과 및 고찰

    3.1.라디칼 소거 활성

    Epinephrine의 산화 및 xanthin oxidase나 glutathione reductase 등과 같은 flavoenzyme에 의해 mitochondria, phagocytes 및 세포질에서는 여러 가지 생물학적 반응에 의하여 자유라디칼이 형 성된다. 전자 공여 작용은 이런 산화성 자유라디칼 에 전자를 공여하여 산화를 억제하는 척도가 되며, 식물체 내의 페놀화합물의 hydroxyl group(-OH)은 자유라디칼에게 수소원자나 전자를 공여하는 강력한 환원력을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Jang & Lim, 2009). 따라서 본 연구에서는 quercetin 및 kampeferol과 같은 풍부한 페놀화합물을 포함하고 있는 양파 과육과 과피(Sultana & Anwar, 2008)의 라디칼 소거활성을 측정하였고, 그 결과를 Fig. 1에 나타내었다.

    ABTS 라디칼 소거활성은 수용성 및 지용성 물질 의 항산화 측정에 모두 적용할 수 있기 때문에 식품 의 항산화 활성을 측정하는데 널리 사용되는 방법 중 하나로써, ABTS 라디칼이 시료의 항산화 물질에 의해 제거되면 특유의 색인 청록색이 탈색되는 점을 이용하였다(Yoo et al., 2007; Kim et al., 2012). 5가지 용매 분획물을 이용하여 ABTS 라디칼 소거활 성을 측정한 결과는 Fig. 1(A, B)와 같다. 양파 과 육과 과피의 용매 분획물 모두 EtOAc 분획물의 ABTS 라디칼 소거활성이 가장 높았으며, 특히 양파 과피의 EtOAc 분획물(Fig. 1B)의 경우 500 μμ g/mL 농도에서 positive control로 사용된 vitamin C 500 μg/mL 농도와 비교하였을 때, 통계적 유의 성을 나타냄으로써 높은 소거활성을 나타내는 것을 확인하였다.

    DPPH는 안정한 라디칼로 cysteine, glutathione 과 같은 함황 아미노산과 ascorbic acid, tocopherol, hydroquinone, pyrogallol, phenylenediamine, aminophenol과 같은 aromatic amine등에 의해서 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 점을 이용하여, 수 소 공여능 및 유리기 소거작용을 측정하는데 널리 이용되고 있는 방법 중 하나이다(Lee & Park, 2005). 양파 과육과 과피의 solvent 분획물을 이용 하여 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 Fig. 1(C, D)와 같다. ABTS 라디칼 소거활성을 측정한 결과와 유사하게 EtOAc 분획물의 라디칼 소거활성 이 상대적으로 우수하게 나타났으며, 양파의 과피에 서의 소거활성이 더욱 증가하는 경향을 확인하였다. 특히, 양파 과피의 EtOAc 분획물(Fig. 1D) 500 μ g/mL(68.88%)에서는 같은 농도인 양파 과육의 EtOAc 분획물(12.91%)에 비해 약 5배의 높은 소거 활성을 나타냈다. Lee et al.(2007)에 따르면, 생 양파와 열처리한 양파 모두 EtOAc 분획물에서 높은 ABTS, DPPH, Hydroxyl, superoxide 라디칼 및 hydrogen peroxide 소거능을 갖는 것으로 보고한 바 있다. 뿐만 아니라, Kim & Kim(2006)은 양파를 skin, outer, middle 및 core의 4가지로 분류 하였 고, skin으로 갈수록 quercetin 함량이 증가함에 따 라 DPPH 라디칼 소거활성과 Staphylococcus aureusVibrio parahamolyticus에 대한 항균 활 성이 증가한다고 보고하였다. 이들 EtOAc 분획물에 서 확인된 상대적으로 우수한 in vitro 항산화 활성 은 quercetin을 포함한 다양한 페놀성 화합물과 같 은 생리활성물질에 의해 유도되는 것으로 판단된다.

    3.2.지질 과산화물(MDA) 생성 억제효과

    신경세포막을 구성하고 있는 지질성분은 산화적 스 트레스에 취약한 특성을 가지고 있으며, 세포막 손상 및 기타 단백질 손상과도 관계가 있다고 알려져 있다 (Stoewsand, 1995). 따라서 본 연구에서는 지질과산 화 중간생성물인 malondialdehyde(MDA) 생성 억제 활성을 살펴보았다(Fig. 2). 양파 과육(43.02%)과 과 피(38.89%) EtOAc 분획물의 500 μg/mL에서는 유의 적인 차이를 나타내지 않았으며, positive control로 사용된 catechin(75.31%)과 비교하였을 때는 상대적 으로 낮은 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 그리고 양파 과육 EtOAc 분획물의 경우에는 농도간 의 유의적인 차이는 존재 하였으나(Fig. 2A), 양파 과피의 경우 50-500 μg/mL의 농도에서 36-38% 의 억제효과를 나타냄으로써(Fig. 2B), 과육과 비교하였 을 때 다소 낮은 농도에서도 일정 수준의 MDA 억제 활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있다.

    Park et al.(2009)의 보고에 따르면, high fat– cholesterol 식이로 산화적 스트레스를 유발한 rat의 plasma에서의 LDL의 초기 산화 지표인 conjugated diene 함량을 측정한 결과, control group은 2.2 μM, high fat–cholesterol 식이 group은 3.0 μM, 5% 양파 powder가 함유된 식이를 한 그룹은 1.5 μM, 5% 적색 양파 powder가 함유된 식이를 한 그 룹은 2.2 μM와 같은 결과를 나타냈다. Anthocyanins 의 함유량을 고려하지 않은 단편적인 결과이기는 하 나, 양파 powder가 적색 양파 powder 대비 약 3.5 배 많은 total flavonoid 함량을 갖는 것으로 볼 때 이들 flavonoids에 의하여 항산화 활성이 증가하였 고 그 결과 뛰어난 지질과산화 억제 효과를 가지는 것이라고 보고하였다. 그리고 Jang & Lim(2009)의 연구에 따르면 양파 과피(95.10μg/mL)의 총 플라보 노이드의 함량은 양파 과육(19.67μg/mL) 대비 약 5 배 높은 함량을 나타낸다. 이러한 결과들을 바탕으 로 볼 때, 본 실험에서 나타난 결과도 상대적으로 많은 flavonoid를 함유하는 과피 EtOAc 분획물이 낮은 농도에서도 비교적 우수한 지질과산화 억제활 성을 유도한 것으로 판단된다.

    3.3.세포 내 산화적 스트레스 생성 억제효과

    ROS는 특정한 조직 또는 장기에 제한적이지 않 고, 대부분의 신경계, 골수, 조혈기관, 간 및 내분비 계 등에서 생성되어 노화와 관련된 질병들과 관계 되는 것으로 알려져 있다. 그렇기 때문에 이러한 산 화적 스트레스를 억제하는 것은 노화와 관련된 질병 의 예방이나 치료에 중요한 역할을 할 수 있을 것으 로 알려져 있다(Abdollahi et al., 2014). 따라서 상 대적으로 높은 항산화 활성을 갖는 양파의 과육과 과피의 EtOAc 분획물을 이용하여 ROS 생성 저해 활성을 측정하였고, 그 결과는 Fig. 3과 같다. H2O2 를 처리한 처리구에서는 대조구(100%) 대비 151.00% 의 DCF formation을 나타내었고, H2O2와 vitamin C를 동시에 처리한 처리구에서는 79.33%로 약 70% 정도의 산화적 스트레스 감소 효과를 보였다. 양파 과육과 과피 EtOAc 분획물 모두 우수한 산화적 스 트레스 생성 억제효과를 나타내었다. 양파 과육 EtOAc 분획물 농도 200 μg/mL 처리구에서는 77.16%로 vitamin C 처리구와 유의적인 결과를 나 타내었다(Fig. 3A). 반면 양파 과피 EtOAc 분획물 의 농도 20 μg/mL에서는 83.70%로 vitamin C와 유의적인 결과를 나타내는 것을 확인하였을 때, 양 파 과피가 과육 대비 약 10 배 낮은 농도에서 더 우 수한 산화적 스트레스 생성 억제효과를 나타내는 것 을 확인하였다.

    Abdollahi et al.(2014)에 따르면 대부분의 ROS 들은 세포에 손상을 줄 수 있으며 세포의 항상성에 손상을 줌으로써 세포생존율에 큰 영향을 끼치는 것 으로 알려져 있고, α-tocopherol과 vitamin C 같은 천연 항산화 물질에 의하여 ROS 생성을 억제 할 수 있다고 보고하였다. 이에 따라 양파가 갖는 항산화 활성은 내재된 flavonoids를 포함한 페놀성 화합물 에 의해 주로 유도되는 것으로 판단되며 과육보다는 과피에서 더 우수한 활성이 나타나는 것을 확인한 바 PC12 신경세포에서의 세포 보호효과를 MTT와 LDH assay를 통해 비교·확인하고자 하였다.

    3.4.신경세포 생존율 및 세포막 손상 억제효과

    과산화수소(H2O2)는 in vivo 상에서 많은 산화적 효소들에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다. 과산 화수소 상태에서는 반응성이 크게 나타나지 않지만, hydroxyl 라디칼의 생성으로 인하여 세포에 큰 독 성을 야기함으로써 세포막 손상 및 apoptosis를 유 발하게 된다(Lee et al., 2007). 이러한 산화적 스 트레스에 대한 PC12 신경세포 보호효과를 측정하였 고, 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다.

    양파의 과육과 과피 EtOAc 분획물의 H2O2에 의 해 유도된 산화적 스트레스에 대한 PC12 신경세포 생존율을 측정한 결과는 Fig. 4(A, B)와 같다. H2O2 처리구에서는 대조구 대비 76.71%의 세포 생존율을 나타냈고, vitamin C(113.53%) 처리구에서는 약 36%정도의 신경세포 보호 효과를 보였다. 양파 과 육 EtOAc 분획물(Fig. 4A)의 경우, 50 μg/mL 이 상의 농도에서 positive control로 사용된 200 μM vitamin C 처리구와 유사하거나 우수한 신경세포 생존율을 나타냈다. 하지만 양파 과피 EtOAc 분획 물(Fig. 4B)에서는 5-50 μg/mL 의 낮은 농도 처리 구에서도 vitamin C와 유사한(약 110-118%) 생존율 을 나타냈다. 이상 MTT assay의 결과는 in vitro 항산화 실험과 비교적 유사한 결과로써, 양파의 과 육보다 과피의 EtOAc 분획물에서 약 10배 정도의 높은 신경세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다.

    신경세포의 경우 전기적 신호전달이라는 고유 기 능유지를 위해 상대적으로 많은 지방산을 함유하고 있고 이는 산화적인 스트레스에 매우 취약한 구조 특성이므로(Kwak et al., 2010) H2O2로 유도된 신 경세포막 손상에 대한 양파의 과육과 과피 EtOAc 분획물의 보호효과를 확인하기 위해 신경세포 중에 함유되어 있는 세포질 성분으로서 LDH 방출량을 측 정한 결과는 Fig. 4(C, D)와 같다. 대조구의 LDH 방출량은 25.93% 정도인데 반해 H2O2 처리구에서는 43.47%의 방출량을 보여 H2O2에 의해 LDH 방출량 이 약 18% 정도 증가하였다. 양파 과육과 과피 EtOAc 분획물의 경우 모두 positive control로 쓰 인 vitamin C 200 μM 처리구와 비교하였을 때, 낮 은 LDH 방출량을 보여 과육과 과피 모두 신경세포 막 보호효과를 갖는 것으로 확인되었다. 다만 양파 과육 EtOAc 분획물의 경우 50-500 μg/mL의 농도 로 처리했을 때 약 11-13% LDH 방출량을 보였으 며, 양파 과피 EtOAc 분획물의 경우 5-50 μg/mL 농도에서 약 14-15% 의 LDH 방출량을 보였다. 이 러한 결과는 상기의 MTT assay결과와 유사하게 나 타났으며, PC12 신경세포막 손상 억제효과 역시 양 파 과피가 더 낮은 농도(약 10배)에서 우수한 신경 세포막 보호효과를 갖는 것으로 확인되었다.

    이러한 결과들을 고려할 때 in vitro 항산화 활성 과 PC12 신경세포 보호효과에서 나타나는 결과들 은, flavonoids를 포함한 페놀성 화합물의 자유 라 디칼 소거 활성으로 인하여 항산화 활성이 높아진다 는 기존 연구 결과와 유사한 내용으로 판단된다 (Yoon et al., 2012). 실제 양파의 주된 flavonoids 인 quercetin은 벤젠환의 탄소에 -OH기와 탄소의 2와 3사이의 이중결합, 4의 탄소위치에 carbonyl기, 그리고 A고리와 B고리에 결합되어 있는 -OH기에 의해서 항산화 활성을 갖는 구조를 가지고 있어 활 성산소의 산화활동을 억제하거나 제거하는 능력이 매우 강한 것으로 알려져 있다(Jeon et al., 2011). 특히, 양파의 가식부분에는 0.01%의 quercetin이 함유되어 있고 겉껍질로 갈수록 함량이 높아져 양파 껍질에는 순 무게의 6.5%에 달하는 quercetin이 함 유되어 있는 것으로 알려져 있다(Jeon et al., 2011). 이러한 결과를 보아, 본 실험에서 양파 과육 대비 flavonoids 함량이 많은 것으로 보고되는 양파 과피에서 상대적으로 우수한 항산화 활성 및 신경세 포 보호효과를 나타내는 것은 flavonoids 등과 항산 화 활성의 관계에서 유도된 것으로 판단된다.

    3.5.GC/MS를 통한 quercetin 및 quercetin glycosides 함량 분석

    In vitro 항산화 활성과 PC12 신경세포 보호효과 를 유도하는 양파의 주요 생리활성 물질로서의 quercetin과 그 배당체의 정량 분석을 위한 GC-MS 결과는 Table 2와 같다. 표준 quecertin과 각 분획 물에서 분리한 peak의 retention time, MS ion fragmentation 비교를 통해 양파 과육과 과피에서 quercetin과 그 배당체를 분석하였다. TMS로 유도 체된 quercetin은 647의 base ion을 가져야 하며, 추가적으로 575, 487의 ion fragmentation을 가지 는 것으로 알려져 있다(Dias et al., 2013). 이에 따 라 standard와 sample에서의 값이 일치하였으며, sample에 존재하는 peak은 quercetin으로 확인하 였고, 함량 계산값을 Table 2에 나타내었다. 양파 과육 EtOAc 분획물은 quercetin보다 그 배당체가 약 2배 많은 것을 알 수 있었으며(quercetin aglycone; 519.05, glycoside; 935.51 mg/g of powder), 이에 반해 양파 과피 EtOAc 분획물은 quercetin이 그 배당체보다 약 1.5배 많이 존재하는 것을 확인 할 수 있었다(quercetin aglycone; 1,560.22, glycoside; 1,050.47mg/g). 이러한 결과 로 볼 때, 본 실험에서의 과피 분획물이 나타내는 상대적으로 우수한 in vitro 항산화 활성 및 신경세 포 보호효과는 양파 과육 분획물 대비 약 3배 정도 많은 quercetin 함유량에 따른 결과로 판단된다.

    Choi et al.(2012)의 연구에 따르면, quercetin은 vitamin C 보다도 강력한 항산화 활성을 가진다고 보고하였으며, 농도 10 μM 에서 H2O2에 의한 PC12 cell 내 산화적 스트레스 생성을 200 μM vitamin C 보다 14% 높은 보호효과를 나타낸다고 보고하였다. 또한, Wang et al.(2014)에 따르면 Alzheimer’s disease(AD)에 걸린 마우스 모델(APPswe/PS1dE9 transgenic mouse)에게 16주간 quercetin을 섭취시 킨 결과, 해마 신경세포의 MMP(mitochondrial membrane potential)의 회복, ROS 감소, ATP 함 량의 증가 등 mitochondria의 기능을 활성화시킴으 로써 AD의 잠재적인 치료 소재로서의 활용 가능성 을 제시하였다. 하지만, Park et al.(2007)의 연구 결과에 따르면, 실제 양파의 주요 생리활성물질로 알려진 quercetin 함량은 양파 과피의 ethanol 추 출물에서 양파 과육 ethanol 추출물 대비 약 50배 차이가 나지만, rat plasma에서의 TAS(total antioxidant status) 함량과 간에서의 TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) 함량 및 brain 8-isoprostane 함량에서의 유의적인 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 과육에 포함되어 있는 quercetin 이외의 배당체나 isorhametin과 같은 다른 페놀성 화합물이 in vitro 항산화 활성와는 대조적 으로 in vivo 상에서 나타내는 항산화 활성이 뛰어 나다고 보고하였다. 실제 quecertin이 인체에서 흡 수되기 위하여 O-methylate된 형태나 다른 당과 결합하여 배당체의 형태 전환되어야 소장을 통과할 수 있으며, 특히 이러한 형태를 나타내는 isorhamnetin 과 quercetin 배당체와 같은 물질들이 양파의 과육 에 많이 존재함에 따라 in vivo상에서 뛰어난 항산 화 활성를 나타내는 것으로 사료 된다(Holiman et al., 1995; Spencer, 2008). 이러한 결과들을 바탕 으로 볼 때, 양파 과육에 존재하는 quercetin 배당 체들과 다른 미량으로 존재할 수 있는 페놀성 화합 물의 분석 및 in vivo 상에서의 추가적인 비교·검 증이 필요하다고 판단된다.

    Figure

    JALS-49-83_F1.gif

    ABTS radical scavenging activities of various fractions from onion flesh (A) and peel (B). DPPH radical scavenging activities of various fractions from onion flesh (C) and peel (D). Results shown are mean ± SD (n=3). Data were statistically considered at p<0.05, and different small letters represent statistical differences.

    JALS-49-83_F2.gif

    Inhibitory effects of various fractions from onion flesh (A) and peel (B) on malondialdehyde (MDA) production. Results shown are mean ± SD (n=3). Data were statistically considered at p<0.05, and different small letters represent statistical differences.

    JALS-49-83_F3.gif

    Protective effects of ethyl acetate (EtOAc) fraction from onion flesh (A) and peel (B) on H2O2-induced ROS production in PC12 cells. Results shown are mean ± SD (n=3). Data were statistically considered at p<0.05, and different small letters represent statistical differences.

    JALS-49-83_F4.gif

    Neuronal cell protective effects of ethyl acetate (EtOAc) fraction from onion flesh (A) and peel (B) on H2O2-induced cytotoxicity in PC12 cells. LDH release inhibitory effects of ethyl acetate(EtOAc) fraction from onion flesh (C) and peel (D) on H2O2-induced membrane damage in PC12 cells. Results shown are mean ± SD (n=3). Data were statistically considered at p<0.05, and different small letters represent statistical differences.

    Table

    Condition of Gas Chromatograph-Mass Spectrometer (GC-MS)

    Quantitative analysis of quercetin and its glycoside with TMS derivatives by Gas Chromatograph-Mass Spectrometer(GC-MS) in onion flesh and peel fractions (Unit : mg/g of powder)

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