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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.49 No.2 pp.75-82
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2015.49.2.75

Comparison of muscle stem cell populations from normal and runt pigs and their effect on muscle growth

Sungkwon Park*
Department of Food Science & Technology, Sejong University, 209 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, seoul, 143-747, Korea
Corresponding author: Sungkwon Park Tel: +82-2-3408-2906 Fax: +82-2-3408-4319 sungkwonpark@sejong.ac.kr
June 16, 2014 April 9, 2015 April 21, 2015

Abstract

Runt pigs exhibit decreased postnatal growth compared to their normal littermates. Skeletal muscle satellite progenitor cells play a crucial role in muscle fiber development and postnatal muscle growth. The side population (SP) has recently been identified from skeletal muscle using fluorescence-activated cell sorting (FACS) and exhibits both hematopoietic and myogenic capabilities. To this end, we analyzed semitendinosus (ST) muscles of 2 d old littermate normal (1.5 ± 0.05 kg) or runt (0.8 ± 0.06 kg) piglets for satellite cell and SP numbers. Muscles of runt pigs possessed smaller circumferences (p<0.05), total fiber numbers (p<0.05), and average fiber sizes (p<0.05) compared to those from normal pigs. Concentration of total protein or DNA, however, was not different. Total RNA and DNA content were greater (p<0.05) in ST from normal compared to runt pigs. Total cell yield per g ST muscle obtained by primary cell culture from both groups was not different. Proliferative capacity was not different at 0, 24, and 48 h in culture, but was higher for cells from normal pigs at 72 h compared to runt pigs. Muscle from runts yielded lower SP frequencies (normal 23.0% versus runts 9.0%; p<0.05). These results confirm runt pigs have decreased muscle size and fiber number and suggest aberrations in myogenic stem cell populations play a critical role in this growth retardation
model.


정상돈과 위축돈의 줄기세포군(stem cells and side population)의 특성 비교 및 근육의 성장에 미치는 영향

박 성권*
세종대학교 식품공학과

초록

위축돈은 정상돈에 비해 생시체중이 낮고 생후 성장과 발달도 미숙하다. 근육의 성장에 있어 muscle satellite cells(SC)의 역할에 대해 많은 연구가 진행되고 있다. 근육 내에서 줄기세포를 하는 side population(SP) 세포군이 최근 밝혀졌는데, 이 세포군은 Hoechst dye를 이용한 fluorescenceactivated cell sorting(FACS)에 의해 이용하여 분리되는데, 다양한 조직(특히 근육)으로 분화되는 것으 로 밝혀졌다. 위축돈과 정상돈 근육 내 SC와 SP 세포군의 숫자 및 성상을 비교분석하기 위해 semitendinosus(ST) 근육을 적출하여 SC와 SP를 분리·배양 하였다. 위축돈의 ST는 정상돈에 비해 무 게가 가볍고 근섬유의 숫자와 크기도 작았다(p<0.05). 하지만 정상돈과 위축돈의 ST 근육 내 단백질과 DNA 총량은 차이가 없었다. 총 RNA 양과 DNA 농도는 정상돈의 ST 근육에서 위축돈에 비해 높게 (p<0.05) 나타났다. ST 근육에서 추출된 총 세포수(yield/g)에는 정상돈과 위축돈 간 차이가 없었다. 세 포의 증식률을 0, 24, 48 시간동안 두 그룹 간 차이가 없었다. 세포 배양 72시간 후 정상돈 ST 근육에 서 추출된 세포의 증식률이 위축돈의 그것에 비해 높게(p<0.05) 나타났다. 정상돈 ST 근육에서 위축돈 ST 근육에 비해 SP 세포가 더 많이(p<0.05) 추출되었다. 종합해 보면, 위축돈의 근육 크기와 근섬유의 숫자가 정상돈에 비해 작고, 근육내 줄기세포의 역할을 하는 SC와 SP 세포군 또한 낮게 나타난 것은 위축자돈이 임신 기간 동안 충분한 영양을 받지 못하여 근육 내 줄기세포의 증식이 낮아졌으며, 이는 근육 내 줄기세포가 자돈의 성장과 발달에 큰 영향을 미치는 결과로 해석할 수 있다.


    Rural Development Administration
    PJ009312012015

    Ⅰ서론

    자돈의 성장은 모돈 자궁 내 환경에 영향을 받는 다. 출생 전 충분한 영양을 공급받지 못하여 자궁 내 성장이 지연되면 출생 후에 성장이 회복되는 것 은 매우 어렵다. 따라서, 자궁 내 성장과 발달은 출 생 후 자돈의 성장과 향후 경제성을 좌우한다. 출생 에서 성장과 도축까지의 기간이 비슷한 돼지와 같은 육용 동물에서는 임신기간의 성장발달 과정이 매우 중요하다. 돼지의 경우, 출생자돈 평균 체중의 2/3 에 미달되는 체중으로 태어난 자돈을 위축돈이라고 하는데, 자궁 내 성장이 지연되어 비정상적인 장기 발달 및 왜소한 몸집 등의 표현형을 보인다(Perry & Rowell, 1969). 위축돈은 자궁 내 배아시기에 성 장 및 생존율이 떨어질 뿐만 아니라 생후 생존율과 성장률도 정상자돈에 비해 현저히 낮아지게 된다 (Foxcroft & Town, 2004). 자돈의 생존율과 성장 률은 배아의 숫자와 밀접한 관계가 있는데, 자궁 내 배아의 수가 많을수록 출생자돈의 생존율 및 생시 체중은 낮아진다. 따라서 자돈수가 많은 후보돈을 선택개량 할 경우 오히려 위축돈 발생빈도가 증가하 여 경제적이지 못하다는 연구결과도 발표된바 있다 (Milligan et al., 2002). 따라서 자궁 내 영양전달 기전과 성장 환경 및 자돈의 성장 및 발달 관여인자 등에 대한 세밀한 연구가 필요한 실정이다.

    위축자돈의 체중미달현상은 자돈 근육의 성장과 밀 접한관계가 있다(Dwyer et al., 1994). 위축자돈의 근육 내 근섬유의 숫자와 DNA 양은 정상돈에 비해 적다(Rehfeldt and Kuhn, 2006). 근육 내 근섬유의 숫자는 돼지가 태어날 시기에 이미 정해지기 때문에 자궁 내에서의 근육의 성장 및 발달(myogenesis) 과 정은 근육성장에 매우 큰 영향을 미친다. 출생 후 근 섬유 수의 증가 및 근육의 성장은 근육 내 줄기세포 로 알려져 있는 satellite cells(SCs)에 의해 이루어진 다(Moss and Leblond, 1971). 상처나 운동 등의 성 장 신호가 주어지면 근육 내 잠복해 있던 SCs는 활 성화되어 근육재생의 원료로 사용된다. 최근, SCs와 더불어 근육 내 줄기세포의 역할을 하는 side population(SP)이라 불리는 또 다른 세포군이 발표되 었다(Schienda et al., 2006). 근육유래 SP는 DNA 염색물질인 Hoechst 33342에 의해 염색이 되지 않 는 세포군으로 fluorescence-activated cell sorting (FACS)에서 Hoechst에 염색이 되는 주세포군과 차 별되어‘side population’이라 명명되어 졌다(Gussoni et al., 1999). 근육의 SP는 in vitro상에서 단일 세 포군으로는 근육세포로 분화가 되지 않지만, 근육세 포와 co-culture를 하거나 in vivo 근육에 주입을 하게 되면 근육으로 분화가 되는 것으로 밝혀졌다 (Seale et al., 2000). Paired box protein 7(Pax7) 이 결여된 쥐의 근육에 SP를 이식한 결과 근육으로 분화가 되는 것이 확인되었다. 아직 정확한 기전이 밝혀지진 않았지만 SP가 근육 내에서 SCs와 함께 줄 기세포의 역할을 할 수 있다는 가능성을 시사 하는 결과들이다. 따라서 본 연구는 정상돈과 위축돈 근육 내 존재하는 SCs와 SP 세포군을 비교 분석하여 이들 세포가 근육의 성장에 미치는 영향을 밝혀내기 위해 실시되었다.

    Ⅱ재료 및 방법

    2.1.Animals

    본 연구에 사용된 돼지는 국립축산과학원에서 사 육중인 2산차 임신돈에서 출생한 자돈의 무게를 측 정하여 0.9kg 이하는 위축돈(runt)으로, 체중 1.4~1.6 kg은 정상돈(normal)으로 분류하였다. 정 상돈과 위축돈 각 3두씩 수퇘지만 사용하였다. 생후 2일후 자돈을 국립축산과학원 동물실험윤리 수칙에 따라 안락사 하고, semitendinosus(ST) 근육을 채 취하여 근섬유 숫자와 크기를 분석하고 근육줄기세 포군(SCs와 SP)을 추출 하여 동결하였다.

    2.2.Porcine Satellite Cell Isolation and Cell Culture

    2일령 자돈의 ST 근육을 적출하여 petri-dish에 서 세절하였다. 세절시 지방, 혈관 및 결체조직을 제 거한 후, protease(0.8mg/mL PBS, Sigma, USA) 용액에 섞어 37℃에서 30분간 배양하였다. 배양기간 동안 10분 간격으로 세 번의 vortex를 하였다. 배양 후 1,200 × g에서 15분간 원심분리 하였다. 펠렛은 다시 Minimum Essential Medium (MEM, Sigma, USA)에 현탁하여 300 × g에서 10 분간 원심분리 후 상등액을 100 및 53 mm nylon mesh로 여과한 후, 1200 × g에서 15분 동안 원심 분리하였다. 분 리된 근육 satellite cells(SCs)은 10% FBS가 포함된 MEM(growth media, GM)에 혼합 후 Matrigel(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)-coated 6 well-plate에 분주하고 37℃, 5% CO2에서 배양하였 다. GM은 48시간 마다 교체해 주었다.

    2.3.Cell proliferation and myogenic differentiation

    SCs의 증식은 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit(Promega, USA)을 사용하여 3일 동안 24시간 간격으로 확인하였다. RST 및 WST내 위성 세포(1 × 104 cells per cm2)를 Matrigel-coated 96-well plates에 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 15 μl dye solution을 첨가하였다. 4 시간 뒤, 100 mL stop/solubilization solution 주입 후 12시 간 동안 배양하고 570 nm에서 optical density 값 을 측정하였다.

    2.4.Immunohistochemical analysis

    근육의 동결 section은 ST 근육을 적출한 후 liquid nitrogen으로 냉각된 isopentane에 근육을 고정하고, cryostat을 이용하여 10μm 두께로 세절한 박편을 glass plate에 붙인 후 –80℃에 보관하였다. Cryosection은 30분간 blocking 후 세포벽 염색을 위해 FITC green에 conjugate 된 Lectin primary antibody(Sigma, USA)에 30분간 배양 후 PBS에 washing 후 형광현미경으로 이미지를 촬영한 후, 근 섬유의 숫자와 크기를 NIH ImageJ 프로그램을 이용 하여 분석하였다(total fiber number, average fiber size). 배양된 세포는 paraformaldehyde로 고정을 하고 2% BSA, 5% goat serum, 0.2% Triton X-100이 첨가된 PBS에서 blocking 처리 하였다. 세포는 primary antibody(Pax7)에 1시간 배양 후 PBS로 3 회 washing 후 Cy5-conjugated secondary antibody로 배양 후 washing 하였다. Pax7에 염색 된 SCs는 Cy5에 의해 형광에서 붉은색을 띄고, DAPI로 염색된 전체 세포는 푸른색을 띄어 전체 세 포에서 SCs 세포의 숫자를 비교 분석 하였다.

    2.5.Side population

    ST 근육에서 추출된 근육세포는 37℃에서 5μg/mL 농도의 Hoechst 33342(Cell Signaling, USA)를 첨 가하여 90분간 배양 후, HBSS로 washing 후, 4℃ 에서 Fluorescence-activated cell sorting(FACS; Beckman Fc500, CA, USA)으로 분석하였다.

    2.6.Statistics

    수집된 데이터는 SAS program(SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용해 통계분석을 수행하였으며 처리구간 유의성 P<0.05수준으로 하였고 Student’s T test 법으로 검증하였다. 모든 결과치는 LS means ± SE로 나타내었고 Least square means을 계산하기 위해 LSMEANS과 Tukey’s adjustment 사용하였다.

    Ⅲ결과 및 고찰

    3.1.체중 및 근육 성상

    정상자돈의 체중은 위축자돈에 비해 약 1.9배가량 높게(P<0.01) 나타났다(Table 1). Semitendinosus (ST) 근육의 무게와 단면적 또한 위축자돈에 비해 정 상자돈에서 더 높게(P<0.01) 나타났다(Table 1). ST 근육 내 단백질과 DNA 농도에는 유의적인 차이가 없었다. 하지만, ST 근육 내 DNA 총량은 정상자돈 이 3.16mg, 위축자돈이 1.28mg으로 정상자돈의 ST 에서 두 배 가량 높게(P<0.05) 나타났다. 위축자돈의 ST 근육 내 RNA:DNA 비율이 정상자돈에 비해 낮게 나타났는데, 이는 위축자돈의 근육이 출생 후 성장할 수 있는 가능성이 정상자돈의 근육에 비해 낮다는 것 을 의미하는 결과이다. 또한, 위축자돈의 근육 내 DNA 총량이 낮은 것은 그만큼 근육세포의 생성이 정상자돈에 비해 느리거나 세포생성 능력이 떨어지거 나 근육세포의 원료가 될 수 있는 줄기세포 등의 숫 자가 낮은 것으로 판단된다. 추후에 어미의 자궁 내 영양 상태와 근육세포의 생장 및 분화능력에 대한 상 관관계 분석연구가 필요할 것으로 사료된다. 특히, 자궁의 크기와 embryo 숫자, 자궁 내 태반의 길이 및 직경 등 자궁 내 물리적, 생리적 환경에 대한 고 찰에 대한 보충은 생후 자돈의 성장을 이해하는데 도 움이 될 것으로 사료된다. 또한 자돈 수가 많은 중국 의 매산돈과 생산성이 좋은 외국종의 crossbreeding 을 통해 자돈의 수와 생후 성장 메커니즘의 상관관계 를 분석하는 것도 좋은 방법이 될 것이다.

    3.2.근섬유 숫자 및 크기 비교

    본 연구의 근육 내 DNA 데이터와 Wigmore (1983)의 연구 결과와 같이, 위축자돈의 ST 근육 내 근섬유의 숫자와 평균단면적은 정상자돈에 비해 낮았다(P<0.05; Fig. 1A). 이는 근육 내 DNA 총량 이 위축자돈의 근육에서 더 낮게 나타난 결과 (Table 1)와 일맥상통하는 결과이다. 위축돈의 ST 근육 내 근섬유의 단면적은 10-100 μm2 사이의 작 은 근섬유가 많이 분포되어있고, 정상돈은 100-180 μm2 사이의 비교적 큰 근섬유 다발이 많은 것으로 나타났다(Fig. 1B). 이 결과는 ST 근육의 무게 데 이터에서도 같은 양상으로 나타났는데, 생시체중과 ST 근육 내 근섬유 숫자와는 매우 높은 양의 상관 관계를 보였다(r=0.61). 근육은 우리 몸의 약 70% 를 구성하고 있고, 그 근육을 이루고 있는 근섬유 의 숫자와 크기가 체중에 영향을 미치는 것은 당연 하지만, 임신기간과 분만 직후 영양상태 및 환경이 근육의 성장과 발달에 미치는 영향을 밝히는 것은 어렵다. 하지만, 자돈의 성장개선을 위해서는 모돈 의 영양이 자돈 근육에 전달되는 과정, 근섬유의 생장과 발달에 필요한 영양성분과 신호전달체계 등 다각적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 향후 자 돈의 영양공급과 줄기세포의 성장발달 및 근육섬유 다발의 직경에 대한 상관관계를 밝히는 연구를 진 행할 예정이다.

    3.3.Muscle satellite cells(SCs) and side population (SP) 비교분석

    생후 근육의 성장, 특히 근섬유에 DNA 또는 세포 핵을 제공하는 중요한 요소는 satellite cells(SCs)로 알려져 있는데, 출생 후 초기 근육성장의 50% 이상 이 이 SCs에 의해 이루어진다(Moss, 1971). 따라서 정상자돈과 위축자돈의 근육크기의 차이는 SCs의 숫자 및 이들 세포의 성장과 분화능력에 기인한다는 가설을 세우고, 이를 증명하기 위해, 정상자돈과 위 축자돈의 ST 근육에서 SCs를 추출하여 SCs의 숫자 와 성장패턴을 분석하였다. 총 세포수율은 위축자돈 과 정상자돈에서 유의적인 차이가 없었다. 이는 primary 세포 배양 특성상 enzyme digestion이 이 루어지기 때문에 근육세포 뿐 아니라 다른 세포군도 포함되어 있기 때문일 것으로 사료된다. 다양한 antibody를 이용하여 SCs나 stem cells 외에 fibroblast cells 등 다른 세포군의 분석연구도 향후 수행할 예정이다. 이번 연구에서는 ST 근육에서 추 출한 세포의 증식율과 분화율을 분석하였다. 추출된 세포의 증식률(proliferation rate)은 plate에 seeding 후 0, 24, 48 시간동안에는 정상자돈과 위 축자돈사이 차이가 없었으나, 72시간이 되면서 정상 자돈의 근육에서 추출한 세포의 증식률이 증가하였 다(P<0.05; Fig. 2). 첫 48시간 동안 차이가 없는 것은 비슷한 수의 세포가 seeding되었다는 간접적인 증거이다. 그 후부터는 세포들의 증식률에 차이를 보이면서 정상돈에서 추출된 세포의 증식률이 현미 경상에서도 확연히 증가하는 것을 볼 수 있었는데, 이러한 증식률의 차이는 ST 근육의 크기 및 자돈 체중에 영향을 줬을 것으로 사료된다. 하지만, 추출 한 세포들의 분화율은 정상자돈과 위축자돈사이에 차이를 보이지 않았다. 분화율의 차이가 없는 이유 는 전체 세포핵의 숫자에 대한 분화된 세포내 핵의 숫자 비율이기 때문일 것이다. 처리구별 분화된 근 섬유숫자를 비교하였을 때는 정상돈에서 위축돈에 비해 더 많은 근섬유숫자가 있는 것으로 나타났다.

    ST에서 추출한 세포군에서 생후 근육의 성장과 발달에 필요한 세포인 SCs population을 구분하여 총세포수에 대한 비율을 분석하였다. 총 세포군에서 SCs 만을 분리하기 위해 Pax7 antibody를 사용하 였는데, Pax7은 SCs lineage development에 매우 중요한 역할을 하여, SCs에 대한 특이적인 마커로 알려져 있다(Seale et al., 2000). 언급한 가설대로, Pax7 positive 세포가 정상자돈(59%)에서 위축자돈 (43%)에 비해 높게 나타났다(P<0.05, n=12, Fig. 3). 하지만, SCs가 15% 이상 많은 정상자돈에서 추 축된 세포들의 분화율이 위축자돈에서 추출한 세포 들보다 높지 않았다는 것은 예상 밖의 결과이다.

    Pax7은 비활성화 상태의 SCs와 활성화된 SCs 모두 에 발현이 되기 때문에, Pax7 positive 세포가 정상 자돈에 많이 존재하더라도 현재 세포배양 상태에서 는 모든 세포가 활성화 되지 않을 수도 있다는 결과 이다. 하지만, 앞서 언급한 데로 분화된 근섬유의 절대적 숫자는 정상자돈에 더 많이 존재하였다. 향 후 추출된 SCs가 활성화되어 증식하고 분화할 수 있는 세포배양 system을 개발해야 할 것으로 사료 된다. 이를 위해서는 근육세포에 신경세포 및 fibroblast 세포 등의 공동배양 등 in vivo 상태의 근육환경에 최대한 비슷한 조건을 시뮬레이션 해야 될 것이다. 지방세포, 신경세포, 섬유아세포 등이 근육세포, 특히 근육줄기세포의 성장과 분화에 미치 는 영향을 밝힘으로써 경제동물의 성장을 촉진하는 데 큰 도움이 될 것으로 사료된다.

    최근 근육 내에서 stem cell 역할을 하는 또 다른 세포군이 발견되었는데, Hoechst 33342 dye에 대 한 특이적인 염색반응 때문에 side population(SP) 이라 명명되었다(Schienda et al., 2006). SP 세포 군은 다양한 세포로의 분화기능을 보이는데, 특히 in vivo 또는 in vitro에서 근육세포로 분화가 가능 하며, 근육 특이 신호인 Pax7을 발현한다(Schienda et al., 2006). ST 근육에서 추출된 세포군에서 SP 세포군을 분리·추출하기 위해 Hoechst dye를 이용 하여 fluorescence-activated cell sorting(FACS) 결과, 정상자돈의 ST에서 위축돈에 비해 두 배 이상 많은 SP 세포군이 존재하는 것으로 나타났다(23% vs. 9.0%, P<0.05; Fig. 4). 향후 임신기간 동안 자돈 근육의 성장과 발달에 대한 메커니즘에 대한 많은 연구가 필요하겠지만, 이번 연구 결과는 근육 내 줄기세포의 역할을 하는 SP가 SC와 함께 근육 의 성장의 원료 역할을 할 가능성을 증명하였다. 또한, 위축돈은 정상돈에 비해 SP 세포군과 SC 세 포군 모두 적은 것으로 나타났는데, 이는 이들 세 포군이 서로 보완하지 않고 있다는 가능성을 시사 한다. 본 연구에 언급은 하지 않았지만, 근육에서 분리된 SP 세포군은 특정 antibody에 반응을 보이 면서 hematopoietic progenitor activity를 지닌 것 으로 나타났고, 배지 내 특정 인자의 처리에 따라 지방적을 구성하는 지방세포로 분화되었다. 따라서 향후 SC 세포의 증식과 분화를 조절하는 인자, SC 와 SP의 상호작용, 그리고 SP subpopulation을 밝 히는 연구를 수행하여 근육의 성장과 발달을 조절 하는 메커니즘을 밝힘으로써 자돈의 성장 및 육질 을 개선하고 경제성을 증가시키는데 도움이 되고자 한다.

    Figure

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    A. Total fiber number and average fiber size of semitendinosus muscles from normal and runt piglets. *P<0.05 vs. normal. B. Fiber abundance: distribution of muscle fibers within specific fiber size for normal and runt piglets.

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    Proliferation rates of satellite cells (SCs) from semitendinosus of normal and runt piglets. Data were generated at 0, 24, 48, and 72 h. Results are means ± SE. *P < 0.05 vs. normal within each time point.

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    Pax7 positive cell population in semitendinosus muscles from normal and runt piglets. Immunostaining of freshly isolated SCs labelled with Pax7. Total nuclei number was revealed by DAPI staining. The Pax7-positive cells percentage was calculated as the percentage of Pax7-positive cells out of the total number of cells indicated by DAPIositive staining for each microscopic field. Results are means ± SE. *P < 0.05 vs. normal.

    JALS-49-75_F4.gif

    Flow cytometry (FACS) analysis of cells isolated from ST of normal and runt piglets. Cells were stained with Hoechst 33342. Representative FACS image of cells from normal (A) and runt (B) piglets. SP was gated in 10~80K on violet-red (X-axis) and 30~160K on violet-blue (Y-axis). Average % of side population was shown in (C). *P<0.05 vs. Normal.

    Table

    Birth weight and semitendinosus muscle characteristics of normal and runt piglets

    **P < 0.01 and *P < 0.05 vs. normal within row

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