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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.49 No.2 pp.47-56
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2015.49.2.47

Effects of long-chain fatty acids on in vitro rumen microbial population, dry matter degradability and methane production

Shin Ja Lee1, Da Som Oh2, Do Hyung Kim3, Ji Un Ok2, Su Kyoung Lee1, Jung Hwa Lim2, Sung Sill Lee1*
1Institute of Agriculture and Life Science (IALS), Gyeongsang National University, Jinju, Korea.
2Division of Applied Life Science (BK21), Graduate School of Gyeongsang National University, Jinju, Korea.
3Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Jeongeup, Korea

+ These authors contributed equally to this work.

Corresponding author: Sung Sill Lee Tel.: +82-55-772-1883 Fax: +82-55-772-1889 tlswk1000@hanmail.net
April 8, 2014 March 30, 2015 April 3, 2015

Abstract

This study was conducted to evaluate the effect of long-chain fatty acids on 48 h in vitro rumen fermentation and methane production. A Holstein cow, surgically fitted with a ruminal cannula, consuming 0.40 Italian ryegrass and 0.60 corn-based concentrate was used as rumen fluid donor. Experiment was incorporated with a control, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, and arachidonic acid. Ground timothy hay was used as a substrate and control received only excipients. Final pH was higher (p<0.05) for oleic acid and linoleic acid compared with control and arachidonic acid. Total gas production was highest (p<0.05) for stearic acid and methane production was highest (p<0.05) for arachidonic acid at 48 h. in vitro DM digestibility was higher (p<0.05) for linoleic acid than for control and stearic acid at 36 h. Total volatile fatty acid (VFA) and butyrate concentrations were higher (p<0.05) for control than long-chain fatty acid treatments at 3 and 12 h. acetic acid concentration was higher (p<0.05) for linoleic acid and linolenic acid than the other treatments at 3 and 12 h. propionic acid concentration was higher (p<0.05) for stearic acid and oleic acid at 3h, whereas at 12 h incubation oleic acid and arachidonic acid were higher (p<0.05) compared with the other treatments. acetic acid:propionic acid ratio was higher (p<0.05) for linoleic acid and arachidonic acid compared with control, stearic acid, and oleic acid. The number of live and dead protozoa was not different (p>0.05) among treatments. The number of bacteria was higher (p<0.05) for linolenic acid and arachidonic acid than the other treatments. The number of fungi was higher (p<0.05) for oleic acid than the other treatments except for linoleic acid. Considering all results in this study, the addition of 0.001% oleic and linoleic acids to reduce methane production for 48 h in vitro incubation may be effective.


Long-chain fatty acids의 첨가가 in vitro 반추위 미생물 수, 소화율 및 메탄생성에 미치는 영향

이 신자1, 오 다솜2, 김 도형3, 옥 지운2, 이 수경1, 임 정화2, 이 성실1*
1경상대학교 농업생명과학연구원
2경상대학교 응용생명과학부(BK21)
3한국생명공학연구원

초록

본 연구는 long-chain fatty acids 첨가 시 발효 48 h 에 in vitro 반추위 발효와 메탄 생성에 미치 는 영향을 구명하고자 수행하였다. 반추위액은 외과적 방법으로 누관이 장착된 홀스타인에서 채취하였 으며, 공시축의 사양관리는 조사료와 농후사료 6:4 비율로 하였다. 60 mL serum bottle 에 buffer 10 mL, 티모시 0.3 g, 위액 5 mL 를 각각 넣고 fatty acids(stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid ; 0.001%/15 mL)를 첨가한 뒤 발효시간대별(3, 6, 12, 24, 36 및 48 h)로 5 처리 3 반복 수행하였다. 발효종료시간인 48 h 에서 pH 는 oleic acid 와 linoleic acid 는 대 조구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높게 측정되었다. 48 h 에 총가스 발생량은 stearic acid 가 유의적 (p<0.05)으로 높게 측정되었고 메탄 발생량은 arachidonic acid 에서 유의적(p<0.05)으로 높게 측정되 었다. 건물 소화율은 발효 36 h 에서 linoleic acid 가 다른 처리구에 비해 높았으나, 발효 48 h 에서는 처리구간 유의차가 없었다. 휘발성 지방산 농도와 butyric acid 는 발효 3 h, 12 h 에서 long-chain fatty acid 처리구가 대조구에 비해서 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 3 h, 12 h 에서 acetic acid 는 linoleic acid, linolenic acid 가 다른 처리구보다 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났고, propionic acid 는 stearic acid, oleic acid 에서 다른 처리구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높게 측정되었다. Protozoa 의 생존 수와 사멸 수는 처리구간의 차이를 나타내지 않았다. Bacteria 는 linolenic acid 와 arachidonic acid 가 다른 처리구에 비해 유의적(p<0.05)으로 높았다. Fungi 는 oleic acid 가 linoleic acid 를 제외한 나머지 처리구에서 유의적(p<0.05)으로 높게 측정되었다. 본 연구의 결과에 의해 발효 48 h 에 0.001%의 oleic acid 와 linoleic acid 의 첨가는 메탄 발생량을 감소시키는데 효과적이라는 것 을 알 수 있었다.


    Rural Development Administration
    PJ00928903

    I.서론

    이산화탄소와 메탄은 지구 온난화의 주범으로 잘 알려져 있으며 특히 메탄의 경우, 이산화탄소보다 약 21배정도 높은 악영향을 미친다고 알려져 있다 (IPCC, 2000). 반추동물에서 메탄은 섬유소 등 구 조 탄수화물을 발효될 때 생성되는데, 이는 체내에 흡수되지 못하고 트림의 형태로 외부로 유출되기 때문에 지구 온난화에 악영향을 미칠 뿐만 아니라 사료 에너지 손실을 야기 시키기도 한다(Holter & Yong, 1992). 이에 많은 학자들은 반추위 발효에 의해 생성되는 메탄을 감소시키고자 노력하고 있 다. 그 중 지방을 이용한 메탄 억제 연구는 반추위 곰팡이에 의해 생성된 수소가 섬유질 발효 후 나온 탄소와 결합하는 것이 아니라 불포화지방산과 결합 하여 포화지방산으로 전변되는 과정에 소모되어 메 탄이 감소한다고 보고되었으며(Czerkawski, 1984), 불포화 지방산의 농도가 증가하면 반추위 내의 발 효를 억제시키고 반추위 미생물에 독성을 일으키기 때문에 불포화 지방산의 함량을 감소시킬 수 있는 방향으로 반추위내 대사 과정이 조정되어야 한다 (Jenkins, 1993). Hanaki et al.(1981)은 지방이나 기름을 반추동물에게 급여하였을 때 가수분해로 인 하여 불포화지방산이 생성되고 이는 반추위에서 생 성된 수소를 biohydrogenation에 의해 메탄균과 수소경쟁으로 포화지방산을 생성하게 되어 메탄 형 성 억제에 도움을 준다고 하였다. 또한, 지방의 종 류와 형태는 반추위 발효에 영향을 미치며, 불포화 지방산은 포화지방산 보다 반추위 발효를 억제시 킨다고 보고되었고(Palmquist & Jenkins, 1980; Chalupa et al., 1984), 불포화지방산 중 cis isomers 가 trans isomers 보다 메탄 생성균 억제에 효과 가 크다고 보고되었다(Demeyer & Henderickx, 1967). 따라서 본 연구는 포화지방산인 stearic acid와 cis isomers 불포화지방산인 oleic acid, linoleic acid, linolenic acid 및 arachidonic acid 를 이용하여 in vitro 반추위 발효성상, 미생물 수, 소화율 및 메탄생성에 미치는 영향을 구명하고자 수행하였다.

    II.재료 및 방법

    2.1.공시동물 및 위액채취

    반추위액은 순천대학교 부속농장에서 사육중인 반 추위 누관이 장착된 체중 650 kg의 Holstein으로부 터 채취하였으며, 공시축의 사양관리는 조사료와 배 합사료를 6:4 비율로 체중의 3%되는 양을 1일 2회 (06:00, 16:00) 분할 급여하였고, 물은 자유섭취토 록 하였다. 반추위액은 오전사료 급여 3시간 후 반 추위 누관을 통하여 2겹의 cheese cloth로 여과하여 CO2가스로 충진 된 2 L 유리병에 채취하였으며, 1 시간 정치 후 vacuum 펌프로 부유된 사료 입자를 완전히 제거 후 상층액을 시험에 사용하였다.

    2.2.공시시료 및 시험방법

    공시시료는 70℃ drying oven에서 24시간 건조 시킨 티모시를 2 mm Screen이 장착된 Wiley mill 로 분쇄하여 기질로 이용하였다. 60 mL serum bottle에 혐기상태의 McDougall buffer 10 mL, 티 모시 0.3 g, 위액 5 mL를 각각 넣고, 각각의 처리 구에 따라 0.001% / 15 mL)의 농도로 Stearic acid (C18:0), Oleic acid(C18:1), Linoleic acid(C18:2), Linolenic acid(C18:3), Arachidonic acid(C20:4) 를 첨가하여 39℃ shaking incubator (Jeio Tech, SI-900R; 120 rpm)에서 발효시간별(3, 6, 12, 24, 36 및 48 h)로 대조구를 포함한 6처리 3반복 108개 의 serum bottle로 in vitro 시험을 수행하였다.

    2.3.조사항목

    각 발효시간대별로 serum bottle을 shaking incubator에서 꺼내어 상온에서 20분 방치시킨 후 pH, 총 가스 발생량, 메탄 발생량, 건물소화율, VFA 농도, 미생물성장량을 측정하였다.

    2.3.1.pH의 변화

    pH는 가스 발생량 측정 후 serum bottle의 aluminum seal과 butyl rubber를 제거한 후 각 발 효시간대별(3, 6, 9, 12, 24, 36 및 48 h)로 pH meter (Mettler Toledo, MP-230, Switzerland)를 이용하여 측정하였다.

    2.3.2.총 가스 및 메탄 발생량

    총 가스발생량은 water displacement apparatus 를 이용하여 측정하였으며(Ferorak & Hrwdey, 1983), 메탄은 vaccutainer에 4 mL의 가스를 채취 한 후 porapak NQ column(Q 80-100 mesh)이 장 착된 GC(Gas Chromatography; Shimadzu, GC- 2010, Tokyo)를 이용하여 측정하였다. GC 분석 시 기계 조건은 oven temperature 80℃, injector temperature 100℃, FID(Flame ionization detector) temperature 110℃로 하였으며, total run time은 3분이었고, carrier gas로는 헬륨과 수소를 이용하 였다.

    2.3.3.건물소화율

    In vitro 건물 소화율은 Moore (1970)의 방법으 로 측정하였으며, filter paper의 무게를 측정하고 그 후 배양액 내 소화되지 않은 기질만 거른 후 7 0℃ drying oven에서 24시간 건조시킨 다음 아래 공식으로 구하였다.

    건물소화율 % = 발효 전 건물 무게–(여과 후 남은 무게–  blank ) 발효 전 건물 무게 × 100

    2.3.4.VFA(volatile fatty acid) 측정

    발효 후 60 mL serum bottle에서 위액 5 mL 채취 후 HgCl2 0.05 mL, H3PO4 1 mL, pivalic acid 0.2 mL를 첨가하여 4℃에서 30분간 정치시킨 후 원심분리(3000 rpm, 20 min)후 상층액을 취하 여 2 mL vial에 옮겨 총 가스 및 메탄발생량 측정 과 동일한 방법인 GC(Gas Chromatography; Varian, CP-3800, USA)로 분석하였다 (Erwins et al., 1961).

    2.3.5.반추위미생물(bacteria, protozoa 및 fungi) 수의 측정

    반추위 bacteria는 Dehority's artificial medium (Dehority et al., 1967)에서 roll tube방법(Hungate, 1966)으로 혐기배양 후 colony 수를 측정하였다. Fungi는 Lowe's media(Lowe et al., 1985)에 배양 시킨 후, thallus 생성수를 측정하였다. Protozoa의 수는 살아있는 protozoa (living cell)와 죽은 protozoa(dead cell)를 구분하여 측정하기 위해 TBFS용액(trypan blue-formalin-salin; 증류수 90 mL, 35% formaldehyde 용액 10 mL, trypan blue 2 g, NaCl 8 g; dark blue 용액으로 living cell의 핵을 염색)으로 염색한 다음 Abe et al.(1972)의 방 법에 따라 plankton counter glass를 이용하여 현 미경하에서 측정하였다.

    2.4.통계처리

    본 시험에서 얻은 결과들은 SAS(Statistical Analysis System) 통계 package(1996)의 General Linear Model procedure를 이용하여 분산분석을 하였고, Duncan의 다중검정방법으로 평균 간의 유 의성을 검정하였다.

    III.결과 및 고찰

    3.1.pH 변화

    배양액의 pH는 in vitro 발효 종료시간(48 h)에 서 탄소수가 많은 arachidonic acid 첨가구가 가장 낮았으며(p<0.05), oleic acid와 linoleic acid가 6.20으로 대조구와 arachidonic acid에 비해 유의 적(p<0.05)으로 높게 나왔다. 반추위내 pH가 낮아 져 미생물의 활동이 둔화되고 반추위내 서식하는 박 테리아 중 pH에 매우 민감한 cellulolytic bacteria 는 pH 6.2 이하일 때 성장이 억제되고 주요 기질로 사용되는 섬유소의 소화는 pH 6.8에서 적당하다고 한다(McCullough, 1973). Maeng et al.(1991)은 미 생물의 성장과 glucose 및 cellobise의 소화율의 최 적 pH는 6.4~6.6 범위라고 하였다. 본 시험에서 발 효시간 동안 대조구와 처리구들의 pH는 6.07~6.72 범위인 것으로 보아 정상적인 범위라고 할 수 있다.Table .1

    3.2.총 가스 및 메탄발생량

    총 가스 발생량은 발효종료 시간대(48 h)에 불포 화지방산인 stearic acid에서 가장 많이 발생하였으 며(Table 2), pH가 높았던 oleic acid 처리구는 linoleic acid를 제외한 다른 처리구에 비해 유의적 으로(p<0.05) 낮게 발생되었다. Hwang et al. (2000)은 불포화지방산 중에서 arachidonic acid가 가장 낮은 가스발생량을 나타내었고, 그 다음 linoleic acid가 낮은 발생량을 나타내었고, Jenkins & palmquist(1982)은 불포화지방산의 첨가가 반추위 메탄 생성균에 직접적인 독성효과를 일으키기 때문 에 총 가스 발생량이 줄어든다고 하였다.Table.3

    많은 arachidonic acid에서 15.43 mL으로 가장 높 게 나왔으며, pH가 가장 높았던 oleic acid와 linoleic acid에서 각각 11.21 mL, 11.95 mL로 가장 낮게 나타났다(p<0.05). 이는 불포화도가 높을수록 메탄을 억제하는 효과가 크다고 보고한 Jalc et al. (2007)의 보고와는 상의한 결과를 보인다. 또한, Czerkawski et al.(1966)은 long-chain unsaturated fatty acids를 첨가하면 H2 수용체를 제공하기 때문 에 메탄이 억제된다고 보고하였으나, 본 실험에서의 0.001%의 arachidonic acid 첨가는 반추위에서 메 탄가스 발생을 억제하기에는 부족한 수준으로 사료 된다. 왜냐하면 반추위 발효 후 생성되는 총 H2 중 단 1% 만이 biohydrogenation 과정에 영향을 미치 기 때문에(Czerkawski et al., 1966) 지방의 첨가 수준은 biohydrogenation에 크게 영향을 미치는 것 으로 생각된다(Johnson et al., 2002).

    3.3.VFA 생성량

    Long-chain fatty acids를 첨가한 시료의 VFA 농도를 측정한 결과는 Table 4와 같다. 총 VFA의 농도는 두 배양시간(3, 12 h)에서 대조구가 가장 높 았다. 각각의 VFA의 농도 변화를 보면 먼저 acetic acid의 경우 3 및 12 h에서 각각 linoleic acid 와 linolenic acid가 유의적(p<0.05)으로 가장 높았다. Propionic acid 농도는 3 h에서 각각 stearic acid 와 oleic acid 처리구, 12 h에서 oleic acid와 arachidonic acid 처리구가 유의적(p<0.05)으로 높 았다. 따라서 linoleic acid의 경우 메탄생성은 감소 하였지만, propionic acid의 농도의 증가가 없는 것 으로 보아 biohydrogenation 외에 다른 요인이 작 용하였을 것이라 사료된다. 반면, acetic acid: propionate 비율에 있어서는 대조구, stearic acid, oleic acid 처리가 linoleic acid와 arachidonic acid 처리구에 비해 낮게 나타났다(p<0.05).

    3.4.건물소화율

    Long-chain fatty acids를 첨가한 시료의 건물소 화율은 Table 5와 같다. 발효 36 h의 건물소화율은 linoleic acid가 control과 stearic acid에 비해 높 게 나타났으나(p<0.05), 발효 48 h에서는 처리구간 유의적인 차이를 보이지 않았다(p>0.05). 사료에 불 포화지방산을 첨가하면 건물 소화율이 감소되고 불 포화지방산은 반추위 박테리아에 독성으로 작용될 수 있는 등 반추위 발효에 악영향을 미친다는 보고 가 있으나(Hwang et al., 2000; Czerkawaski & clappeerton, 1984), Sutton et al.(1983)은 불포화 지방산을 많이 함유한 linseed oil과 포화지방산을 많이 함유한 coconut oil을 비교하였을 때 건물 소 화율에 상당한 영향을 주지 않는다고 보고하였다. 또한 long-chain fatty acids의 첨가는 반추위 섬 유소 분해율을 상당히 저해한다는 보고가 있지만 (Johnson & Johnson, 1995), 본 시험에서는 stearic acid 처리구를 제외한 모든 처리구에서 대조구보다 건물 소화율이 높은 경향을 나타내었다(36 h). 건물 소화율의 경우, 기질의 종류, 첨가수준, 전체 영양 소 함량 등에 영향을 받을 수 있으므로 가스나 메탄 발생량은 낮았지만 건물 소화율이 높았던 처리구에 대한 추가적인 연구가 요구된다.

    3.5.반추위 미생물수 변화

    Long-chain fatty acids를 첨가한 시료의 반추위 혼합 미생물 수 변화는 Table 6와 같다. Bacteria의 경우 linolenic acid와 arachidonic acid 처리구에 서 높았으며(p<0.05), protozoa는 live와 dead와 상 관없이 처리구간 유의적인 차이가 없었다(p>0.05).

    Fungi의 경우 oleic acid 처리구는 linoleic aicd를 제외한 다른 처리구들에 비해 높게 나타났다 (p<0.05). Zhang et al.(2008)in vitro 실험에서 stearic acid를 첨가하였을 때 대조구에 비해 protozoa 수가 감소한다고 하였으며, 지방산의 불포 화도가 높을수록 protozoa 수가 감소한다고 보고하 였다. 반추동물에서 지방의 첨가는 methanogen (Prins et al., 1972)과 protozoa(Broudiscou et al., 1990)에 독성효과를 가지고, C18 unsaturated fatty acid이나 C18 unsaturated fatty acid가 다량 함유된 oil의 첨가는 반추위 protozoa를 억제시킨다 고 보고되었다(Hristov et al., 2004). 반면, C18 saturated fatty acid는 반추위 protozoa 억제에 거의 효과가 없다(Dohme et al., 2001). 하지만 본 시험에서는 C18 long-chain fatty acid를 0.001% 첨가하였을 때 protozoa에 억제효과를 나 타내지 않은 것은, 아마 일반적인 in vitro system 에서는 protozoa의 활력이 많이 떨어지기 때문에 protozoa의 활력에 기인한 결과로 사료된다. 따라 서 본 연구는 추후 추가적인 연구가 요구된다.

    Figure

    Table

    Effects of supplementary long-chain fatty acids on the pH of media in vitro

    abcabcMean with different superscripts in the same column differ significantly (P<0.05).
    1)SEM: Standard error of the mean

    Effects of Supplementary long-chain fatty acids on total gas production in vitro (ml/g substrate)

    abcMean with different superscripts in the same column differ significantly (P<0.05).
    1)SEM: Standard error of the mean

    Effects of supplementary long-chain fatty acids on methane production in vitro (mM)

    abcMean with different superscripts in the same column differ significantly (P<0.05).
    1)SEM: Standard error of the mean

    Effects of long-chain fatty acids on volatile fatty acid (VFA)

    abcdMean with different superscripts in the same column differ significantly (P<0.05).
    1)SEM: Standard error of the mean

    Effects of supplementary long-chain fatty acids on dry matter degradability in vitro (%)

    abcMean with different superscripts in the same column differ significantly (P<0.05).
    1)SEM: Standard error of the mean

    Microbial population of the anaerobic media added long-chain fatty acids after 12 h incubation

    Mean±standard error.
    1)colony formation unit/ml.
    2)thallus formation unit/ml.
    abMeans with different super scripts in the same column differ significantly(p<0.05).

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