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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.48 No.3 pp.227-234
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2014.48.3.227

Determination of Flavonoids in the Peel of Jingyul (Citrus sunki Hort. ex Tanaka) using a HPLC-MS/MS and the Antioxidant Activity

Eun Ae Yu1, Hae Gyeong Kim1, Yi Song1, Gon-Sup Kim2, Jae Hoon Kim3, Do Yeon Kim4, Jong Sung Jin4, Soo Jung Lee5, Nak Ju Sung5, Sung Chul Shin1*
1Department of Chemistry and Research Institute of Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, 660-701, Korea
2Research Institute of Life Science, College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, Jinju, 660-701, Korea
3Faculty of Biotechnology, Citrus Genetic Resources Bank, College of Applied Life Science, Jeju National University, Jeju, 690-756, Korea
4Division of High Technology Materials Research, Busan Center, Korea Basic Science Institute (KBSI), Busan, 618-230, Korea
5Department of Food and Nutrition, Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Korea
Corresponding Author: Sung Chul Shin, Tel: +82-55-772-1484, Fax: +82-55-772-1489, E-mail: sshin@gnu.ac.kr
April 30, 2014 June 8, 2014 June 18, 2014

Abstract

The peel of citruses is an important flavonoid source and used as folk medicines. In this work, 9 flavonoids in Jingyul (Citrus sunki Hort. ex Tanaka) peel were characterized using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Hydroxypentamethoxyflavone and dihydroxytetramethoxyflavone were identified in the Jingyul for the first time. Antioxidant capacities were evaluated in the concentration range of 25~500 mg/L in terms of DPPH·, ABTS·+, NO· scavenging and reducing power by FRAP. The antioxidant activities of total flavonoids increased dose-dependantly.


HPLC-MS/MS를 이용한 진귤(Citrus sunki Hort. ex Tanaka) 과피의 플라보노이드 성분 분석 및 항산화 활성

유 은애1, 김 해경1, 송 이1, 김 곤섭2, 김 재훈3, 김 도연4, 진 종성4, 이 수정5, 성 낙주5, 신 성철1*
1경상대학교 화학과∙생명과학연구원
2경상대학교 수의과대학∙생명과학연구원
3제주대학교 생명자원과학대학 생명공학부
4기초과학지원연구원 부산센터
5경상대학교 식품영양학과∙농업생명과학연구원

초록

감귤류 과피는 플라보노이드의 중요 급원 중의 하나로 아시아에서 민간 의약품으로서 오래전부터 사용되어 왔다. 본 연구에서는 진귤(Citrus sunki Hort. ex Tanaka) 과피에서 HPLC-MS/MS를 이용하 여 9종의 플라보노이드 성분을 동정하였으며, hydroxypentamethoxyflavone과 dihydroxytetramethoxyflavone은 진귤에서 처음으로 확인되었다. 총 플라보노이드의 항산화 활성은 25~500 mg/L 의 농도범위에서 DPPH·, ABTS·+, NO· 소거능 및 환원력에 의해 측정되었으며, 시료의 첨가량이 많 아짐에 따라 항산화 활성은 유의적으로 증가하였다.


    National Research Foundation of Korea
    No.2012R1A2A2A 06045015

    I.서론

    플라보노이드는 phenylbenzo-γ-pyrone의 유도 체로서 자연계에 폭넓게 분포되어 있는 이차 대사체 의 일종이다. 최근의 여러 연구들을 통해 식물 플라 보노이드 성분이 강한 항산화 작용을 가지며 인체에 서 건강 향상에 도움이 된다는 사실이 입증됨으로써 과일 및 채소의 플라보노이드 성분에 대한 관심은 더욱 증가되고 있다. 플라보노이드성 물질은 암, 혈 전, 고지혈증, 만성 폐색성 폐질환 및 심장질환 등의 만성 질환의 감소에 효과적이며(Erlund, 2004; Marchand, 2002), 스트레스 예방효과, 곤충의 유인 물질, 초식동물 및 질병에 대한 방어물질과 같은 생 리활성 성분으로써 식물 자체에도 유익한 작용이 있 는 것으로 알려져 있다(Treuter, 2006). 더욱이 이 러한 플라보노이드 성분은 질병에 대한 저항성이 증 대된 새로운 작물에 대한 품종 개량을 위한 프로그 램 개발에 이상적인 수단으로 이용될 가능성도 있는 것으로 보고되고 있다(Benavente-Garcí a et al., 1997).

    감귤류는 플라보노이드 성분의 대표적인 급원 중 의 하나로 감귤류의 가식성 부위에 대한 플라보노이 드 성분의 분리 및 동정에 관한 연구는 오래전부터 수행되어 오고 있으며, 약 60여종 이상의 플라보노 이드 구조가 밝혀져 있으나, 아직도 다양한 품종의 감귤류 플라보노이드 성분에 관한 연구는 미흡한 상 태이다(Kim et al., 2009; Barreca, 2011). 특히 감 귤류의 플라보노이드 성분에 관한 연구는 대부분이 hesperidin, naringin 등의 분석에 국한되어 왔으며 (Rhyu et al., 2002), 감귤류의 flavone 중 polymethoxyflavone류는 다른 과일이나 채소에 거 의 존재하지 않는 감귤류 특유의 성분으로 혈소판 응집억제(El-Shafae, 2002), 암세포에 대한 세포독 성 활성(Hirano et al., 1995)이 있다는 보고가 있 다. 우리나라에서는 제주산 감귤 14종의 착즙액에 대한 polymethoxyflavone류 연구(Kim et al., 2009)가 있을 뿐 감귤류 과피에 대한 연구는 미미한 실정이다.

    최근 12종의 우리나라 토종 감귤류 중 Citrus leio carpa Hort. et Tanaka, Citrus aurantium L., Ci trus erythrosa Hort. ex Tanaka 및 Citrus tange rina Hort. ex Tanaka의 과피에서 21종의 극성성분 (naringin, hesperidin, naringin dehydrated hexo side, hesperidin dehydrated hexoside, poncirin, meranzin, pentahydroxymethoxyflavone, isomera nzin, isosinensetin, hexamethoxyflavone, sinens etin, tetramethyl-O-isoscutellarein, nobiletin, heptamethoxyflavone, tangeretin, hydroxypenta methoxyflavone, hexamethoxyflavone, naringeini n 7-O-(O-acetyl)glucosylrhamnoside, dihydroxy methoxyflavonone-O-rutinoside 및 hydroxyhexa methoxyflavone)이 처음으로 확인된 바 있다(Kim e t al., 2012; Yu et al., 2014).

    본 연구에서는 선행연구에 이어서 제주 자생의 감귤 중 예부터 주요 한약재 소재로써 소화불량, 메스꺼움, 이뇨작용 및 비장의 기능 강화 등에 사 용되어온‘진피’로 알려진 진귤(Citrus sunki)의 과피로부터 플라보노이드 성분을 HPLC-MS/MS로 분석하고 문헌상 비교를 통하여 동정하였다(De Rijke et al., 2006). 또한 진귤의 과피로 부터 얻 은 총 플라보노이드 성분의 항산화 활성을 측정하 므로써 진귤의 기능성 소재로써 활용 가능성을 알 아보고자 하였다.

    II.재료 및 방법

    2.1.시료

    성숙한 진귤(C. sunki)은 제주대학교 감귤류 유전 자원 은행으로부터 2009년 11 월에 수확한 시료를 제공받았다. 과일의 표면을 흐르는 물에 세척한 후 물기를 제거한 후 껍질 부위만 채취하여 동결건조 (PVTED50A, Ilsin Bio Base Co. LTD., Yangu, Korea)한 후 –70°C의 동결고에 보관해 두고 실험에 사용하였다.

    2.2.플라보노이드의 추출 및 정제

    동결건조된 진귤의 과피를 분쇄시켜 5 g을 정평하 여 70% 메탄올을 가하여 voltamix (G560E, Scienti fic Industries Inc., Bohemia, NY, USA)로 2분간 추출한 다음, 초음파 수조(Bransonic 3510R-DTH, Branson Ultrasonics Corporation, Banbury, US A)에서 10분간 더 추출하였다. 이를 2회 반복한 다 음, 추출액을 모아 3200 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 상등액을 회수하여 회전식 진공 증발기(Eyel a NVC-2100, Tokyo Rikakikai Co. Ltd. Tokyo, Japan)로 농축한 다음 1 mL의 메탄올로 재용해하여 Silica cartridge(1.7×2 cm)에 적재하였다. 여기에 5 mL의 헥산 및 에틸아세테이트를 차례로 가하여 총 플라보노이드 성분을 얻었다. 이를 최종적으로 1 mL의 메탄올에 재용해하여 0.45 μm cellulose me mbrane에 통과시킨 다음 -20°C에 보관해두고 실험 에 사용하였다.

    항산화 활성 측정은 상기의 총 플라보노이드 성분 을 회전식 진공 증발기로 완전 건조한 후, 이를 70% 메탄올에 일정 농도(25, 50, 100, 250 및 500 mg/L)로 재용해하여 사용하였다(Kim et al., 2012). 이때 시료의 추출 수율은 0.31%였다.

    2.3.HPLC-ESI-MS/MS 분석

    HPLC 분석은 G1322A degasser, G1312A pump, G1313 autosampler 및 G1316A oven이 장착된 1100 series chromatography system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하여 수 행되었다. 크로마토그래피 상의 분리는 Zorbax Stable Bond Analytical SB-C18 컬럼 (4.6×250 mm, 5 μm, Agilent Technologies, MD, USA)으 로 수행되었다. 용매 시스템은 0.1% formic acid (A)와 methanol/acetone (1:1) (B)로 이루어졌으며 처음 10분간 0~25% B, 10분간에 걸쳐 B를 70%로 증가시켰으며 다음 30분 동안 같은 용매로 용리한 다음 B를 5분 동안에 25%로 감소시킨 다음 10분 동 안 유지시켰다. 이때 유속은 0.5 mL/min, 컬럼 온 도는 35°C, 시료 주입량은 10 μL였다. 전체 실험에 서 250~600 nm의 데이터를 2 nm의 분해능으로 수 집되었으며 플라보노이드의 분석은 280 nm에서 측 정하였다.

    MS/MS 실험은 Turbo VÔ source와 Turbo Ion Spray probe가 장착된 3200 QTRAP LC/MS/MS 시 스템(Applied Biosystems, Forster, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 질량 스펙트럼은 양이온과 SIM 모드로 수행하였다. BioAnalyst 버전 1.4.2와 소프트웨어 버전 1.4.2를 사용하여 기구조작과 데이 터 수집을 하였다. 이온화 시 고순도 질소 기체를 분무 및 건조 기체로 사용하였으며, 이때 기체 압력 은 각각 45 psi로 설정하였다. 5.5 kV의 이온분무 전압과 500°C의 이온화 소스 온도를 이용하였다. 첫 번째 사중극자와 이온 트랩의 분해능은 0.6~0.8 unit였다. 질량분석 스펙트럼은 0.05 amu의 스텝사 이즈로 50~800 m/z에서 기록되었다.

    Flavonone glycosides의 이온을 설명하기 위해 glycoconjugate 명명법(Domon & Costello, 1988)을 이용하였다(Fig. 1).

    2.4.항산화 활성 측정

    2.4.1.DPPH에 대한 전자공여능 측정

    전자공여능은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydr azyl)에 대한 전자공여 효과로 측정하였다. 즉, 96 well plate에 일정 농도의 시료액 100 μL와 0.00 5% DPPH 용액을 동량으로 혼합하여 실온에서 10분 간 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 비 (%)로 나타내었다(Blois, 1958).

    2.4.2.ABTS 라디칼 소거능 측정

    ABTS [2,2'-azinobis-(3-ethylbenzo-thiazoline -6-sulfonate)] 라디칼을 이용한 항산화능은 potass ium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS 유리 라디칼이 시료 중의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 청록색이 탈색되는 원리를 이용한 방 법이다(Re et al., 1999). 즉, 7 mM ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시 킨 다음 암실에서 12~16시간 동안 반응시켰다. 이를 414 nm에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 조정 한 기질 용액 100 μL에 시료액 50 μL를 가하여 실온에서 10분간 반응시켜 414 nm에서 흡광도를 측 정하여 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 비(%)로 나 타내었다.

    2.4.3.NO 라디칼 소거능 측정

    NO (Nitric oxide) 라디칼 소거능은 시료액 1.2 mL에 5 mM sodium nitroprusside 용액 0.3 mL를 가하여 상온에서 150분간 반응시킨 다음 0.3 mL의 Griess 시약 (2% sulfanilamide/4% H3PO4: 0.2% naphthylethylenediamide=1:1, v/v)을 가한 후 증 류수를 대조하여 542 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 라디칼 소거능은 [1-(시료 첨가구의 흡광도-시 료 자체의 흡광도/무첨가구의 흡광도)] × 100으로 나타내었다(Song and Moon, 2006).

    2.4.4.FRAP법에 의한 환원력 측정

    FRAP (Ferric ion reducing antioxidant power) 평가를 위한 기질용액은 acetate buffer (pH 3.6, 3 00 mM), 10 mM의 TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-tria zine) 용액 및 20 mM의 FeCl3·6H2O 용액을 10:1:1 (v/v/v)의 비율로 실험 직전에 혼합하여 사용하였다. 기질 용액과 시료액을 혼합 한 후 10분간 상온에서 반응시킨 다음 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 환원력은 FeSO4·7H2O를 사용한 표준 검량 선에 따라 표준물질의 당량으로 산출하였다(Benzie & Strain, 1996).

    2.5.통계분석

    모든 실험들은 3회 반복 수행하였으며, 실험결과 는 평균±표준편차로 나타내었다. 차이의 유의성은 one-way analysis of variance using SPSS versio n 12.0을 이용하여 평가하였다. p<0.05의 차이를 유 의성이 있는 것으로 평가하였다.

    III.결과 및 고찰

    3.1.정제 및 구조 확인

    진귤 과피의 플라보노이드 성분은 70% 메탄올로 추출한 후 실리카겔 컬럼 상에서 에틸아세테이트를 가하여 분리하였다. C18 컬럼이 장착된 역상-HPLC, 양이온 모드에서 얻어진 ESI-MS/MS 데이터와 문헌 에 알려져 있는 데이터를 비교함으로써 분리된 플라 보노이드 성분을 동정하였다. 280 nm 검출파장에서 얻어진 10~60분 사이의 부분 크로마토그램은 Fig. 2와 같이 총 9개의 플라보노이드 성분을 분리하였 다. 동정된 9개 성분들의 MS/MS 데이터와 구조를 종합하면 Table 1 및 Fig. 3과 같다. MS/MS 데이 터와 문헌 비교한 결과 플라보노이드 성분이 모두 확인되었으며, 7개 성분은 이미 여러 종류의 감귤류 품종에서도 보고된 바 있다(Li et al., 2004; Shi et al., 2007; Dugo et al., 2000; Wang et al., 2007; Kim et al., 2011).

    본 연구결과에서 처음으로 동정된 두 성분은 3 및 4로 ESI-MS/MS 데이터를 자세히 분석하면 다음과 같다. 플라보노이드 3은 m/z 389에서 [M+H]+ 피크 를 보여주는데 이것은 374[M+H-CH3]+, 359[M+H- 2CH3]+, 344[M+H-2CH3]+, 341, 331[M+H-2CH3- CO]+, 313[M+H-2CH3-CO]+, 211[1,3A0+H]+, 151[0, 2B0]+으로 토막났다. 이와 같은 토막나기 양상으로부 터 3은 hydroxypentamethoxyflavone으로 동정되었 다. 플라보노이드 4는 m/z 375에서 [M+H]+을 보여 주는데 이 양이온은 360[M+H-CH3]+, 345[M+H-2 CH3]+, 314[M+H- 2CH3-OCH3]+, 299[M+H-3CH3 -OCH3]+, 271[M+H-3CH3-OCH3-CO]+, 166, 165 [0,2B+H]+으로 토막났다. 이와 같은 토막나기 양상으 로부터 4는 dihydroxytetramethoxyflavone으로 동 정되었다.

    3.2.항산화 활성

    진귤(C. sunki) 과피로부터 얻은 총 플라보노이드 화합물의 항산화 활성을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 25~500 mg/L의 시료 농도범위에서 항산화 활성은 시료의 첨가량이 많아짐에 따라 유의적으로 증가하는 경향이었으나, DPPH 및 ABTS 라디칼 소 거 활성은 500 mg/L의 농도에서도 50%이하의 소거 활성에 불과하였다. NO 라디칼 소거활성은 250 mg /L의 농도에서 90%이상의 소거활성을 보였으며, 5 0%의 소거활성을 위한 시료액의 농도는 114.25 mg/ L였다. 환원력은 500 mg/L의 농도에서 58.77 mmo L의 활성을 보였으며, 표준물질로써 FeSO4·7H2O의 50 mmoL에 해당되는 시료액의 농도는 326.71 mg/ L였다.

    식물 플라보노이드 화합물은 superoxide anion 라디칼, 과산화수소 및 하이드록시 라디칼 등의 활 성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 효과 적으로 제거하기 때문에 인체 건강에 유익한 항산화 제로 알려져 있다(Lee et al., 2011). 더욱이 ROS는 단백질, 핵산, 지질 등으로 구성된 세포막과 같은 여 러 조직에 산화적 손상을 일으킬 수 있으므로(Apel & Hirt, 2004) 식물류의 항산화 활성 평가는 생체 내 산화적 손상의 예방 측면에서 가치가 있는 것으 로 볼 수 있다.

    제주 감귤인 진귤, 온주밀감 및 하귤 과피의 항산 화 활성을 비교한 연구에 의하면 총 페놀 함량은 진 귤에서 가장 높았으나, 총 플라보노이드 함량은 오 히려 가장 낮았으며, 이에 따른 라디칼 소거활성도 진귤에서 가장 낮았다고 보고된 바 있다(Hyon et a l., 2010). 수종의 감귤류 착즙액에서 플라보노이드 함량은 수확시기가 늦어질수록 점차 감소되었으며, 진귤 착즙액 중 5종의 polymethoxyflavone류는 모 두 0.1 mg/100 mL이하의 낮은 함량이었으나, 이들 성분의 수확 시기에 따른 함량차는 작았다고 보고되 어 있다(Kim et al., 2009). 또한 감귤류 과피에서 플라보노이드 함량은 항산화 활성과의 관계에서 플 라본을 비롯한 플라보노이드 성분이 많을수록 항산 화 활성이 높았다는 보고도 있다(Kim et al., 2012).

    Polymethoxyflavone류 중 nobiletin은 활액 섬유 아세포의 증식 조절(Ishiwa et al., 2000), tangeret in은 악성종양으로 전이 억제(Bracke et al., 1994) 에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 연구에 서 진귤 과피로부터 총 9개의 플라보노이드가 HPLC -MS/MS으로 동정되었으며, 총 플라보노이드의 항 산화 활성은 시료의 첨가량에 의존적이었으며, 이는 플라보노이드 성분의 상호작용에 기인된 것으로 생 각된다. 더욱이 새로운 polymethoxyflavone류로 hy droxypentamethoxyflavone(3)과 dihydroxytetram ethoxyflavone(4)의 동정은 여타의 감귤류에 비해 항산화 활성이 낮은 것으로 알려진 진귤에서 항산화 활성 이외의 생리 기능성 제고에 전환점이 될 것으 로 기대된다.

    Figure

    JALS-48-227_F1.gif

    Flavonoid glycoside ion nomenclature according to the nomenclature system proposed in the literature (Domon & Costello, 1988).

    JALS-48-227_F2.gif
    HPLC chromatogram in the peel of Jingyul (C. sunki).

    1, Hesperidin; 2, Isosinensetin; 3, Hydroxypentamethoxyflavone; 4, Dihydroxytetramethoxyflavone; 5, Sinensetin; 6, Tetramethyl-O-isoscutellarein; 7, Nobiletin; 8, Tangeretin; 9, Hydroxypentamethoxyflavone.

    JALS-48-227_F3.gif

    Flavonoid structures identified from the peel of Jingyul (C. sunki).

    Table

    Characterization of flavonoids in the peel of Jingyul ( C. sunki)

    Antioxidant activities of total flavonoids isolated from peel of Jingyul ( C. sunki)

    Each value represents mean±SD (n=3).
    EC50(mg/L) values were calculated from regression lines using five different concentrations (25~500 mg/L) in triplicate and their data were presented as 50% scavenging activity
    *FRAP values were presented by the sample concentration to the 50 mmol of FeSO4 7H2O.
    a-eMeans with different superscripts in the same row are significantly different at p <0.05 by Duncan's multiple range test.
    A-DMeans with different superscripts in the same column are significantly different at p <0.05 by Duncan's multiple range test.

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