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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.48 No.4 pp.241-251
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2014.48.4.241

Nutritional Composition and Antioxidant·Antiacetylcholinesterase Activities of Blueberry (Vaccinium virgatum)

Yu Na Jo, Dong Eun Jin, Ji Hee Jeong, Hyeon Ju Kim, Sung-Gil Choi, Ho Jin Heo*
Division of Applied Life Science, Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Korea
Corresponding Author: Ho Jin Heo, Tel: +82-55-772-1907, Fax: +82-55-772-1909, E-mail: hjher@gnu.ac.kr
March 7, 2014 June 5, 2014 June 25, 2014

Abstract

The nutritional composition, antioxidant, and anti-acetylcholinesterase (AChE) activities of blueberry (Vaccinium virgatum) extract were investigated. A calcium was the most abundant among minerals in blueberry. Amino acids were mainly composed of aspartic acid and glutamic acid. Distribution of fatty acids was 76.78% in saturated fatty acid and 23.21% in unsaturated fatty acid. Vitamin C was 22.48 mg/100 g, and principal free sugars were fructose and glucose. Based on a bioactivity-guided isolation principle, ethanolic extracts of blueberry were fractionated to separate fractions of HCl, ethylacetate, and acidic methanol. Total phenolics were 1.64, 2.31, and 4.45 mg of GAE /g, respectively. Ferric reducing antioxidant power (FRAP) and malondialdehyde (MDA) inhibitory activity of the anthocyanin fraction were increased in a dose-dependent manner. In addition, we examined the effect of various fraction on acetylcholinesterase (AChE) inhibition, and our data showed that the AChE was inhibited by the anthocyanin fraction of blueberry. The results suggest that anthocyanin fraction from blueberry has excellent antioxidant and AChE inhibitory activities.


블루베리의 영양성분 및 항산화·항아세틸콜린에스터레이즈 활성

조 유나, 진 동은, 정 지희, 김 현주, 최 성길, 허 호진*
경상대학교 대학원 응용생명과학부, 농업생명과학연구원

초록

고부가가치 식품 산업에서 블루베리의 산업적 활용 가능성을 확인하고자 주요 영양성분 분석, in vitro 항산화 활성, 그리고 아세트콜린에스터레이즈 (AChE) 효소 저해 활성을 연구하였다. 블루베리에 포함된 주요 미네랄 중 칼슘이 가장 풍부한 것으로 분석되었고, 아미노산은 주로 aspartic acid와 glutamic acid로 구성 되었다. 지방산의 분포는 76.78%의 포화지방산과 23.21%의 불포화 지방산으로 구성되었으며, vitamin C는 22.48 mg/100 g으로 분석되었고 주요 유리당으로서는 과당과 포도당이 검 출되었다. 생리적인 활성 효과를 확인하고자 블루베리의 에탄올 추출물을 염산, 에틸아세테이트, 그리 고 산성메탄올을 이용하여 분획하였다. Total phenolics 함량은 각각 1.65, 2.31 그리고 4.45 mg of GAE / g 어었으며, in vitro 항산화 효과로서의 FRAP assay와 MDA 생성 저해 효과는 안토시아닌 분 획물에서 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 에탄올 추출물, 비 안토시아닌 분획물 그리고 안토시아닌 분획물에서 모두 AChE 활성을 억제하는 것으로 나타났으나, 특히 블루베리의 안토시아닌 분획물에 의 해 억제되는 양상이 우수한 것으로 확인되었다. 결과적으로 다양한 영양성분을 포함하는 블루베리의 안 토시아닌 분획물은 우수한 in vitro 항산화 효과와 AChE 저해 활성을 가지는 것으로 확인되었다.


    National Research Foundation of Korea
    KRF-2011-0021664
    Korea Forest Service
    2013-자유10

    I.서론

    최근 들어 현대의학과 문명의 발달로 인간의 평균 수명은 점차 증가되고 있으나 여러 가지 환경오염과 영양소의 과다섭취, 흡연 및 음주로 인체 내외의 많 은 요인들이 건강을 위협하고 있다. 이러한 요인들 에 의해 생성되는 활성산소종(reactive oxygen species)은 불안정하고 산화력이 높아 생체물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스(oxidative stress)를 유발하게 된 다. 이러한 산화적 스트레스는 지질과산화를 유도하 고 다양한 조직의 세포를 손상시켜 뇌졸중, 암, 동 맥경화, 알츠하이머병, 파킨슨 병 등의 질병을 유발 하게 된다(Jeong et al., 2008; Parfenova et al., 2006). 과일과 채소 등이 함유하고 있는 항산화 물 질인 비타민 C, 토코페롤, 카로테노이드와 같은 비 타민과 비타민 전구체는 인체의 산화적 손상을 감소 시키는데 도움을 주며, 이는 임상 역학 연구에서 과 일이나 채소의 소비가 심장질환, 암, 관절염, 노화 과정 등의 위험한 질병을 감소시키는 것과 연관이 있는 것으로 보고되고 있다(Criqui & Ringel, 1994; Lolger, 1991).

    퇴행성 치매의 가장 일반적인 형태인 알츠하이머 성 치매(Alzheimer’s disease)는 점진적으로 뇌의 여러 조직에 존재하는 뇌신경세포가 죽거나 학습, 기억 및 기타 인지능력 등의 저하가 특징이다 (Chen et al., 2013). 알츠하이머성 치매 환자의 뇌 신경세포는 산화적 손상 등에 의해 파괴되고 신 경전달물질인 acetylcholine (ACh)의 함량은 정상 인의 뇌보다 매우 감소된 것으로 보고되고 있으며, 이에 따른 치매환자의 인지기능을 개선하는 용도로 acetylcholine성 신경세포의 기능을 강화시켜줄 수 있는 acetylcholinesterase (AChE) 저해제로서의 많은 의약품이 개발되어 시판되고 있으나, 지금까지 사용되어 오고 있는 AChE 저해 관련 치료제들은 수 많은 부작용이 동반된다고 알려져 있어 천연물 유래 AChE 저해제를 찾고자 하는 연구가 활발하게 이루 어지고 있다(Heo et al., 2001).

    블루베리는 진달래과(Ericaceae) 산앵두나무속 (Vaccinium)에 속하는 관목성 식물로서, 전 세계 적으로 400여종이 있으며, 주로 북미 지역에 분 포되어 있다. 북미에서는 하이부시 블루베리 (Vaccinium corymbosum), 로우부시 블루베리 (Vaccinium myritillus ) 및 래빗아이 블루베리 (Vaccinium virgatum) 등 세 종류가 상업적으로 중요한 과실로서 재배되고 있다(Westwood, 1993). 최근 우리나라에서도 블루베리에 대한 관심이 높아 진 상태이며, 블루베리 과실은 여러 가지 뛰어난 생 체 조절 기능성을 갖는 고품질의 생리활성 소재를 함유하고 있고 각종 성인병을 예방하고 치유하는 훌 륭한 기능성도 지니고 있다는 사실들이 최근 밝혀지 고 있는 추세로 항산화(Su & Chien, 2007), 항당뇨 (Martineau et al., 2006), 활성산소라디칼의 흡수 효과(Magdalini et al., 2009; Zheng & Wang, 2003), 블루베리 품종에 따른 성분의 변화(Connor et al., 2002) 등 많은 연구들이 진행되고 있다. 이 에 반해 블루베리 분획물에 대한 AChE 저해 효과 관련 연구는 상대적으로 미비한 실정이며, 이를 통 한 고부가가치 가공 식품 및 건강기능성 식품 개발 을 위한 산업화 기초 연구가 필요하다고 판단된다.

    따라서 본 연구에서는 래빗아이 블루베리(Vaccinium virgatum, rabbit-eye blueberry)의 영양성분 분석 및 추출물과 분획물의 in vitro antioxidant와 AChE 저해 효과 등을 분석·확인함으로써 고부가가 치 식품 소재로서의 산업적 활용 가능성을 제시하고 자 하였다.

    II.재료 및 방법

    2.1.실험재료 및 추출물의 제조

    본 실험에 사용된 래빗아이 블루베리(V. virgatum, rabbit-eye blueberry)는 2010년 7월 전라남도 고 흥군 포두면의 농업회사법인 한결농수산에서 제공받 아 냉장보관(4°C)하며 사용하였다. 본 실험에 사용 된 시약으로 Folin and Ciocalteau's phenol reagent, gallic acid, ferric chloride, 2,4,6-tripyridyl-S-triazine (TPTZ)는 Sigma- Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 그 외 사용된 용매 및 시약은 모두 일 급 이상의 등급을 사용하였다. 블루베리 용매 분획 물의 조제는 80% 에탄올을 용매로 하여 환류냉각 추출 후 C18 column을 이용하여 카트리지를 활성 시킨 후, 0.01 N 염산, 에틸아세테이트, 산성 메탄 올의 순으로 분획하여 에틸아세테이트층에서 비 안 토시아닌 분획물을 얻었고 산성 메탄올층에서 안토 시아닌 분획물을 얻었으며, 추출물과 각각의 분획물 은 농축하여 -20°C 냉동고에 보관하면서 각 실험에 사용하였다.

    2.2.무기성분 분석

    무기성분 분석은 각 시료 1 g에 분해용액(HClO4 : H2SO4 : H2O2 = 9 : 2 : 5) 25 mL를 가하여 hot plate에서 무색으로 변할 때 까지 분해한 후 100 mL로 정용하여 여과 한 후 Inductively coupled plasma (OPTIMA 4300DV/5300DV, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 분석하였다. 분석 조건 중 RF power는 1,300 W이며, analysis pump flow rate는 1.5 mL/min으로 하였고, gas flows는 plasma: 15, auxiliary: 0.2, nebulizer: 0.8 L/min으로 하여 분석하였다(Jeong et al., 2003).

    2.3.아미노산 분석

    시료 200 mg을 취하여 6 N HCl 용액을 가하고 진공 밀봉하여 heating block (110±1°C)에서 24시 간 동안 가수분해 시킨 후 glass filter로 여과한 여 액을 회전진공농축기를 이용하여 HCl을 제거하고 증류수로 3회 세척한 다음 감압 농축하여 sodium citrate buffer (pH 2.2) 2 mL로 용해한 후 0.22 μm membrane filter로 여과한 여액을 아미노산 자 동분석기(Biochrom 30, Pharmacia Biotech, Cambridge, UK)를 이용하여 분석하였다. 분석에 이용한 column은 ultrapac 11 cation exchange resin (11μm±2μm)를 사용하였고, flow rate와 buffer는 각각 ninhydrin 25 mL/hr와 pH 3.20~10.0으로 하였으며, column 온도와 reaction 온도는 각각 46°C와 88°C로 하였고, 분석시간은 44 분 동안 분석하였다(Jeong & Shim, 2004).

    2.4.지방산 분석

    시료 5 g을 원통여지(Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japen)에 넣고, diethyl ether를 가하여 Soxhlet 추출법으로 약 12시간 연속 추출하여 조지 방을 얻고 이에 0.5 N NaOH-MeOH를 가하여 8 0°C에서 환류 시키면서 가수분해 시킨 후, 14% BF3-methanol 및 n-heptane을 가하여 끓이고 식 힌 후 증류수와 Na2SO4로 탈수, 여과한 용액 1 μL 를 GLC에 주입하였으며, GLC에 의해 분리된 각 지 방산 methyl ester를 peak 면적의 비율로 계산하여 각 지방산의 조성비를 구하였다(Metcalf et al., 1966).

    2.5.유리당, 비타민 C 및 총 페놀성 화합물 함량 분석

    유리당 분석은 시료 2 g에 80% 메탄올 50 mL를 첨가하여 2시간 동안 환류냉각 추출하였다. 추출물 을 여과지(Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japen)로 여과한 후 회전진공농축기(N-N series, EYLYA Co., Tokyo, Japan)로 농축하여 에테르 및 부탄올을 첨가하여 지방과 단백질 성분을 제거한 유 리당 획분을 얻었다. 얻은 유리당 획분을 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 sep-pak C18로 색소 를 제거한 다음 HPLC (1100 series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)로 분석하였 다. Column은 carbohydrate column을 사용하였 고, solvent와 flow rate는 80% acetonitrile과 1.0 mL/min, detector는 Refractive Index detector를 사용하였으며, column 온도와 injection volume은 각각 40°C와 20 μL였다(Jeong et al., 2012).

    비타민 C 분석은 2 g에 20 mL의 10% metaphosphoric acid를 가하여 10분간 현탁시킨 후 적당량의 5% metaphosphoric acid를 넣어 균질화 한 다음 균질화 된 시료를 100 mL mass flask에 합하여 100 mL로 정용한 다음 0.45 μm syringe filter로 여과하여 HPLC (U3000, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)로 분석하였다. Column은 Shiseido C18 (4.6mm× 250mm, 5μm)을 사용하였 고, solvent와 flow rate는 0.05 M KH2PO4 : acetonitrile (60 : 40)과 1.0 mL/min, UV 파장과 injection volume은 각각 254 nm와 20 μL였다(Jo et al., 2012).

    총 페놀성 화합물 함량 분석은 추출물과 안토시아 닌, 비 안토시아닌 분획물 1 mL에 3차 증류수 9 mL를 첨가한 후 Folin & Ciocalteau's phenol reagent 1 mL를 넣고 혼합하여 실온에서 5분간 반 응시켰다. 반응용액에 7% Na2CO3용액 10 mL를 넣 어 다시 혼합한 다음 3차 증류수로 25 mL로 정용 하였다. 이 혼합 용액을 23°C에서 2시간 동안 정치 한 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡 광도는 gallic acid를 이용하여 작성된 검량선으로 총 페놀화합물 함량을 계산하였다(Kim et al., 2003).

    2.6.항산화 활성

    Ferric reducing/antioxidant power (FRAP) assay에 사용되는 시약은 300 mM sodium acetate buffer (pH 3.6)와 2,4,6-tri (2- pyridyl)- 1,3,5-triazine (TPTZ) reagent, 그리고 20 mM FeCl3이며, TPTZ reagent은 10 mM의 TPTZ를 40 mM HCl에 용해시켰다. Acetate buffer, TPTZ reagent 및 FeCl3 solution을 혼합(10 : 1 : 1, v/v/v)하여 37°C에서 10~15분간 incubation 시켰 다. 추출물과 안토시아닌, 비 안토시아닌 분획물 50 μL와 pre-warmed working FRAP reagent 1.5 mL를 혼합하여 15분간 빛이 들지 않는 곳에서 반응 시키고 593 nm에서 흡광도를 측정하였다(Jeong et al., 2010).

    뇌 조직을 이용한 지질과산화 생성물인 malondialdehyde (MDA) 생성 억제활성측정은 다 음과 같은 방법으로 실시하였다. 뇌 부위 조직에 10 volume의 ice cold Tris-HCl buffer (20mM, pH 7.4)에 균질화시킨 후 4°C에서 15분간 12,000xg로 원심분리 하였다. 상등액 0.1 mL에 10 μM FeSO4 0.1 mL, 0.1 mM 비타민 C 0.1 mL 및 추출물과 안 토시아닌, 비 안토시아닌 분획물 0.2 mL를 첨가하 여 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 이 반응액에 28% trichloroacetic acid 0.1 mL를 첨가하여 반응 을 종결시키고, 1% thiobarbituric acid 0.3 mL를 첨가하여 80°C에서 30분간 가열한 후 532 nm에서 흡광도를 측정하였다(Jeong et al., 2013).

    2.7.AChE 저해 활성 및 Enzyme kinetics

    Acetylcholinesterase (AChE) 저해활성 측정은 acetylcholine iodide를 기질로 사용하여 측정하 였다. 효소는 PC12 세포배양액 1 mL에 균질화를 위한 buffer (1 M NaCl, 50mM MgCl2, 1% TritonX-100 혼합액에 10mM Tris-HCl로 pH 7.2로 조정) 5 mL를 첨가하여 Glass-Col homogenizer로 균질화한 후 균질화된 세포배양액 을 10,000 rpm에서 30분 동안 원심 분리하였으며, 그 상징액을 효소실험을 위하여 사용하였다. 모든 추출공정은 4°C에서 수행하였으며, 추출한 효소액의 단백질함량을 측정하기 위하여 Quant-iTTM Protein Assay kit (Invitrogen, St.Oregon, Eugene, USA) 를 이용하여 측정하였다. 정제효소 10 μL에 추출물 과 안토시아닌, 비 안토시아닌 분획물 10 μL를 넣어 37°C에서 15분간 pre-incubation 시킨 후, 반응 혼 합물에 50 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0)에 용해시킨 Ellman's reaction mixture [0.5mM acetylthiocholine, 1mM 5,5'dithio-bis (2-nitro benzoic acid)] 70 μL를 첨가한 후 405 nm에서 10분 동안 2분 간격으로 흡광도를 측정하였 다(Kim et al., 2011).

    Kinetic 분석은 균질화된 PC12 세포배양액을 실 험에 사용하였다. 효소에 추출물 저해제를 넣고 2 5°C에서 5분간 pre-incubation 시킨 후 50 mM sodium phosphate buffer에 용해시킨 Ellma's reaction mixture [0.5mM acetylthiocholine, 1mM 5,5'dithiobis (2-nitrobenzoic acid)]를 첨가 한 후 10초간 섞은 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(Kim et al., 2003). AChE의 kinetic 은 Lineweaver-Burk plot을 이용하였으며, Micahelis-Menten의 효소반응속도식을 적용할 수 있는 효소반응계이고, 그래프의 경우 X축이 1/S, Y축은 1/V이며, Y축 절편은 1/Vmax, X축 절편은 -1/Km, 그리고 기울기 는 Km/Vmax 로 나타낸 다. IC50 값은 효소 저해 dose-response 곡선을 이용하여 계산 하였다(Armenta & Blanco, 2011).

    2.8.통계처리

    모든 실험은 3회 반복 실시하여 mean±SD로 나 타내었다. 실험군 간의 유의성은 SAS version 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 ANOVA 분산분석과 Duncan‘s multiple range test로 검증하였다.

    III.결과 및 고찰

    3.1.무기성분 함량

    블루베리의 무기성분 함량을 분석한 결과는 Table 1과 같다. 블루베리에서 무기성분이 총 8종이 분리 되었으며, 가장 많이 함유되어있는 무기성분은 칼슘 (Ca)으로 128.20±6.15 mg/100 g이 함유되어 있었 고, 다음으로 칼륨(K) 119.60±8.76 mg/100 g, 인 (P) 40.24±3.78 mg/100 g, 나트륨(Na) 15.01± 2.6 mg/100 g, 마그네슘(Mg) 8.57±1.51 mg/100 g, 순으로 함유되어 있었다. 그 외 철(Fe), 망간 (Mn)도 소량 함유되어 있었다. 대표적인 베리류인 딸기와 비교하였을 때, 각각의 미네랄 함량은 블루 베리가 다소 낮았으나, 칼륨(K), 칼슘(Ca), 인(p), 마그네슘(Mg)의 순서로 함량이 높게 나와 본 실험 과 유사한 결과를 보였다(Orak et al., 2012).

    3.2.아미노산 함량

    블루베리의 아미노산 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 총 17종의 아미노산이 분리·동정되었으 며, 블루베리에 가장 많이 함유되어 있는 아미노산 으로는 glutamic acid 37.88 mg/100 g, aspartic acid 25.23 mg/100 g, arginine 19.01 mg/100 g 및 leucine 16.59 mg/100 g 순이었으며, 필수아미 노산의 함량은 72.98 mg/100 g, 총 아미노산 함량 은 297.07 mg/100 g이었다. 또한 Jeong 등(Jeong et al., 2008)의 블루베리와 라즈베리를 이용한 성 분분석 실험 결과와 유사하게 블루베리와 라즈베리 의 아미노산 모두 glutamic acid와 aspartic acid의 순으로 많이 함유되어 있는 것으로 나타났다.

    3.3.지방산 조성

    인체에 있어 식품 중의 불포화 지방산의 함유량 은 심혈관계 질환을 비롯하여 그 중요성이 건강과 매우 밀접한 연관이 있다고 보고되고 있다(You et al., 2011). 블루베리에 함유되어 있는 지방을 Soxhlet 추출법으로 추출하여 지방산 조성을 분석 한 결과는 Table 3과 같다. 블루베리가 함유한 포 화지방산과 불포화지방산의 비율은 76.78%와 23.21%로 포화지방산이 상대적으로 높은 함유량을 보였다. 가장 많이 함유되어 있는 포화지방산으로 는 palmitic acid로서 34.83%를 함유하고 있었으 며, 불포화지방산으로는 docosahexaenoic acid (DHA)와 eicosedienoic acid가 각각 10.48%과 6.25%의 순으로 높은 함유량을 나타냈다. 불포화지 방산 중 가장 많은 함량을 보이는 DHA는 다른 지 방산보다 우선적으로 뇌신경세포의 구성 등에 활용 되는 것으로 알려지고 있다(Janssen & Kiliaan, 2014). 특히 유아의 성장과 성인의 정상적인 뇌기능 유지를 위해 필수적이어서 이의 꾸준한 섭취는 인지 및 학습 효과에 도움을 줄 수 있는 것으로 보고되고 있어(Janssen & Kiliaan, 2014), DHA를 영양성분 으로 함유하고 있는 래빗아이 블루베리를 지속적으 로 섭취하였을 경우 인체 뇌신경세포 활성에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

    3.4.유리당, 비타민 C 및 총 페놀성 화합물 함량 분석

    블루베리에 함유되어 있는 유리당, 비타민 C 및 총 페놀성 화합물 함량을 측정한 결과는 Table 4와 같다. 블루베리에는 glucose, fructose 2종류의 유 리당이 함유되어 있었으며, 가장 많이 함유되어 있 는 유리당은 glucose로 157 mg/100 g의 함량을 보 였다. 비타민 C는 과채류에 상대적으로 다량 함유되 어 있는 성분으로 항산화, 항균 및 항암 효과와 같 은 다양한 생리활성 효과를 나타내는 대표적인 유효 성분으로 블루베리의 비타민 C 함량은 22.48 mg/100 g으로 나타났다. 특히 블루베리는 자유 라 디칼 소거능을 포함한 강력한 항산화 활성을 갖는 비타민 C와 페놀성 화합물 등의 많은 생리활성 화 합물을 함유하고 있어 인체 내 산화적 손상을 경감 시킬 수 있는 우수한 식품으로 보고되고 있다(López et al., 2010). 식물성 식품 속에 함유되어 있는 많 은 생리활성 물질 중 phenolics는 phenolic hydroxyl 그룹에 의하여 단백질 또는 효소 단백질, 기타 거대 분자들과 결합하는 성질 및 2가 금속이온 과의 결합력으로 인하여 높은 항산화 효과를 가지는 것으로 알려져 있다(Kwak et al., 2010). 블루베리 과실에 80% ethanol을 이용하여 환류냉각 추출하고 이것을 C18 sep-pak cartridge로 분리해 낸 추출물 과 안토시아닌, 비 안토시아닌 분획물의 총 페놀 화 합물 함량을 측정한 결과는 각각 1.64, 2.41, 및 4.45 mg of GAE/ g으로 나타나 안토시아닌 분획 물에서 가장 높은 함량을 보여주었다. You 등(You et al., 2011)은 일반적으로 자라는 블루베리 품종을 선택적으로 골라 총 페놀성 화합물함량을 연구하였 으며, 그 결과 총 페놀성 화합물 함량이 평균 3-3.84 mg of GAE/ g으로 나타나 본 실험과 유사 한 결과를 보였다.

    3.5.항산화 활성

    FRAP 방법은 총 항산화능을 측정하는 방법으로 낮은 pH에서 환원제에 의해 ferric tripyridyltrizaine (Fe3+-TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridyltriazine (Fe2+-TPTZ)으로 환원되는 원리를 이용한 것으로 대부분의 항산화제가 환원력을 가지고 있다는 점에 착안하여 고안되어진 방법이다(Benzie & Strain, 1996). 이 방법은 흡광도가 증가함에 따라 항산화력 이 커지는 것을 의미하는 것으로 블루베리 에탄올 추출물과 각 분획물을 이용하여 항산화력을 측정한 결과는 Fig. 1A와 같다. Positive control로 사용된 비타민 C 1000μg/mL 농도에서는 상대적으로 높은 흡광도를 나타내었다. 반면 블루베리 추출물과 안토 시아닌, 비안토시아닌 분획물에서는 동일 농도 1000 μg/mL에서 비타민 C 보다 상대적으로 낮은 활성을 보이지만, 블루베리 추출물과 안토시아닌, 비 안토 시아닌 모두 농도가 증가함에 따라 항산화 활성 역시 증가하였으며 특히 안토시아닌 분획물에서 상 대적으로 우수한 항산화 활성 효과를 나타내었다. 다양한 품종의 블루베리를 이용하여 항산화 활성 을 연구한 최근 논문에 의하면, 래빗아이 블루베리 는 Vaccinium corymbosum (Northern Hibush blueberry)와 함께 뛰어난 FRAP활성을 나타냄으로 써 본 실험과 유사한 항산화 효과를 보였다(Wang et al., 2011).

    블루베리 안토시아닌 추출물과 분획물의 마우스 뇌 세포막 지질과산화 억제 활성을 살펴보았으며, 그 결과는 Fig. 1B와 같다. 에탄올 추출물과 각 분 획물에서 농도 의존적으로 지질 과산화 억제 활성이 역시 증가하였으며, 특히 블루베리 안토시아닌 분획 물의 농도 62 μg/mL에서 positive control로 사용 된 catechin 50 μg/mL 보다 높은 저해 효과를 보 여 주었다. 이와 같은 결과는, 많은 연구자들이 안 토시아닌을 포함한 phenolics의 함량이 항산화 등과 같은 생리적 효과와 밀접한 연관성을 지니고 있다 (Ho et al., 2012)는 것과 유사한 결과를 나타내는 것으로 판단된다. 결국 본 연구에서 보이는 우수한 항산화 효과는 블루베리에 함유되어 있는 천연 항산 화 물질로서의 phenolics와 안토시아닌에 의한 것으 로 생각된다.

    3.6.AChE 저해 활성 및 Enzyme kinetics

    Acetylcholine(ACh)은 신경세포 안에 존재하던 choline과 acetyl CoA가 acetyltransferase(ChAT) 라는 효소에 의해 생성된다. ACh은 신경말단에서 분비되어 수용체에 결합함으로써 신경세포의 신호 를 전달한 후 AChE에 의해 acetate와 choline으로 분해되고, 분해되어진 choline은 carrier에 의해 다 시 신경계로 부분 흡수되어 진다. 이 과정을 cholinergic system이라 부르며 신경세포가 손상된 치매 환자의 경우 생성되는 ACh의 양은 적고 AChE의 작용은 계속되어 신경전달에 이상이 생기 게 되면서 결국 치매 환자는 학습능력 및 기억력 감퇴와 인지력 저하 등과 같은 대표적인 병리현상 이 발생된다(Maeda-Yamamoto et al., 2012). 알 츠하이머성 치매로부터 유발되는 기억력 상실 및 학습력 저하 등 각종 인지 장에는 주로 대뇌기저부 의 ACh성 신경세포의 손상으로부터 기인된다는 가 설을 바탕으로 본 연구에서는 블루베리 안토시아닌 분획물을 이용하여 AChE의 저해활성을 측정하였 으며 그 결과는 Fig. 2A와 같다. 1세대 AChE저해 제인 tacrine은 50%의 AChE저해활성을 보인 저해 농도(IC50)는 1 μM로 나타났으며, 에탄올 추출물과 비 안토시아닌 추출물에서는 최고농도 500 μg/mL 에서 50%이상의 저해활성을 보이지 못한 반면 안 토시아닌 분획물에서는 AChE저해활성을 50%이상 의 저해활성을 보였으며 저해하는 농도(IC50)는 212 μg/mL로 나타났고, 안토시아닌 분획물에서는 다른 에탄올 추출물과 비 안토시아닌 분획물과 달리 조금씩 차이는 있지만 125 μg/mL 이상에서농도가 증가함에 따라 저해활성 역시 증가하는 경향을 보였다. 최근 안토시아닌을 함유한 다양한 소재의 AChE 저해 활성을 연구한 내용에 따르면, 안토시 아닌의 함량이 높을수록 AChE를 저해하는 활성이 역시 높아지는 것(Maeda-Yamamoto et al., 2012)으로 보고되고 있다.

    Lineweaver-Burk plot은 Micahelis-Menten의 효소 반응속도식을 적용할 수 있는 효소 반응계이 며, 효소 저해 패턴인 enzyme kinetics를 측정한 결과는 Fig. 2B와 같다. 본 실험에서 블루베리 안토 시아닌 분획물은 cholinesterase inhibitor 계열의 초기 치매 치료제였던 galantamin의 반응 양식 (Armenta & Blanco, 2011)과 유사하며, 농도가 증 가할수록 Lineweaver-Burk plot의 기울기는 점점 커지고 각 직선은 Y축에서 교차하는 경쟁적 저해제 의 패턴을 보였다. 경쟁적 저해제는 효소반응에 있 어, 효소의 활성 중심에 기질과 경쟁적으로 결합하 는 화합물로서 저해제의 분자구조는 기질의 분자구 조와 유사하며, 저해의 정도는 기질과 저해제와의 상대농도에 의존한다(Armenta & Blanco, 2011). 따라서 안토시아닌을 포함한 다양한 항산화 성분을 함유하는 블루베리 추출물은 항산화 및 AChE 저해 효과 등에 의한 인지기능 개선 효과를 갖는 천연소 재로서 그 산업화 가치가 우수하다고 생각된다.

    IV.결론

    래빗아이 블루베리(Vaccinium virgatum, rabbit-eye blueberry)의 무기질은 칼슘과 칼륨의 순으로 많았으며, 아미노산은 glutamic acid, aspartic acid, 그리고 arginine의 순으로 그 함유 량이 분석되었다. 지방산 함량은 포화지방산으로서 palmitic acid, 그리고 불포화지방산으로서 DHA (docosahexaenoic acid)의 함량이 상대적으로 높 게 분석되었다. 유리당은 glucose와 fructose로 그 구성이 분석되었으며, vitamin C와 추출 및 분 획물의 total phenolics 함량은 각각 22.48 mg/100 g 그리고 1.64-4.45 mg of GAE/g으로 나타났다. 블루베리 안토시아닌 분획물의 in vitro 생리활성 효과가 상대적으로 우수하게 나타났으며, FRAP assay 및 지질과산화 억제활성은 농도가 증 가할수록 항산화 활성이 증가하는 경향을 보였다. AChE 저해활성 역시 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났으며, IC50값은 블루베리 안토시아닌 분획물이 212.5 μg/mL로 나타났다. Enzyme kinetic 실험에서 블루베리 안토시아닌 분획물은 기질과 효소의 결합을 경쟁적으로 저해하는 경쟁 적 저해제로 나타났다. 본 연구 결과를 종합해볼 때, 생리활성 소재로서의 다양한 phenolics를 함 유한 블루베리는 양질의 영양학적 성분 구성 및 in vitro 항산화 효과 그리고 AChE 저해 효과를 근간으로 한 인지기능 개선 효과 등 고부가가치 건강지향 식품 소재로서의 활용가치가 높다고 판 단된다.

    Figure

    JALS-48-241_F1.gif

    Ferric reducing antioxidant power(FRAP)(A) and inhibition of lipid peroxidation(B) of 80% ethanolic extract and several fractions obtained from blueberry. Results are mean±SD (n=3) and mean separation within column by Duncan's multiple range test at p<0.05. Different small letters indicate significant differences.

    JALS-48-241_F2.gif

    AChE inhibitory effects of 80% ethanolic extract and several fractions from blueberry(A) and Lineweaver-Burk plot as the reciprocal of the initial enzyme velocity versus the reciprocal of acetylthiocholine iodide concentration in the presence and the absence of anthocyanins fraction from blueberry. Result shown are means±SD (n=3) and mean separation within column by Duncan's multiple range test at p<0.05. Different small letters indicate significant differences.

    Table

    Minerals content of blueberry

    Amino acids content of blueberry

    1)E.A.A : Essential amino acid
    2)A.A : Amino acid

    Fatty acids constitution of blueberry

    Free sugar, vitamin C and total phenolics constitution of blueberry

    1)Not detected

    Reference

    1. Armenta S. , Blanco M. (2011) Ion mobility spectrometry: A valuable tool for kinetic studies in enzymology , Anal Chim Acta, Vol.685; pp.1-8
    2. Benzie I. F. F. , Strain J. J. (1996) The ferric reducing ability of plasma(FRAP) as a measure of 'antioxidant power': The FRAP assay , Anal Biochem, Vol.239; pp.70-76
    3. Chen D. L. , Zhang P. , Lin L. , Shuai O. , Zhang H. M. , Liu S. H. , Wang J. Y. (2013) Protective Effect of Bajijiasu Against β-Amyloid-Induced Neurotoxicity in PC12 cells , Cell Mol Neurobiol, Vol.33; pp.837-850
    4. Connor A. M. , Ludy J. J. , Hancock J. F. , Berkeimer S. , Hanson E. J. (2002) Changes in fruit antioxidant among blueberry cultivarsduring cold-temperature storage , J Agric Food Chem, Vol.50; pp.893-898
    5. Criqui M. H. , Ringel B. L. (1994) Does diet or alcohol explain the French paradox? , J-Lancet, Vol.344; pp.1719-1723
    6. Heo H. J. , Cho H. Y. , Hong B. , Kim H. K. , Kim E. K. , Kim B. G. , Shin D. H. (2001) Protective effect of 4'5-dihydroxy-3',6,7-trimethoxyflavone from Artemisia asiatica against Abeta-induced oxidative stress in PC12 cells , Amyloid, Vol.8; pp.194-201
    7. Ho S. T. , Tung Y. T. , Chen Y. L. , Zhao Y. Y. , Chung M. J. , Wu J. H. (2012) Antioxidant activities and phytochemical study of extracts from 18 indigenous tree species in Taiwan , J Evidence-Based Complementary Altern Med, Vol.215959(Article ID); pp.1-8
    8. Janssen C. I. F. , Kiliaan A. J. (2014) LongLong-chain polyunsaturated fatty acids (LCPUFA) from genesis to senescence: The influence of LCPUFA on neural development, aging, and neurodegeneration , Prog Lipid Res, Vol.53; pp.1-17
    9. Jeong C. H , Bae Y. I. , Lee H. J. , Shim K. H. (2003) Chemical components of propolis and its ethanolic extracts , J Korean Soc Food Sci Nutr, Vol.32; pp.501-505
    10. Jeong C. H. , Choi G. N. , Kim G. N. , Kwak J. H. , Kim D. O. , Kim Y. J. , Heo H. J. (2010) Antioxidant activities from the aerial parts of Platycodon grandiflorum , Food Chem, Vol.118; pp.272-282
    11. Jeong C. H. , Choi S. G. , Heo H. J. (2008) Analysis of nutritional compositions and antioxidative activities of Korean commercial blueberry and raspberry , J Korean Soc Food Sci Nutr, Vol.37; pp.1375-1381
    12. Jeong C. H. , Shim K. H. (2004) Quality characteristics of sponge cakes with addition of Pleurotus eryngii mushroom powders , J Korean Soc Food Sci Nutr, Vol.33; pp.716-722
    13. Jeong E. J. , Sung S. H. , Kim J. S. , Kim H. , Kim Y. C. (2008) Rhus verniciflua stokes attenuates glutamate-induced neurotoxicity in primary cultures of rat cortical cells , Nat Prod Sci, Vol.14; pp.156-160
    14. Jeong H. R. , Jo Y. N. , Jeong J. H. , Kim H. J. , Heo H. J. (2012) Nutritional Composition and in vitro Antioxidant Activities of Blueberry (Vaccinium ashei) Leaf , Korean J Food Preserv, Vol.19; pp.604-610
    15. Jeong J. H. , Jeong H. R. , Jo Y. N. , Kim H. J. , Lee U.K. , Heo H. J. (2013) Antioxidant and neuronal cell protective effects of columbia arabica coffee with different roasting conditions , Prev Nutr Food Sci, Vol.18; pp.30-37
    16. Jo Y. N. , Jeong H. R. , Jeong J. H. , Heo H. J. (2012) The skin protecting effects of ethanolic extracts of eggplant peels , Korean J Food Technol, Vol.44; pp.94-99
    17. Kim D. O. , Jeong S. W. , Lee C. Y. (2003) Antioxidant capacity of phenolic phytochemical from various cultivars of plums , Food Chem, Vol.81; pp.321-326
    18. Kim J. H. , Choi G. N. , Kwak J. H. , Jeong H. R. , Jeong C. H. , Heo H. J. (2011) Neuronal cell protection and acetylcholinesterase inhibitory effect of the phenolics in chestnut inner skin , Food Sci Biotechnol, Vol.20; pp.311-318
    19. Kwak J. H. , Choi G. N. , Park J. H. , Kim J. H. , Jeong H. R. , Jeong C. H. , Heo H. J. (2010) Antioxidant and neuronal cell protective effect of purple sweet potato extract , J Agric Life Sci, Vol.44; pp.57-66
    20. Lologer J Aruoma OI , Halliwell B (1991) The use of antioxidants in foods , Free radicals and food additives, Taylor Francis, pp.121-150
    21. Lopez J. , Uribe E. , Vega-G lvez A. , Miranda M. , Vergara J. , Gonzalez E. , Scala K. D. (2010) Effect of air temperature on drying kinetics, vitamin C, antioxidant activity, total phenolic content, non-enzymatic browning and firmness of blueberries variety O'Neil , Food Bioprocess Technol, Vol.3; pp.772-777
    22. Maeda-Yamamoto M. , Saito T. , Nesumi A. , Tokuda Y. , Ema K. , Honma D. , Ogino A. , Monobe M. , Murakami A. , Murakami A. , Tachibana H. (2012) Chemical analysis and acetylcholinesterase inhibitory effect of anthocyanin-rich red leaf tea (cv. Sunrouge) , J Sci Food Agric, Vol.92; pp.2379-2386
    23. Magdalini A. P. , Andriana D. , Zacharoula I. L. , Paul C. , Dorothy K. , Marigoula M , Fotini N. L. ( 2009) Effect of a polyphenol-rich wild blueberry extrat on cognitive performance of mice, brain antioxidant markers and acetylcholinesterase activity , Behav Brain Res, Vol.198; pp.352-358
    24. Martineau L. C. , Couture A. , Spoor D. , Benhaddou-Andaloussi A. , Harris C. , Meddah B. , Leduc C. , Burt A. , Vuong T. , Le P. M. , Prentki M. , Bennett S. A. , Arnason J. T. , Haddad P. S. ( 2006) Anti-diabetic properties of the Canadian lowbush blueberry Vaccinium angustifolium Ait , Phytomedicine, Vol.13; pp.612-623
    25. Metcalf L. D. , Schmits A. A. , Pelka J. R. (1966) Rapid preparation of fatty acid esters form lipids for gas chromatographic analysis , Anal Chem, Vol.38; pp.514-515
    26. Orak H. , Aktas T. , Yagar H. I. , Sbilir S. S. , Ekinci N. , Sahin F. H. (2012) Effects of hot air and freeze drying methods on antioxidant activity, colour and some nutritional characteristics of strawberry tree (Arbutus unedo L) fruit , Food Sci Technol Int, Vol.18; pp.391-402
    27. Parfenova H. , Basuroy S. , Bhattacharya S. , Tcheranova D. , Qu Y. , Regan R. F. , Leffler C. W. (2006) Glutamate induces oxidative stress and apoptosis in cerebral vascular endothelial cells: contributions of HO-1 and HO-2 to cytoprotection , Am J Physiol Cell Physio, Vol.290; pp.1399-1410
    28. Su M. S. , Chien P. J. (2007) Antioxidant activity, anthocyanins, and phenolics of rabbiteye blueberry (Vaccinium virgatum) fluid products as affected by fermentation , Food Chem, Vol.104; pp.182-187
    29. Wang S. Y. , Chen H. , Ehlenfeld M. K. (2011) Variation in antioxidant enzyme activities and nonenzyme components among cultivars of rabbiteye blueberries (Vaccinium ashei Reade) and V. ashei derivatives , Food Chem, Vol.219; pp.13-20
    30. Westwood M. N (1993) Temperate-zone pomology, Timber Press, pp.100-101
    31. You Q. , Wang B. , Chen F. , Huang Z. , Wang X. , Luo P.G. (2011) Comparison of anthocyanins and phenolics in organically and conventionally grown blueberries in selected cultivars , Food Chem, Vol.125; pp.201-208
    32. Zheng W. , Wang S. Y. (2003) Oxygen radical absorbinding capacity of phenolics in blueberries, cranberries, chokeberries, and ligoberries , J Agric Food Chem, Vol.51; pp.502-509
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