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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.48 No.4 pp.197-205
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2014.48.4.197

Genome-wide Association Study Identified the BCL11B Gene as a Positional Candidate Gene Affecting GPT Levels in Pigs

Jae-Bong Lee1, Beom-Mo Kim2, Chae-Kyoung Yoo3, Hee-Bok Park4, Jun-Ho Shin2, Joon-Ki Hong5, Hyun-Tae Lim3*
1Korea Zoonosis Research Institute(KOZRI), Chonbuk National University
2Division of Applied Life Science(BK21 plus), Gyeongsang National University
3Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University
4Department of Animal Science and Biotechnology(BK21 plus), Chungnam National University
5National Institute of Animal Science, R.D.A, Cheonan
Corresponding Author: Hyun-Tae Lim, Tel: +82-55-772-1945, Fax: +82-55-772-1949, E-mail: s_htim@gnu.ac.kr
May 2, 2014 June 30, 2014 August 4, 2014

Abstract

Serum glutamic pyruvic transaminase(GPT) levels can be used as an indicator of muscle and liver cell damage affecting health status. In this study, a genome-wide association study(GWAS) was performed to detect significant single nucleotide polymorphisms(SNPs) affecting serum GPT levels in a large F2 intercross between Landrace and Korean native pigs (N=1,105) using the porcine 60K chip, and a mixed-effects model approach accounting for familial relationships between individuals in this intercross. The significant SNPs were identified on Sus scrofa chromosome(SSC) 7. Two positional candidate genes on SSC7, BCL11B and AHNAK2, were subsequently selected and further investigated. Within these positional candidate genes, four SNPs were identified and genotyped using the pyrosequencing. The results revealed that the SNP(g.267 T>C, nominal P=7.23×10-8) in the BCL11B, and SNPs(g.1439 C>T, nominal P=5.64×10-6; g.1736 C>A, nominal P=3.51×10-6) in the AHNAK2 gene were associated with serum GPT levels, respectively. Based on its statistical significance, the BCL11B can be used as a promising candidate gene for further functional investigations.


GWAS를 이용한 간경화 수치와 후보유전자 BCL11B의 관련성 분석

이 재봉1, 김 범모2, 유 채경3, 박 희복4, 신 준호2, 홍 준기5, 임 현태3*
1전북대학교 인수공통전염병연구소
2경상대학교 응용생명과학부(BK21 plus)
3경상대학교 농업생명과학연구원
4충남대학교 농업생명과학대학 동물자원생명과학과(BK21 plus)
5농촌진흥청 국립축산과학원

초록

혈청 내 존재하는 효소 중 Glutamic pyruvic transaminase(GPT)는 근육이나 간세포의 손상에 대한 임상 화학적 지표로 사용 된다. 본 연구는 Landrace와 한국재래돼지의 F2 교잡 축군(N=1,105)에 대해 Porcine SNP 60K beadchip을 사용하여 유전자형 분석을 실시하고, GPT 형질과의 관련성을 검증하기 위해 Genome-Wide Association Study(GWAS)를 수행하였다. F2 교잡축군의 가계구조를 보정한 GWAS를 수행하기 위하여 혼합모형과 회귀분석을 조합한 GRAMMAR방법을 관련성 분석에 사용 하였 다. 유의성 있는 SNP 표지들은 Sus scrofa chromosome(SSC) 6, 7, 그리고 13에서 동정되었다. 이들 유의성 있는 SNP marker들에 가장 근접한 염색체상 위치의 유전자를 그 유전자의 기능을 고려하여 SSC7에서 2개의 위치후보유전자(BCL11B, AHNAK2)를 선정하였다. Pyrosequencing법을 통하여 이 들 유전자 내에 존재하는 4개 SNP 표지들의 유전자형을 분석하여 GPT 형질간의 관련성 분석에 이용하였 다. 관련성 분석결과, BCL11B g.267 T>C에서 nominal P=7.23×10-8 과 AHNAK2 g.1439 C>T에서 nominal P=5.64×10-6, g.1736 C>A에서 nominal P=3.51×10-6의 결과를 얻었다. 이 들 중 가장 유의 한 결과를 얻은 BCL11B 유전자의 g.267 T>C SNP 표지는 추가 연구를 통하여 혈청 GPT 변이에 영향 을 미치는 위치상 후보 유전자 표지로 사용 되어 질 수 있을 것이라 사료되어진다.


    Rural Development Administration
    PJ009971032014

    I.서론

    돼지는 인간의 장기 크기와 생리학적인 면에서 유사성을 가지고 있다(Miller and Ullery, 1987). 따라서 어떤 동물 model 보다도 의생명과학 분야 에 있어 매우 중요한 역할을 하고 있다(Walters et al., 2011; Zhang et al., 2011; Yoo et al., 2012). 하지만 동물 model로 이렇게 중요한 돼지 의 Quantitative Traits Locus(QTL) 및 Genomewide association study(GWAS) 연구는 여전히 경 제형질인 성장 및 육질 형질에 맞춰져 있다.

    혈청 내 존재하는 여러 면역 단백질, 지방질, 효 소 등의 level 변화를 통해 질병을 진단하게 된다. 혈청의 성분과 관련하여 Reiner et al.(2009)는 Pietrain/Meishan population에서 7개의 clinical -chemical traits의 QTL을 보고한 바 있고, Gallardo et al.(2008)은 Ducro population, Chen et al .(2009)은 White Duroc/Erhualian population, Uddin et al .(2011)은 Duroc/ Pietrain population에서 혈청 lipid와 관련된 QTL을 보고 하였다. 하지만, 돼지의 혈청에서 lipid levels을 제외한 다른 형질들의 QTL 및 GWAS 연구는 부족한 편이다. 이중, 간은 정상적 인 활동을 하기 위한 필수적인 일들을 수행하는 중 요한 장기 중 하나이다. 간은 필수적인 단백질을 합성하고 여러 가지 영양소를 관장하며, 약물과 그 외 화합물 등의 대사를 담당하는 등 여러 가지 생 리적 과정에 관여한다(Grant et al., 2004). 간 기 능의 장애를 일으키는 간염이나 간경화와 같은 간 질환을 앓게 되면 혈액응고장애, 정맥류 출혈, 근 육의 소모 등 가축에 있어서 주요 경제형질에 큰 소실을 가져온다. 간 질환의 초기에는 간 기능 장 애에 대한 증상이 잘 드러나지 않으며 병이 진행되 어 황달이나 복수, 홍반 등 표면적으로 드러났을 때 간 질환의 감염여부를 알아채는 경우가 대부분 이다. 간은 간염이나 간경화와 같은 손상을 입을 시 에 간세포가 파괴되어 여러 효소가 혈액으로 유리되 며, 혈액으로 유리 된 혈청 내의 glutamic pyruvic transaminase(GPT)는 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT)와의 수치 비교를 통해 특이 성을 높여 근육이나 간세포의 손상에 대한 임상 화 학적 지표로 사용된다(Wilke et al., 2007; Lazo et al., 2008). 이 두 아미노기 전기 효소는 각종 간염 및 간질환시 증가하며 일반적으로 급성 간염 에서는 GPT가 GOT보다 높고, 간경변증이나 간암 에서는 GOT가 GPT보다 상승한다(Wu, 2001; Burtis et al., 2006; Abraham et al., 2007).

    따라서, 본 연구는 Landrace와 한국재래돼지 (KNP)의 F2 교잡축군에 대하여 Porcine 60K beadchip을 사용하여 유전자형 분석을 실시하여 GPT 형질과의 관련성을 검증하기 위해 GWAS를 수 행하였다.

    II.재료 및 방법

    2.1.공시 동물

    본 연구에 공시한 돼지는 Landrace와 한국재 래돼지의 상호교배로 조성된 3세대의 시험 축군으 로 79 전형매 가계를 가지는 총 1,232두를 사용하 였다.

    Genomic DNA의 분리는 혈액을 채취 Sucrose -Proteinase K(Birren et al., 1997)법을 이용하여 분리하였다. NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo, USA)로 흡광도를 측정하였고, A260/A280 1.8 이상인 DNA를 50 ng/μl로 희석하여 PCR 증폭 을 위한 주형으로 이용하였다.

    2.2.GPT 형질 측정 및 혼합모형분석

    Landrace와 KNP의 상호 교배로 조성된 축군의 F2 집단 1,105두를 생후 140일에 혈액 10 ml를 채혈 하였다. 채혈한 혈액에서 혈청을 분리하여 Kuadro clinical-chemistry analyzer(BPC, Italy)를 이용하 여 hepatic function과 연관 있는 glutamic pyruvic transaminase(GPT)를 측정하였다.

    측정된 형질은 ASREML 프로그램에서 (VSN international Inc., UK) 아래의 혼합모형을 이용하 여 F2 가계 구조를 고려한 잔차를 구하였다.

    Y = μ + s + b + b 1 BW + a + ϵ
    model 1

    여기서, Y = GPT 표현형, μ = 전체평균, s = 성 의 고정효과, b = 차수의 고정 효과, b1 = BW의 회 귀계수, BW = 140일령의 공변이, a = 개체의 임의 상가적 유전 효과, ε = 임의 잔차 오차.

    2.3.Genome-wide association study

    돼지의 혈액 샘플로부터 추출한 DNA 200 ng/μl 와 porcine 60K beadchip analysis kit(Illumina, USA)를 이용하여 62,163개의 SNP data 정보를 분 석하였고 SNP data는 Plink version 1.06(Purcell et al., 2007)을 이용하여 linear regression analysis를 수행하였고, minor allele frequency (MAF) < 0.05, genotyping error > 0.1, Hardy Weinberg equilibrium(P-value ≤ 0.001) 순으로 SNP marker들은 제거하여, 최종적으로 30,912개의 SNP marker를 Genome-wide 연관성 분석에 이용 하였다. Genome-wide 관련성 분석은 다음의 선형 회귀 분석 식을 이용하여 Plink 프로그램을 통하여 분석 하였다.

    Y = b 0 + b 1 X snp a + ϵ
    model 2

    여기서, Y′ = Model 1에서의 잔차값, b0 = 회귀 식의 절편, b1 = SNP marker의 상가적효과의 회귀 계수 s, Xsnp_a = 상가적효과의 회귀변수 , ε = 임 의 잔차 오차

    Additive model로 분석한 결과를 Genome-wide 임계수준을 Bonferroni method(0.05/SNP marker 의 수; P=1.61×10-6)를 이용하였다.

    2.4.위치상 후보 유전자 및 genotype 분석

    SSC7에서 탐지된 GPT와 연관된 위치상 후보 유 전자는 NCBI database(http://www.ncbi.nih.gov) 를 이용하여 탐색하였다. GPT와 관련된 후보 유 전자가 14개이며, 이중 상당한 유의성을 보인 2 개의 유전자 BCL11B(XM_003356796.2), AHNAK2 (XM_005656485.1)를 선정하여 각 후보유전자 내의 variation SNP의 genotype 분석은 pyrosequencer (PyroMark MD, USA)를 이용하여 pyrosequencing 분석법을 이용하였으며, mini-sequencing primer 를 Table 1 에 나타내었다.

    2.5.통계분석

    SAS package(SAS Institute Inc., USA)를 이용 하여 2개의 유전자(BCL11B, AHNAK2) SNP의 genotype과 표현형간의 관련성을 sire, dam을 random effect로 가계를 고려하여 검증하였으며, random effect로 sire와 dam을 포함 시켰고, fixed effect로 SNP genotype, sex, batch 및 140일령 체중을 포함 시켰다. 선발된 후보 SNP marker들 간의 연관성을 보기 위해 Haploview version 4.2(Barrett et al., 2005)를 이용하여 유의성 있는 SNP로 확인된 데이터들 간의 연관 불평형(LD, Linkage disequilibrium) 분석을 실시하였다.

    III.결과 및 고찰

    Landrace와 KNP의 F2 교잡축군의 GPT의 기술통 계 수치를 분석한 결과 평균 및 표준편차는 47.2±12.36 U/L 이었고, 최소값은 10 U/L, 최대 값은 100 U/L 이었다. 또한 유전력은 56.3% 였다 (Yoo et al., 2012).

    Porcine 60K beadchip SNP data 62,163개의 S NP 중 minor allele frequency(MAF) < 0.05, gen otyping error > 0.01, Hardy Weinberg equilibri um(P-value ≤ 0.001)을 만족시키는 30,912개 상 염색체의 SNP marker를 확인 하였다. GWAS 분석 결과, SNP marker값 중 Genome-wide의 임계값 5%의 Bonferroni correction을 넘는 유의성이 높게 나타난 SNP marker는 14개로 나타났다. 총 14개의 SNP marker 중 독립적으로 SSC6과 SSC13에서 나 타난 두 개의 SNP marker MARC0056503, ASGA0 100304는 LD block이 형성 되질 않았다. 여기서 S SC6과 SSC13에서 각각 한 개 만의 marker 만이 검출된 것은 두 SNP가 존재하는 게놈 영역을 Porci ne 60K beadchip SNP 마커가 조밀하게 커버하지 못하였기 때문으로 사료된다.

    유의적인 값을 나타낸 12개의 SNP marker가 있 는 SSC7 내에 각 SNP marker의 가장 근접한 위치 의 유전자를 NCBI에 보고된 유전자들의 염색체 상 의 위치 비교와 유전자의 기능을 고려하여 2개의 후 보유전자 BCL11B, AHNAK2를 선정하였으며(Table. 2), 이 두 유전자에서 유전자형이 분석이된 4개의 SNP marker를 포함 최종 30,916개 SNP marker들 을 이용하여 Manhattan plot 분석을 하였다(Fig. 1). BCL11B 유전자는 B-cell CLL/lymphoma 11B로 암 억제 유전자로써 발견되었으며, 방사선 조사를 통해서 흉선 림프종을 유발시킨 마우스에서 BCL11B 유전자의 비활성화가 증가한다고 보고되었으며(Wak abayashi et al., 2003), 인간에서 BCL11B 유전자 가 비활성화 된 T 세포성 급성 림프성 백혈병이 보 고된 바 있다(Przybylski et al., 2005). 또한 AHN AK2 유전자는 mouse 심장의 Z-band 영역에서 면 역 기능을 보인다고 보고 하였다(Komuro et al., 2004).

    Bonferroni correction을 넘는 관련성 있는 SNP marker들과의 가장 근접한 위치의 유전자 내의 variation SNP의 유전자형을 분석하여 GPT 수치와의 GWAS 결과를 본 결과 5%의 수준의 P=1.62×10-6을 넘는 값은 BCL11B g.267 T>C (P=7.23×10-8) 유의성을 나타내었다. 2개의 후보 유전자의 내부 variation SNP들과 SNP marker들 간의 연관불평형 상태를 보기 위해 Haploview 프 로그램을 이용하여 SSC7의 127-131 Mb 영역의 LD block 분석을 하였는데 각각의 유전자를 포함 한 지역에서 한 개씩의 유의한 LDblock 이 형성되 었다 (Fig. 2).

    BCL11B g.267 T>C는 혈청 GPT 수준과의 관 련성에서 유의성이 있었으며, AHNAK2 g.1439 C>T(P =5.64×10-6), AHNAK2 g.1736 C>A(P =3.51×10-6)는 Bonferroni 방법으로 구 해진 임계치에 유의성 있는 결과 값을 보이지 않 았다. 2개의 후보 유전자인 BCL11B(1 SNP), AHNAK2 (3 SNPs)를 SAS 프로그램을 사용하여 linear mixed-effect model을 유전자형과 GPT level과의 상관관계를 나타 내었다(Fig. 3). BCL11B g.267 T>C(P=1.33×10-7)과 AHNAK2 g.1439 C>T(P =4.12×10-5), g.1736 C>A(P=1.09 ×10-6)의 결과를 얻었다. GRAMMAR (Genomewide rapid association using mixed model and regression, Aulchenko et al ., 2007) 분석과 SAS 분석의 결과에 미세한 차이를 보이는 것은 GRAMMAR 분석법은 mixed model에 대한 residual을 사용 하였으며, 전체 pedigree의 정보 를 이용해서 가계 내에 존재하는 개체들 간의 혈 연관계를 보정한 방법으로 사용하였다. SAS 프로 그램을 사용한 분석법은 mixed 모델에 대한 residual을 사용하지 않고 phenotype을 사용하였 으며, 가계내의 존재하는 개체들 간의 혈연관계를 보정하기 위하여 sire와 dam 정보만을 사용한 방 법이기에 결과 값에 차이가 보인 것으로 사료되어 진다.

    본 실험에서 탐색된 BCL11B g.267 T>C와 GPT의 관련성 분석 결과, BCL11B g.267 T>C는 Hardyweinberg equilibrium(P-value=0.393)을 따랐으며, GPT 수치와의 연관성을 보이는 돼지 7번 염색체상 BCL11B g.267 T>C 유전자의 SNP marker는 추가 적인 기능 연구를 통하여 GPT level의 위치상 후보 유전자 marker로 사용 되어 질수 있을 것이라 사료 되어진다.

    Figure

    JALS-48-197_F1.gif

    Genome-wide association study(GWAS) results with GPT trait using 60K SNP chip analysis of Landrace and Korean native pigs(KNP). (A) Association between GPT and 30,916(4 SNP markers) mapped SNP markers in 18 pig autosomes using additive model. Bonferroni method cut-off value is 5.79(i.e. 0.05/30,916 = 1.62×10-6). (B) Quantile-quantile plots of SNP marker.

    JALS-48-197_F2.gif

    Regional plots and Linkage disequilibrium block in the region from 127-131 Mb on SSC7. (A) Regional plot of GWAS P values in the region from 127-131 Mb on SSC7. The Red boxes represent the SNP genotyping results from pyrosequencing. P-values were calculated using the GRAMMAR method. The white boxes represent SNP genotyping results from Porcine 60K chip. (B) Linkage disequilibrium block of the region.

    JALS-48-197_F3.gif

    The genotypic means and standard errors of serum GPT levels represent significant associations between the genotype of 2 genes. P-values were calculated using a mixed-effects model analysis implemented in SAS program.

    Table

    Primer set used for the pyrosequencing analysis of SNPs of BCL11B and AHNAK2 gene

    GWAS results of SNP markers for GPT level in an F2 intercross between Landrace and Korean native pigs

    1major/minor allele.
    2major/minor allele.

    Reference

    1. Abraham N. Z. , Carty R. P. , DuFour D. R. , Pincus M. R. McPherson R. A. , Pincus M. R. (2007) Pincus, Cinical enzymology , Henry's clinical diagnosis and management by laboratory methods, Elsevier Saunders, pp.245-62
    2. Aulchenko Y. S. , de Koning D. J. , Haley C. (2007) Genomewide rapid association using mixed model and regression: a fast and simple method for genomewide pedigree-based quantitative trait loci association analysis , Genetics, Vol.177 (1) ; pp.577-585
    3. Barrett J. C. , Fry B. , Maller J. , Daly M. J. (2005) Haploview: Analysis and visualization of LD and haplotype maps , Bioinformatics, Vol.21 (2) ; pp.263-265
    4. Birren B. , Green E. D. , Klapholz S. , Myers R. M. , Roskams J. (1997) Genome analysis: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
    5. Burtis C. A. , Ashwood E. R. , Bruns D. E. (2006) Tietz textbook of clinical chemistry and molecular diagnotics, Elsevier Saunders, Vol.191-218; pp.597-643
    6. Chen R. , Ren J. , Li W. , Huang X. , Yan X. , Yang B. , Zhao Y. , Guo Y. , Mao H. , Huang L. (2009) A genome-wide scan for quantitative trait loci affecting serum glucose and lipids in a White Duroc × Erhualian intercross F2 population , Mammalian Genome, Vol.20 (6) ; pp.386-392
    7. Gallardo D. , Pena R. N. , Amills M. , Varona L. , Ramirez O. , Reixach J. , Diaz I. , Tibau J. , Soler J. , Prat-Cuffi J.M. , Noguera J. L. , Quintanilla R. (2008) Mapping of quantitative trait loci for cholesterol, LDL, HDL, and triglyceride serum concentrations in pigs , Physiological Genomics, Vol.35 (3) ; pp.199-209
    8. Grant B. F. , Stinson F. S. , Dawson D. A. , Chou S. P. , Dufour M. C. , Compton W. , Pickering R. P. , Kaplan K. (2004) Prevalence and co-occurrence of substance use disorders and independent mood and anxiety disorders: Results from the national epidemiologic survey on alcohol and related conditions , Arch. Gen. Psychiatry, Vol.61 (8) ; pp.807-816
    9. Komuro A. , Masuda Y. , Kobayashi K. , Babbitt R. , Gunel M. , Flavell R. A. , Marchesi V. T. (2004) The AHNAKs are a class of giant propeller-like proteins that associate with calcium channel proteins of cardiomyocytes and other cells , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, Vol.101 (12) ; pp.4053-4058
    10. Lazo M. , Selvin E. , Clark J. M. (2008) Brief communication: Clinical implications of short-term variability in liver function test results , Ann. Intern. Med, Vol.148 (5) ; pp.348-352
    11. Miller E. R. , Ullrey D. E. (1987) The pig as a model for human nutrition , Annu. Rev. Nutr, Vol.7; pp.361-382
    12. Przybylski G. K. , Dik W. A. , Wanzeck J. , Grabarczyk P. , Majunke S. , Martin-Subero J. I. , Siebert R. , Dolken G. , Ludwig W. D. , Verhaaf B. , van Dongen J. J. , Schmidt C. A. , Langerak A. W. (2005) Disruption of the BCL11B gene through inv(14)(q11.2q32.31) results in the expression of BCL11B-TRDC fusion transcripts and is associated with the absence of wild-type BCL11B transcripts in T-ALL , Leukemia, Vol.19 (2) ; pp.201-208
    13. Purcell S. , Neale B. , Todd-Brown K. , Thomas L. , Ferreira M. A. R. , Bender D. , Maller J. , Sklar P. , De Bakker P. I. W. , Daly M. J. , Sham P. C. (2007) PLINK: A tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses , Am. J. Hum. Genet, Vol.81 (3) ; pp.559-575
    14. Reiner G. , Clemens N. , Lohner E. , Willems H. (2010) SNPs in the porcine GOT1 gene improve a QTL for serum aspartate aminotransferase activity on SSC14 , Anim. Genet, Vol.41 (3) ; pp. 319-323
    15. Uddin M. J. , Duy D. N. , Cinar M. U. , Tesfaye D. , Tholen E. , Juengst H. , Looft C. , Schellander K. (2011) Detection of quantitative trait loci affecting serum cholesterol, LDL, HDL, and triglyceride in pigs , BMC Genetics, pp. 12
    16. Wakabayashi Y. , Inoue J. , Takahashi Y. , Matsuki A. , Kosugi-Okano H. , Shinbo T. , Mishima Y. , Niwa O. , Kominami R. (2003) Homozygous deletions and point mutations of the Rit1/Bcl11b gene in γ-ray induced mouse thymic lymphomas , Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.301 (2) ; pp.598-603
    17. Walters E. M. , Agca Y. , Ganjam V. , Evans T. (2011) Animal models got you puzzled?: think pig , Ann. N. Y. Acad. Sci, Vol.1245; pp. 63-64
    18. Wilke R. A. , Lin D. W. , Roden D. M. , Watkins P. B. , Flockhart D. , Zineh I. , Giacomini K. M. , Krauss R. M. (2007) Identifying genetic risk factors for serious adverse drug reactions: Current progress and challenges , Nature Reviews Drug Discovery, Vol.6 (11) ; pp.904-916
    19. Wu A. H. B. McClatchey K. D (2001) Diagnostic enzymology and other biomarkers of organ damage , Clinical laboratory medicine, Lippincott Williams & Wilkins, pp.281-305
    20. Yoo C. K. , Cho I. C. , Lee J. B. , Jung E. J. , Lim H. T. , Han S. H. , Lee S. S. , Ko M. S. , Kang T. , Hwang J. H. , Park Y. S. , Park H. B. (2012) QTL analysis of clinical-chemical traits in an F(2) intercross between Landrace and Korean native pigs , Physiol. Genomics, Vol.44 (13) ; pp.657-668
    21. Zhang E. W. , Wang Y. B. , Shuai K. G. , Gao F. , Bai Y. J. , Cheng Y. , Xiong X. L. , Zheng Y. F. , Wei S. C. (2011) In vitro and in vivo evaluation of SLA titanium surfaces with further alkali or hydrogen peroxide and heat treatment , Biomedical Materials, Vol.6 (2) ;
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