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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.48 No.3 pp.75-83
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2014.48.3.75

Development of Nucleotide Primers for Dignostic RT-PCR and Nested PCR Detection of Three Seed-transmitted Viruses (CRLV, SpLV and WClMV) in Quarantine

Siwon Lee1, Mijeong Cha3, Sang-Mok Kim4, Noh-Youl Heo3, Yong-Gil Shin2, Su-Heon Lee6*
1Water Supply & Sewerage Research Division, National Institute of Environmental Research, Incheon 440-170, Korea
2Incheon International Airport Regional Office, Animal and Plant Quarantine Agency, Incheon 440-044, Korea
3Plant Quarantine Technology Center, Animal and Plant Quarantine Agency, Suwon 443-440, Korea
4Yeongnam Regional Office, Animal and Plant Quarantine Agency, Busan 602-833, Korea
5School of Applied Biosciences, Kyungpook National University, Daegu 702-701, Korea
6Institute of Plant Medicine, Kyungpook National University, Daegu 702-701, Korea
Corresponding author: Su-Heon Lee, Tel: +82-53-950-5763; Fax: +82-53-950-6758; E-mail: suheon@knu.ac.kr
December 4, 2013 May 27, 2014 June 2, 2014

Abstract

Seed-transmitted viruses regarding quarantine are the most problematic plant diseases in crop seed industry. In this study, three seed-transmitted viruses [Cherry rasp leaf virus (CRLV), Spinach latent virus (SpLV) and White clover mosaic virus (WClMV)] that have not previously been studied for PCR diagnostic system in Korean quarantine were targeted for the detection. For successful virus detection, we employed a diagnostic technique based on reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and nested polymerase chain reaction (nested PCR) methods. Two RT-PCR primer sets for each virus were finally selected for the diagnosis. Nested primer sets developed in the present study were shown to be highly sensitive in detection and verification of the target viruses. Overall, RT-PCR and nested PCR were proven to be a useful diagnostic technique for the detection of CRLV, SpLV and WClMV in quarantine.


종자전염검역바이러스 3종(CRLV, SpLV 및 WClMV)을 검정하기 위한 RT-PCR 및 Nested PCR 프라이머 개발

이 시원1, 차 미정3, 김 상목4, 허 노열3, 신 용길2, 이 수헌6*
1국립환경과학원 상하수도연구과
2농림축산검역본부 인천공항지역본부
3농림축산검역본부 식물검역기술개발센터
4농림축산검역본부 영남지역본부
6경북대학교 응용생명과학부
6경북대학교 식물의학연구소

초록

종자의 수입 시, 검역관련 종자전염바이러스는 가장 문제가 되는 식물병이다. 본 연구에서 PCR 검역 체계가 보고되지 않은 3종의 종자전염바이러스, Cherry rasp leaf virus (CRLV), Spinach latent virus (SpLV) 및 White clover mosaic virus (WClMV)를 검출하기 위하여 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)과 nested polymerase chain reaction (nested PCR) 방법을 도 입하였다. 각각의 바이러스별로 2 세트의 RT-PCR primer가 선발되었으며, 증폭산물에서 더욱 높은 감 도로 검출 할 수 있는 nested PCR primer set를 개발하였다. 본 연구에서 사용한 RT-PCR과 nested PCR 방법은 종자로부터 CRLV, SpLV 및 WClMV를 검역하는 고효율적 진단시스템으로 제공될 것이다.


    Animal and plant Quarantine Agency

    I.서론

    최근 종자산업은 수입개방화와 함께 전 세계적으로 확대되고 있으며(Rural Development Administration, 2012), 이에 따라 종자전염 병원체 또한 증가될 수 있는 가능성을 가지게 되었다(Lee et al., 2013c). 종 자전염 하는 병원체 중에 가장 큰 문제가 되고 있는 것은 바이러스병이며, 이들은 유통 및 재배과정에서 주변 건전식물체에 대량으로 전염되어 막대한 경제 적 피해를 야기할 수 있는 특징을 가지고 있다 (Shin, 2009). 농림축산검역본부 예규 107호(2012) 에 의하면, 우리나라에서는 종자전염바이러스 중에 서, 32종을 ‘종자전염검역바이러스’ 로 지정하여, 수입 종자시료에서 검역검사가 수행되고 있다.

    현재 우리나라 종자수입량은 최근 5년간 연간 약 6,000건 정도이며, 건당 약 3.1 ton이 수입되고 있 는 특성을 가지고 있다(Lee, 2013). 우리나라에서는 이러한 잠복성 종자전염검역바이러스들을 검사하기 위해, 오랜 기간 동안 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 방법(Adina et al., 1979)을 사용해 왔으나, 대량으로 수입되는 건전종자에 포함된 소수 의 감염종자에서도 극히 미량 분포하는 종자전염검 역바이러스를 진단 할 수 있는 검출 감도의 문제가 끊임없이 제기되어 왔으며(Lee et al., 2013c), 또한 ELISA의 거짓양성반응(Caruso et al., 2003) 등은 종자전염바이러스의 정밀진단과 검역처분에 많은 어 려움을 주고있다. 한편, 많은 연구자들에 의해 연구 되어 온 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)과 nested polymerase chain reaction (nested PCR) 방법(Kim et al., 2000; Kim et al., 2005)은 ELISA에 비해 높은 민감성으 로 바이러스 검출율을 보이고 있으며, 최근 진단의 대부분을 차지하는 안정성 높은 검사방법(Lee et al., 2011a; 2011b)이다. 그러나, 이러한 PCR 방법 들은 여러 연구자들에 의해 개발되어 조건이 서로 상이하여 많은 검사를 수행해야하는 일선검역현장에 서의 활용이 불편하였다(Lee et al., 2013c). 이에 따라 RT-PCR과 nested PCR의 조건에 맞춘 검사법 들이 개발되어 검역현장에서 활용되고 있다(Lee et al., 2013a; 2013b; 2013c).

    종자전염검역바이러스 중에서도 금지급과 관리급 으로 규정되어 있는 병원체들(Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency, 2013)은 국내 미기록 종으로 금지품 수입허가가 까 다로울 뿐 아니라 시료를 수집하기도 매우 어려워 연구가 어려움을 겪고 있다(Lee, 2013). 그러나 최 근 유전자의 인공합성(gene synthesis) 기술의 보급 은, 어떤 병원체의 유전정보(nucleotide sequence) 를 알면 유전자들을 합성하여 실험 재료로 사용할 수 있는데, 예를 들어 구제역 유전자 VP1을 제작하 여 Agrobacterium의 형질 전환(Lee et al., 1999)을 하거나, 유전자 인공합성으로 고병원성 미생물 진단 에 사용(Han, 2008)되는 등, 분자생물 연구에 영향 을 주고 있다.

    따라서 본 연구에서는 우리나라에서 관리급으로 규정하여 검역검사를 수행중인 종자전염검역바이러 스 중, Cherry rasp leaf virus (CRLV), Spinach latent virus (SpLV) 및 White clover mosaic virus (WClMV)를 대상으로 유전자 합성을 기반으로 검역검사에 사용할 수 있는 RT-PCR과 nested PCR 검사법을 개발하였다.

    II.MATERIALS AND METHODS

    2.1.Primer 제작

    미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)로부터 검사법 개발대상인 CRLV (NC_006271), SpLV (NC_003808) 및 WClMV (NC_003820)의 유전자 정보들 과, 계통분류학적 유연관계에 있는 참고 바이러스주 들의 유전자 정보를 수집하여, 각각 BioEdit version 7.1.3을 사용하여 multiple alignment 하였 다(Hall, 1999). Primer 제작은 DNAMAN DNA analysis software package (DNAMAN version 6.0; Lynnon Biosoft, Canada)를 사용하였으며, primer Tm 값은 우리나라 검역바이러스의 PCR 검 사법(Lee et al., 2013a; Lee et al., 2013c; Lee et al., 2013c)과 동일한 조건으로 수행하였다(Lee, 2013). PCR module 개발 대상바이러스 3종에 대하 여 탐색된 종 특이적 primer들을 조합하여 PCR 증 폭이 가능(70-1,300 bp)한 primer sets로 구성하였 다(data not shown). 유전자 합성된 plasmid 안에 서 CRLV는 정방향 4개, 역방향 4개의 primers가 설계되었으며, PCR 증폭이 가능한 13 sets가 조합되 었다. SpLV는 정방향 9개, 역방향 7개의 primers가 설계되었고, PCR 증폭이 가능한 52 sets가 조합되 었으며, WClMV는 정방향 6개, 역방향 5개의 primers를 조합하여 PCR 증폭이 가능한 18 sets가 조합되었다(data not shown).

    2.2.유전자합성 및 시료확보

    종자전염검역바이러스 CRLV (NC_006271)는 2,491 -3,290 bp 부분을 유전자 합성하였고, SpLV (NC_003808)는 2,182-2981 bp 부분의 유전자를 합 성하였고, WClMV (NC_003820)는 4,187-4,986 bp 부분의 유전자를 합성하여 모두 800 bp의 크기로 합 성하였으며(Bioneer, Korea), 합성된 유전자들은 1 ng/μℓ로 정량하여 실험에 사용하였다. 한편 종 특이 적 primer 선발실험에서, 비 특이적 분석에 사용된 Alfalfa mosaic virus (AMV) 등 20종의 참고 바이 러스 주(계통분류학적 유연관계, 유사염기서열 및 동 일 기주 감염 바이러스)들은 국내기업(Bi-One, Korea; Plutos, Korea), 식물바이러스은행 및 유사 기관을 통해 이병시료, RNA 및 cDNA를 구매하여 실험에 사용하였다(Table 1). 종자전염검역바이러스 인 CRLV가 감염될 수 있는 사과, 복숭아와 SpLV가 감염될 수 있는 시금치 및 WClMV는 시금치, 완두 및 클로버에서 감염이 발생할 가능성이 제기됨에 따 라 각각의 건전 종자 또는 시료들을 구매하였다.

    2.3.핵산추출

    이병시료의 핵산추출은 각 시료 0.2 g을 멸균된 막자사발에 담아 액체질소를 첨가하여 마쇄한 뒤 (Lee et al., 2013a), RNeasy® Plant mini kit (Qiagen, Netherlands)를 사용하여 제품의 프로토 콜에 따라 수행하였다(Lee et al., 2013c).

    2.4.Primer 선발

    검사법 개발 대상인 종자전염검역바이러스 3종 (CRLV, SpLV 및 WClMV)이 모두 RNA 바이러스 인 것을 감안하여, 유전자 합성을 통한 plasmid 상태이지만, 역전사 과정을 포함한 RT-PCR을 수 행하였다. RT-PCR은 주형 핵산을 1 μℓ로, primer (정방향 및 역방향) 각 1 μℓ, deionized distilled water (DDH20; Sigma, USA) 7 μℓ 및 RT-PCR PreMixture (Plutos, Korea) 10 μℓ를 넣어 총 20 μℓ로 수행하였다. Primer set의 선발은 우선, RT-PCR로 target virus에 특이적인지 여부를 확인 한 뒤, 특이적 반응을 보이는 primer set를 대상으 로 참고 바이러스 주와 감염가능성이 있는 시료의 genomic DNA에 비 특이적 반응을 검정하여 primer 를 선발해 나가는 방식으로 수행하였다(Lee, 2013a). CRLV의 primer set와 비 특이성을 확인하기 위한 ArMV, AVB, CLRV, GFLV, PRMV, SLRSV, TRSV, TBRV, PNRSV, CRSV, LChV 및 PDV를 대 상으로 수행하였고, SpLV는 PDV, PNRSV, TSV 및 BBWV를 대상으로 수행하였으며, WClMV는 PVX, TSV, AMV, ArMV, SLRSV, BBWV, TSWV, TNV 및 WMV를 대상으로 비 특이적 반응 실험을 수행하 였다. 또한, PCR 조건은 우리나라에서 현재 사용 중 인 종자전염 바이러스 PCR 검사법 규정과 동일하게 사용하였다(Lee, 2013a; Lee, 2013b; Lee, 2013c). 이후 PCR 산물은 1x TAE buffer를 이용한 1.2% 아 가로즈겔 150 mℓ에 TopRed nucleic acid gel stain (Biopure, United Kingdom) 4 μℓ을 넣어 80분간 전기영동 하였으며, UV하에서 밴드를 확인하였다 (Lee, 2013b).

    2.5.검출감도 및 nested PCR

    선발한 primer set의 민감성을 실험하기 위하여 합성된 유전자 plasmid를 10-3-10-10까지 희석하 여 주형으로 선발된 primer들의 민감성을 검정하 였으며, 최종 선발된 각각의 RT-PCR primer set 로부터 증폭된 산물로부터 nested PCR primer를 선발하여, 최종 분석용 산물을 선발하고자 하였다. Nested PCR은 RT-PCR 산물을 100배 희석하여 1 μℓ를 주형으로 사용하였고, 설계한 nested PCR primer (정방향 및 역방향) 각 1 μℓ, DDH20 7 μℓ 및 nested-PCR PreMixture (Plutos, Korea) 10 μℓ를 포함하여 총 20 μℓ로 수행하였으며(Lee, 2013), 최종적으로 RT-PCR 산물과 크기차이가 확실히 나면서 가장 선명한 밴드를 나타내는 primer set를 최종적으로 선발하였다. Nested PCR 조건은 RT-PCR의 역전사반응을 뺀 나머지 반응으로 수행되었다.

    III.결과 및 고찰

    PCR 검사시스템 개발을 목적으로 하는 3종의 종 자전염검역바이러스의 PCR 증폭이 가능한 모든 primer set에서 밴드가 확인되었으나, 이 중에서 PCR 증폭산물의 크기와 증폭 부위 및 산물의 양을 고려하여 각각 4개의 primer set (CRLV set 3, 5, 8 및 11; SpLV set 11, 35, 46 및 52 및 WClMV set 9, 10, 11 및 14)를 종 특이적 primer set로 선 발하였다. 한편 선발된 종 특이적인 primer 4 set씩 을 대상으로 각각의 비 특이적 특성을 확인하기 위 한 실험을 수행한 결과, CRLV는 primer set 3에서 CRSV와의 비 특이적인 반응이 나타나 선발에서 제 외하였고, 증폭산물의 위치를 고려하여 set 5와 11을 선발하였다. SpLV는 primer set 11에서 PNRSV와 비 특이적 반응이 나타났고 primer set 46에서 PDV 와 비 특이적인 반응이 나타나 선발에서 제외하여 set 35와 52를 선발하였다. WClMV는 primer set 10과 13에서 TSV, ArMV, SLRSV 및 BBWV와 비 특이적 반응이 나타나 선발에서 제외하였으며 set 9 와 14를 선발하였다(Fig. 1 and 2).

    합성된 유전자 1 ng/μℓ의 plasmid들은 10-10까지 10단계 희석하여 특이도 분석에서 선정된 각각의 primer set에 적용하고 분석한 결과, CRLV의 primer set 5와 8은 각각 10-8과 10-7까지 검출되었 고, SpLV의 primer set 35와 52는 모두 10-8까지 검출되었으며, WClMV의 primer set 9와 14는 각각 10-8과 10-7까지 검출됨에 따라 각각의 종자전염검역 바이러스들을 검출하기에 적합한 primer로 확인되었 다(Fig. 3).

    CRLV set 5와 11의 각각 2개씩의 nested PCR primer set가 설계되었고, 이 중 set 5의 산물(583 bp)에 대한 nested PCR primer set는 CRLV_F3과 CRLV_R1 조합(392 bp)이 선발되었으며, CRLV set 11의 산물(538 bp)에 대한 nested PCR primer set 는 CRLV_F3와 CRLV_R2의 조합(401 bp)가 가장 적 합한 것으로 분석되었다. SpLV set 35와 52의 nested PCR primer set는 각각 4개와 1개의 조합이 설계되었고, 이 중 SpLV set 35의 산물(738 bp)에 대한 nested PCR primer set는 SpLV_F6과 SpLV_R5의 조합(404 bp)이 선발되었으며, SpLV set 52의 산물(285 bp)에 대한 nested PCR primer set는 SpLV_F6과 SpLV_R5의 조합(122 bp)이 선발 되었다. 또한 WClMV set 9와 31의 nested PCR primer set는 각각 3개와 1개의 조합이 설계되었고, 이 중 WClMV set 9의 산물(592 bp)에 대한 nested PCR primer set는 WClMV_F3과 WClMV_R4의 조 합(425 bp)이 선발되었으며, WClMV set 14의 산물 (387 bp)에 대한 nested PCR primer sets는 WClMV_F5과 WClMV_R4의 조합(327 bp)이 최종 선발되었다(Fig. 3, 4 & Table 2).

    농림축산검역본부 예규 107호인 실험실정밀검사 세부실시요령에 따르면, CRLV는 양벚나무(Prunus avium, Prunus serotina) 종자, SpLV는 시금치 (Spinacia oleracea)종자, WClMV는 클로버 속 (Trifolium spp.) 종자에서 검사하도록 규정되어있 다. 농림축산검역본부 병해충 정보시스템에 따르면, 최근 5년(2009-2013) 양벚나무 종자, 시금치 종자 및 클로버 속 종자는 각각 26건(약 40 kg), 791건 (약 1,511,020 kg) 및 176건(431,910 kg) 수입되었 고, 2013년 현재까지 3종의 종자전염검역바이러스는 모두 ELISA 검사를 수행해왔으며, 아직 검출되어 폐기 또는 반송처분을 기록한 바이러스 없었다. 그 러나, 수입 종자에서 종자전염검역바이러스를 진단 하기 위해 개발된 PCR 검사방법들이 2007년부터 차 례대로 일선검역현장에 적용되어 2006년 78건에서 2007년 145건으로 검출실적이 크게 향상되었고, 2006년 이전에는 검출 실적이 없던 종자전염검역바 이러스인 Cherry leaf roll virus 등을 검출하였으 며, 최근 옥수수와 밀 종자전염을 한다고 알려진 Wheat streak mosaic virus의 경우, RT-PCR 및 nested PCR 검사법을 개발(Lee et al., 2013c)되었 다. 또한 Nepovirus에 속하는 4종(Tomato black ring virus, Arabis mosaic virus, Cherry leaf roll virusGrapevine fanleaf virus)의 PCR 검 사법이 보고되어, 검역현장에서 사용되고 있다. 종자 는 다른 식물류에 비해 검사가 어려워 고도의 검정 기술이 요구되고, 검사시간도 많이 소요되지만(Min, 2009), 이처럼 단일 조건의 RT-PCR과 nested PCR 검역진단 시스템의 개발로 수입종자에서 종자전염바 이러스의 검출이 지속적으로 증가되어, 종자의 수출 입 유통 시 검역의 안전성을 확보하고 있다. 본 연 구에서 개발한 유전자 합성을 기초로 한 종자전염검 역바이러스 3종(CRLV, SpLV 및 WClMV) 역시 1년 정도의 모니터링 및 교차점검 기간을 통해 비 특이 적인 문제점 등을 개선하여 검역현장에서 종자전염 바이러스 검역에 기여할 것이라고 기대된다.

    Figure

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    PCR amplification of specific RT-PCR primer selection for three quarantine seed-transmitted viruses. Panel (A), Specific primer selection of CRLV; Panel (B), specific primer selection of SpLV; and Panel (C), specific primer selection of WClMV. Lane M, 100 bp step DNA Ladder maker (Genepia, Korea); other lanes, specific primer set number of each virus.

    JALS-48-75_F2.gif

    PCR amplification of non-specific selection of RT-PCR primer sets in CRLV, SpLV and WClMV. Panel (A), Reference viruses of CRLV. Lane C, CRLV; Ar, ArMV; A, AVB; CL, CLRV; G, GFLV; PR, PRMV; S, SLRSV; TR, TRSV; TB, TBRV; PN, PNRSV; CR, CRSV; L, LChV; PD, PDV. Panel (B), Reference viruses of SpLV. Lane Sp, SpLV; PD, PDV; PN, PNRSV; T, TSV; B, BBWV. Panel (C), Reference viruses of WClMV. Lane W, WClMV; P, PVX; T, TSV; A, AMV; Ar, ArMV; S, SLRSV; B, BBWV; TS, TSWV; TN, TNV; WM, WMV. Lane M, 100 bp step DNA Ladder maker (Genepia, Korea); lane -, negative control.

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    RT-PCR sensitivity test of the selective primer sets for seed-transmitted viruses. Panel (A), CRLV specific primer sets. Panel (B), SpLV specific primer sets. Panel (C), WClMV specific primer sets. Lane M, 100 bp step DNA Ladder maker; lane 1-8, gene synthesis plasmid 10-3-10-9; lane 9, negative control.

    JALS-48-75_F4.gif

    Nested-PCR products for detection of three seed-transmitted viruses in quarantine. Panel (A), CRLV nested PCR products. Lane 1, CRLV_F1/R1; lane 2, CRLV_F3/R1; lane 3, CRLV_F3/R1; lane 4, CRLV_F3/R2. Panel (B), SpLV nested PCR products. Lane 1, SpLV_F5/R3; lane 2, SpLV_F6/R5; lane 3, SpLV_F7/R6; lane 4, SpLV_F8/R6; lane 5, SpLV_F9/R6. Panel (C), WClMV nested PCR products. Lane 1, WClMV_F2/R2; lane 2, WClMV_F2/R3; lane 3, WClMV_F3/R4; lane 4, WCLMV_F5/R4. Circle, final selected nested primer pairs. Lane M, 100 bp step DNA Ladder maker.

    Table

    List of viral samples used in this study

    Oligo nucleotide sequences of RT-PCR and nested PCR primers for the detection of seed-transmitted CRLV, SpLV and WClMV

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