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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.48 No.3 pp.157-164
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2014.48.3.157

Establishment of a Microsatellite Marker set for Individual Identification in Goat

Sangwon Suh1, Chang-Yeon Cho1, Mi-Jeong Byun1, Seong-Bok Choi1, Young-Sin Kim1, Myeong-Jik Kim1, Yeoung-Gyu Ko1, Dong-Hun Kim1, Hyun-Tae Lim2, Jae-Hwan Kim1*
1Animal Genetic Resources Station, National Institute of Animal Science, RDA, Namwon 590-832, Korea
2Department of Animal Science, Collage of Agriculture and Life Sciences, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Korea
Corresponding author: Jae-Hwan Kim, Tel: 063-620-3522; Fax: 063-620-3590; E-mail: jkim3892@korea.kr
March 20, 2014 May 16, 2014 May 28, 2014

Abstract

The purpose of this study is to establish a set of microsatellite (MS) markers for the individual identification and parentage verification of goat. 17 and 13 MS markers were selected from FAO (Food and Agriculture Organization) and NCBI (National Center for Biotechnology Information), respectively. Genotyping of 30 MS markers was investigated with 455 animals, from 10 goat breeds or populations. Seven markers (SRCRSP1, SRCRSP8, OarFCB048, OarFCB193, BOBT24, INRA063, and DRBP1) were selected, based on heterozygosity value, and PCR product size. Moreover, multiplex PCR was applied, for genotyping these seven selected markers. Mean values of expected heterozygosity (HExp) and polymorphic information content (PIC) were calculated as 0.710 and 0.674, respectively. The expected probability of identity among genotypes of random individuals (PI), probability of identity among genotypes from random half sibs (PI half-sibs), and probability of identity among genotypes from random sibs (PI sibs), were estimated as 2.42×10-11, 1.70×10-8 and 2.22×10-4, respectively. These results indicate that the established MS marker set is useful for effective improvement and stable distribution of the goat in Korea.


염소의 개체식별에 활용 가능한 초위성체 마커 세트 확립

서 상원1, 조 창연1, 변 미정1, 최 성복1, 김 영신1, 김 명직1, 고 응규1, 김 동훈1, 임 현태2, 김 재환1*
1국립축산과학원 가축유전자원시험장
2경상대학교 농업생명과학대학 축산학과

초록

본 연구의 목적은 염소의 개체식별에 있어서 효율적인 microsatellite (MS) marker set를 확립하는데 있다. 염소 10집단 455두를 대상으로 국제식량농업기구(FAO) 권고 및 미국 국립생물정보센터(NCBI)에서 수집한 30개 MS 마커에 대한 유전정보량을 확인한 후 대립유전자형 크기, 형광표지 종류, PCR 조건 등 을 고려하여 7개의 MS 마커(SRCRSP1, SRCRSP8, OarFCB048, OarFCB193, BOBT24, INRA063, DRBP1)를 선정하였다. 또한 분석 효율성을 극대화하기 위해 7개 마커에 대해서 multiplex PCR 기법을 적용하였다. 분석된 7개 MS 좌위에서 총 80개의 대립유전자형이 관찰되었고, 기대이형접합도(HExp) 및 다형정보지수(PIC)의 평균치는 0.710 및 0.674로 산출되었다. 7개 좌위의 다형성을 기반으로 무작위 교 배집단, 반형매 교배집단 그리고 전형매 교배집단으로 가정하였을 때의 동일개체 출현확률은 각각 2.42×10-11, 1.70×10-8 및 2.22×10-4으로 산출되었다. 이상의 결과는 국내에서 사육되고 있는 염소의 개체수를 고려할 경우 동일개체 출현 가능성이 없는 것으로 판단된다. 따라서 본 연구에 의해서 구축된 염소 개체식별 마커 세트 및 분석방법은 우리나라 염소의 개량 및 안전유통에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.


    Rural Development Administration
    PJ008431

    I.서론

    고고학적 연구에 의하면 염소는 가장 먼저 가축화 된 종으로 추정되고 있다(Pringle 1998; Zeder & Hesse 2000). 또한 전 세계적으로 가장 중요한 가축 중의 하나로, 고기, 젖, 가죽, 털, 뼈, 연료 등 다양 한 범위의 생산물들이 유용하게 이용되고 있다 (MacHugh & Bradley, 2001; Porter, 1996). 우리 나라의 염소사육의 역사는 약 2000년 전으로 추정되 고 있다. Kang (1967)에 의하면 염소의 한반도 유입 경로는 인도북부의 산악지역으로부터 몽골을 거쳐 한반도로 유입되었거나, Devendra et al. (1976)의 의견과 유사하게 중동지역에서 동남아시아로 유입된 후 중국 남쪽 바다를 통해서 한반도 남쪽지역으로 유입되었을 것으로 추정되고 있다.

    우리나라에서 염소는 주로 약용 및 건강보조식품 으로 이용되었으나(Son, 1999), 최근 들어 외식산업 의 발달, 웰빙·건강 식품에 대한 소비자의 선호도 증가로 염소의 소비가 증가하고 있다(Choi et al., 2010). 우리나라 재래염소는 발육이 늦고 산육성이 떨어지는 등 생산성이 낮기 때문에 생산성 향상을 위해 외래종과 교잡이 이루어지면서 농가 등에서 사 육되고 있는 염소는 거의 교잡종으로 추정된다(Kim et al., 2002). 하지만 농촌진흥청 국립축산과학원은 1990년대 초반에 외형적·지역적 특성을 고려하여 3 개 지역(당진, 장수, 통영)으로부터 재래염소를 수집 하여 보존하고 있으며, 이들에 대한 국제주권 주장 을 위해 2012년 FAO (Food and Agriculture Organization; 국제식량농업기구) 산하의 DAD-IS (Domestic Animal Diversity Information System; 가축다양성정보시스템 http://dad.fao.org/)에 품종 등록을 하였다(Choi et al., 2012).

    우리나라의 염소는 14천여 농가에서 약 248천여 두(평균 17.5두/농가)가 사육되고 있으며, 염소농가 가 부업규모에서 전업형태로 전환되고 있다(RDA, 2012). 하지만 이에 따라 여러 가지 해결해야 될 문 제점들이 발생하고 있으며, 그 중 염소의 개량 및 유통시스템이 시급하게 떠오르고 있다(Son, 1999). 일반 농가에서 사육 중인 염소에 대한 혈통정보 확 보가 불가능한 실정이며, 또한 꾸준히 증가하고 있 는 수입산 고기와 국내산 염소 고기의 구분이 불가 능하여 추후 수입육이 국내산 고기로의 둔갑이 예상 된다. 따라서 염소의 생산성 향상을 위한 개량과 함 께 국내산 고기의 안전한 유통을 위해서는 사육염소 의 개체관리와 생산이력제 시행이 필수적이며, 이를 위해서는 염소의 개체를 식별할 수 있는 시스템이 사전에 구축되어야 할 것이다.

    초위성체 (MS; microsatellite)는 유전적 정보가 풍부하며(Tautz & Renz, 1984), 2개 이상의 MS 마 커를 1회에 증폭 및 분석할 수 있는 멀티플렉스 (multiplex) PCR 기법을 적용하여 저비용으로 손쉽 게 대립유전자형을 분석할 수 있는 장점이 있다 (Butler, 2007). 이러한 특성을 이용하여 1990년대 초반부터 사람, 가축 등을 대상으로 집단 혹은 품종 의 유전적 다양성, 양적유전좌위 동정, 개체식별 등 을 위한 유전적 마커로 이용되고 있다 (Naidoo & Chetty, 1998; Gutiérrez-Gil et al., 2010; Costa et al., 2012; Nomura et al., 2012, Wang et al., 2014). 국내에서도 수입육 판별 및 가축생산이력 등 에 초위성체 마커가 활용되고 있다(Lim et al., 2005; Lim et al., 2009a; Lim et al., 2009b).

    본 연구는 염소의 유전적 분석에 활용되고 있는 초위성체 마커를 수집하고 각 마커별 효율성을 검 증한 후 염소 집단의 개체식별에 적용 가능한 마커 선정 및 효율적인 분석시스템을 개발하고자 실시하 였다.

    II.재료 및 방법

    2.1.공시 동물 및 DNA

    본 연구에서는 국립축산과학원 가축유전자원시험 장에서 보존·사육 중인 재래염소 266두(당진축, 장 수축, 통영축)와 2개 지역(경북, 전남) 농가염소 153 두를 공시하였으며, 추가적으로 자아넨(Saanen), 토 겐버그(Toggenburg), 알파인(Alpine), 보어(Boer), 누비안(Nubian) 등 5개 외래품종 36두를 공시하여 분석에 이용하였다(Table 1). 전체 455두의 혈액을 이용한 genomic DNA 추출은 MagExtractor (TOYOBO, Japan)을 사용하였다.

    2.2.초위성체 마커 수집 및 primer 제작

    FAO에서 권고한 14종(BM6444, CSRD0247, DRBP1, ETH10, ILSTS029, INRA023, INRA063, McM527, OarFCB020, OarFCB048, SRCRSP005, SRCRSP023, SRCRSP008, TGAL53)과 NCBI (National Center for Biotechnology Information; 미국 국립생물정보센터)로부터 16종(BM1258, BM 1239, BM1818, BOBT24, ILSTS008, ILSTS019, ILSTS087, INRA005, INRA006, INRA049, INRA 172, INRA185, INRA005, INRA006, INRA049, INRA172, INRA185, OarFCB193, RM006, SRC RSP001, SRCRSP024) 등 총 30종의 초위성체 마 커에 대한 정보를 수집한 후 각각을 증폭하기 위한 primer를 제작하였다. 제작 과정에서 각 마커의 증 폭을 위한 2개의 primer 중 하나에 형광물질(FAM, VIC, NED 혹은 PET)을 표지하였다(Table 2).

    2.3.PCR 증폭 및 전기영동

    PCR 반응은 AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Applied Biosystems, USA)를 이용하였으며, 주형 DNA 1 μℓ (10ng/μℓ), primer 혼합물 6.8 μℓ 및 증 류수를 첨가하여 최종 부피를 20 μℓ로 반응하였다. PCR 증폭은 95°C에서 15분 동안 초기변성 후 95°C에서 30초, 55~60°C에서 90초, 72°C에서 90초를 1 cycle로 하여 35회 반복하였으며, 그 후 72°C에서 40분간 최종 신장시켰다. PCR 산물을 크 기별로 구별하기 위해서 위하여 Hi-Di Formamide 및 GeneScanTM-500 LIZ Size Standard (Applied Biosystems, USA)을 혼합한 후 95°C에서 10분간 변성 후 ABI PRISM 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 전기영동을 실시하였다. GeneMapper version 4.0 software (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 각 초위성 체 마커에 대한 대립유전자의 정확한 크기를 결정하 였으며, 이 결과는 Microsoft Excel (Microsoft, ver. 2007, USA)을 이용하여 취합한 후 통계분석에 이용하였다.

    2.4.통계 분석

    MS tool Kit (Park, 2001)를 이용하여 이형접합 률 (HExp; Heterozygosity), 다양성정보지수 (PIC; Polymorphic Information Content) 및 마커별 대 립유전자의 빈도를 산출하였다. 또한 Wier & Hill (2002) 추정법에 의한 F-통계량(FST, FIS) 값은 FSTAT ver. 2.9.3 (Goudet, 2001)으로 계산하였다. 추정된 F-통계량에 근거하여 무작위 교배집단, 반형 매 교배집단 그리고 전형매 교배집단으로 가정하였 을 때의 동일개체 출현확률(PI; probability of identity)은 API-CALC ver. 1.0 (Ayres & Overall, 2004)을 이용하여 산출하였다.

    III.결과 및 고찰

    본 연구는 한국재래염소, 농가염소 및 외래품종을 대상으로 초위성체 마커 분석을 통하여 우리나라에 서 사육되고 있는 염소의 개체식별을 위한 효율적인 분석법을 개발하기 위하여 실시하였다. 이를 위하여 FAO권고 및 NCBI에서 수집한 총 30종의 MS 마커 를 이용하여 10개 집단 455두의 염소를 대상으로 대 립유전자형을 분석하고, 이를 토대로 각 마커별 대 립유전자의 수와 크기, 기대이형접합도(HExp), 다형 정보지수(PIC) 등을 산출하였다(Table 2). 대립유전 자의 수는 BM6444 좌위에서 26개로 가장 많았으며, ETH3좌위에서 가장 적은 3개로 나타났다. 또한 대 립유전자 크기 범위는 SRCRSP23 (81-107 bp)이 가 장 작은 반면 BM1818 (254-270 bp)이 가장 큰 것 으로 확인되었다. HExp와 PIC는 BM6444가 0.883, 0.872로 가장 높은 수치를 나타낸 반면에 ETH10이 0.274, 0.257로 가장 낮은 수치를 보였다. Botstein 등 (1980)은 HExp≥0.60, PIC≥0.50을 나타내는 마 커는 특정 품종 혹은 집단의 유전적 다양성 파악, 유연관계 분석 등 가축유전자원의 분자유전학적 특 성평가 적용에 적당한 유전적 정보량을 가지고 있는 것으로 보고하였다. 이를 기준으로 7개의 마커 (SRCRSP24, OarFCB20, INRA49, BM1818, INR A5, INRA185, ETH10)를 제외한 23개의 마커는 유 전적으로 풍부한 정보를 가지고 있으며, 우리나라 재래염소를 포함한 염소의 분자유전학적 특성평가에 활용이 가능할 것으로 사료된다.

    유전적 정보량이 높은 마커를 선발하고, 이를 이 용하여 염소의 개체식별에 적용이 가능한 마커 세트 및 효율적인 분석시스템을 구성하는 것이 본 연구의 목적이다. 따라서 유전적 정보량이 낮은 7개의 마커 를 제외한 23개의 마커를 대상으로 annealing 온도, 형광 표지 및 대립유전자 크기를 고려하여 선발된 다수의 multiplex PCR set를 제작하였다. 그에 따 라 다수의 primer를 혼합·증폭하는 multiplex PCR 을 실시한 후 이 증폭산물을 모세관 전기영동 하였 다. 그 결과 OarFCB48, OarFCB193, SRCRSP008, SRCRSP001, INRA63, BOBT24 및 DRBP1의 7개 마커 조합에서 각각의 마커에 대한 대립유전자형이 정확히 구분되었다(Fig. 1).

    선발 및 분석된 7개 MS 마커의 대립유전자형의 수, HExp 및 PIC값을 Table 3에 제시하였다. 염소 10개 집단 455두를 대상으로 7개 MS marker의 대 립유전자형은 총 80개가 관찰되었으며, 평균은 11.42개였다. HExp의 평균값은 0.738, PIC의 평균치 는 0.707로 상당히 높은 값임을 확인할 수 있었다.

    30개 및 선별된 7개 MS 마커의 대립유전자형 빈도를 이용하여 FST및 FIS값을 계산한 결과, 30개 MS marker의 FST=0.134, FIS=0.109그리고 선별 된 7개 MS marker의 FST=0.094, FIS=0.097로 나 타났다. 이 결과를 이용하여 무작위 교배집단 (PI; probability of identity), 반형매 교배집단 (PIhalf-sibs; PI from half sibs)그리고 전형매 교배 집단 (PIsibs; PI from sibs)으로 가정하여 MS marker 유전자형의 동일한 개체가 출현할 확률을 추정하였다. Table 4에서 보는 바와 같이 전체 30 개 MS marker를 사용하였을 경우 동일개체 출현 확률은 PI=3.85×10-43, PIhalf-sibs=3.73×10-32, PIsibs=7.46×10-16으로 추정되었으며, 최종 선정된 7개 MS 마커를 사용하였을 경우 동일개체 출현 확률은 PI=2.42×10-11, PIhalf-sibs=1.70×10-8, PIsibs=2.22×10-4으로 추정되었다. 2011년 기준으 로 국내에서 사육되고 있는 염소의 수가 25만여 두(RDA, 2012)이므로 이를 고려한 동일개체 출현 확률에 있어 Table 4의 결과와 같이 7개의 MS 마 커 조합을 이용한다면 동일개체가 출현할 가능성 이 없는 것으로 판단된다.

    본 연구에서는 유전정보량이 높은 7개의 MS 마커 를 선발하였고, multiplex-PCR 기법을 적용하여 마 커별 유전자형을 한번의 반응을 통하여 효율적으로 분석할 수 있는 시스템을 확립하였다. 또한 국내에서 사육중인 염소의 개체 수를 고려할 경우 7개 마커의 유전자형 분석결과로부터 추정된 동일개체 출현확률 은 염소의 개체식별에 충분히 적용이 가능한 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구의 결과는 염소의 개량에 필요한 개체관리와 함께 추후 염소 고기의 안전유통 을 위한 생산이력시스템에 적용함으로써 우리나라 염 소 산업의 활성화를 위해 유용할 것으로 사료된다.

    Figure

    JALS-48-157_F1.gif

    A genetic profile obtained with the multiplex PCR, using the 7 MS markers.

    Table

    The 10 goat breeds/populations used in this study

    Genetic parameters for each MS marker across the 10 goat breeds/populations

    1Forward primers were labeled with fluorescent dyes,2Annealing temperature,3Number of alleles,4Expected heterozygosity,5Polymorphic information contents,6The selected 7 MS markers are in bold.

    Number of alleles (NA), expected heterozygosity (HExp) and polymorphic information contents (PIC) for each of the 7 markers, across the 10 goat breeds/populations

    Statistical results for individual goat identification, using the 7 MS markers

    *Expected probability of identity among genotypes of random individuals (PI)**Probability of identity among genotypes from random half sibs (PIhalf-sibs)***Probability of identity among genotypes from random sibs (PIsibs)

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