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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.48 No.4 pp.13-25
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2014.48.4.13

Isolation and Salt Tolerance Analysis of Brassica rapa Salt Overly Sensitive 3 (BrSOS3) Gene

Jae-Gyeong Yu, Jung-Woo Lee, Young-Doo Park*
Department of Horticultural Biotechnology, College of Life Science, Kyunghee University, Yongin, Gyeonggido, 446-701, Republic of Korea
Corresponding Author: Young-Doo Park, Tel: +82-31-201-2663, Fax: +82-31-202-8395, E-mail: ydpark@khu.ac.kr
March 12, 2014 June 11, 2014 August 4, 2014

Abstract

To analyze the physiological role of the Salt Overly Sensitive (SOS) genes, BrSOS1 (3,432 nt), BrSOS2 (1,341 nt), and BrSOS3 (666 nt) were identified, and then transgenic tobaccos were generated the pSO3 line containing BrSOS3 full length cDNA and the pSI3 line down-regulated Nicotiana tabacumSOS3 (NtSOS3) by RNA interference (RNAi) technique, respectively. When both transgenic lines were treated 200 mM NaCl for 5 days, NtSOS3 expression level in pSO3 line was increased over 2.5-fold than wild type control and decreased up to 4-fold in pSI3 line. For phenotype analysis, the pSO3 line was found to resist against salinity stress by showing normal growths. However, the pSI3 line lost salt tolerance. Based on these results, we supposed that BrSOS3 might be closely related to the enhancement of salt tolerance.


배추 Salt Overly Sensitive 3 (BrSOS3) 유전자의 분리 및 염 저항성 검정

유 재경, 이 정우, 박 영두*
경희대학교 생명과학대학 원예생명공학과

초록

내혼계 배추에서 BrSOS1 (3,432개 뉴클레오티드), BrSOS2 (1,341개 뉴클레오티드), BrSOS3 (666개 뉴클레오티드) 유전자들을 동정하였으며, 담배를 대상으로 BrSOS3 완전장이 전이되는 pSO3 계통과 RNA interference(RNAi) 기법으로 담배 SOS3(NtSOS3) 유전자의 발현을 억제하는 pSI3 계통을 생산 하였다. 두 계통을 200mM NaCl에서 5일동안 염 스트레스 처리를 한 결과, pSO3 계통은 NtSOS3의 발현이 비형질전환체 대비 2.5배 이상 증가하였고, pSI3 계통에서는 4배까지 감소하였다. 표현형 분석 에서도 pSO3 계통은 정상적인 생육을 보임으로써 염 스트레스에 저항성을 가지는 것으로 나타났지만, pSI3 계통은 그렇지 못하였다. 위 결과들을 근거로 BrSOS3 유전자의 발현은 작물의 염 저항성 향상에 매우 밀접하게 연관된 것으로 판단된다.


    Rural Development Administration
    PJ008118022014
    PJ008076012014

    I.서론

    다양한 비생물적 스트레스 중에서 토양의 염 집적 은 거의 대부분의 작물에서 그들의 생장 및 생존을 위협하는 큰 요인 중에 하나이다. 이러한 염 스트레 스는 100개국 이상의 국가에서 농업작물의 수확량을 감소시키고 있는 것으로 보고되었다(Flowers & Yeo, 1995; Munns, 2002, Rengasamy, 2006). 상 대적으로 높은 농도의 염이 토양에 집적되면 식물체 의 수분 흡수를 제한하게 되어 식물 세포의 죽음으 로 이어진다(Munns, 2002). 또한 삼투성 스트레스 (osmotic stress)와 이온 유독성(ion toxicity)으로 잘 알려진 Na+이온의 세포 내 증가는 산화적 스트 레스(oxidative stress)로 이어져 식물체 생육에 불 리하게 작용하지만, 작물의 염 저항성 획득이 산화 적 스트레스에 대한 내성을 향상시켜 주었다는 보고 도 있다(Hernandez et al., 2001). 그러므로 염 스 트레스 저항성 작물의 개발 연구는 농업 생산량의 유지 및 증가를 위해 계속적으로 요구되고 있다.

    2000년도 전후로 활발히 이루어진 유전적, 생리 적 연구 결과들은 Salt Overly Sensitive (SOS) 유 전자군중 특히, SOS1, SOS2, SOS3가 세포 내 이온 항상성(ion homeostasis)과 염 저항성을 조절하는 신호 전달 체계에서 중요한 역할을 담당하고 있음을 밝혔다(Gong et al., 2001; Halfter et al., 2000; Liu et al., 2000; Wu et al., 1996; Zhu, 1998 & 2003). 염 스트레스 발생 시 외부에서 Na+이온이 유입되면 세포 내 Ca2+이온이 증가하며, 이를 SOS3 의 calcium binding motif(EF hand domain)가 감 지를 하게 된다. 이 신호는 SOS2/SOS3 kinase complex를 통해 SOS1까지 전해져 Na+이온은 원형 질막 Na+/H+역수송체(antiporter)에 의해 세포 밖 으로 배출되거나, 액포 Na+/H+역수송체에 의해 액 포에 격리되게 된다(Bertorello & Zhu, 2009; Ishitani et al., 2000; Ohta et al., 2003; Qiu et al., 2002; Quintero et al., 2002; Sanchez- Barrena et al., 2005 & 2007; Shi et al., 2000 & 2003). 실제로, 최근 애기장대(Arabidopsis thaliana) 연구에서 AtSOS3의 과발현이 애기장대의 염 저항성 을 크게 향상시키고, AtSOS1, AtSOS2+AtSOS3, AtSOS1+AtSOS2+ AtSOS3가 과발현된 각각의 형 질전환체에서도 저항성이 향상되었음을 보고하였다 (Yang et al., 2009).

    따라서 본 연구는 내혼계 배추(Brassica rapa ssp. pekinensis inbred line‘CT001’)에서 염 저 항성 유전자로 추정되는 BrSOS1 , BrSOS2, BrSOS3를 동정하고, 이들 중 저항성 기작의 시작 점이 되는 BrSOS3의 완전장을 도입시킨 형질전환 담배와 BrSOS3의 단편을 이용하여 Nicotiana tabacumSOS3(NtSOS3) 유전자의 발현을 억제시 킨 형질전환 담배를 생산하여 염 스트레스 처리 시 BrSOS3의 기능을 검정하였다.

    II.재료 및 방법

    2.1.배추에서 SOS1, SOS2, SOS3의 동정

    유전자들의 동정은 Reverse Transcriptase (RT)-PCR을 이용하였으며, 이를 위해 TAIR (www.arabidopsis.org)에 등록된 A. thaliana의 cDNA 염기서열[AT2G01980(AtSOS1 ), AT5G 35410(AtSOS2 ), AT5G24270(AtSOS3 )]과 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록된 B. napus [EU487184(BnSOS1), AY310413(BnSOS2), JF751064 (BnSOS3)], B. juncea[EF206779(BjSOS1), EF190471 (BjSOS2), DQ248965(BjSOS3)]의 mRNA 염기서열 을 우선 확인하였다. 배추와 상동성이 높은 세 가지 식물체의 염기서열을 바탕으로 내혼계 배추에서의 SOS1, SOS2, SOS3를 동정하기 위해 각각의 RT-PCR용 primer set(SOS1-F: 5’-ATG GCG ACT GTA ATC GAC-3’, SOS1-R: 5’-TCA CAT ATC ATT CCT GAA AA-3’, SOS2-F: 5’-ATG ACA AAG AAA ACG AGG AAA-3’, SOS2-R: 5’-TTA AAA CGT GAT TGT TCT GAG-3’, SOS3-F: 5’-ATG GGC TGC TCT CTG TCG A-3’, SOS3-R: 5’-TTA GAA ATA TAG GTT TTG CAA CT-3’)들을 제작하였다. 바 로커 상토(원예범용, 서울바이오)에 파종 후 본엽이 6~7매 된 내혼계 배추(‘CT001’, 시원씨드, 경기 도 평택)에서 RNeasy®PlantMiniKit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 RNA를 추출한 다음, Maxime RT-PCR Premix Kit(iNtRON Biotechnology, Korea)와 제작된 3가지 primer sets를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 증폭된 각각의 RT-PCR product는 pGemT-easy vector(Promaga, USA)에 클로닝한 후 염기서열을 확인하였으며(Macrogen Co., Korea), National Center for Biotechnology Information (NCBI) database를 이용하여 분석하 였다. 분석된 유전자들은 편의상 각각 “BrSOS1”, “BrSOS2”, “BrSOS3”로 가칭하였다.

    2.2.형질전환용 vector 제작

    내혼계 배추에서 동정한 BrSOS 유전자군 중 에서 염 저항성 기작의 시작점으로 추정되는 BrSOS3의 기능을 알아보기 위해, binary vector인 pCA MBIA3301(CAMBIA, Australia)에서 NcoI과 Bst EII를 이용하여 GUS 유전자를 제거하고 동정 한 BrSOS3 완전장을 삽입한 pSO3 vector를 제 작하였다. 또한 RNA interference (RNAi ) 기법 을 활용하여 BrSOS3 내부에서 493bp의 단편을 PCR로 증폭한 다음, pB7 GWIWG2(II) gateway vector (VIB-Ghent university, USA)에 양방향 (sense, antisense)으로 삽입한 pSI3 vector를 제작하였다(Fig. 1). 493 bp의 단편은 BrSOS3에 특이적으로 존재하는 EF-hand domain(calcium binding motif)에서 증폭한 것이며, 이를 위해 사용된 primer set은 SOS3i-F: 5’-GAC CTT CTT GCA TCC GTT ACG C-3’와 SOS3i-R: 5’-TCT TGT GTC CAT GAA TCC GTC GC-3’이다.

    2.3.Agrobacterium을 이용한 담배 형질전환

    형질전환용 pSO3 vector와 pSI3 vector를 무균 상태로 기내 배양된 담배(N. tabacum ‘SR1’)에 각각 형질전환 하였다. 담배 형질전환은 선발 항생 제로 phosphinothricin(ppt)를 사용한 것 외에는 (Lee et al. (2004)에 보고된 방법과 동일하게 진행 하였다.

    2.4.PCR 및 Southern hybridization 분석

    순화된 추정 담배 형질전환체의 잎을 채취하 여 Lee et al . (2004)에 보고된 방법으로 genomic DNA를 추출하였다. 각 T-DNA내 phosphinothricin 저항성 유전자(bar)의 존재 유무 로 형질전환 여부를 판단하기 위해, cauliflower mosaic virus 35S promoter와 phosphinothricin 저항성 유전자(bar) 사이를 증폭하는 Pro-F: 5’-CTC GTC TAC TCC AAG AAT ATC-3’과 BAR-R: 5’-TCA AAT CTC GGT GAC GGG C-3’ primer set을 이용하여 PCR검정을 실시하였 다. PCR 반응은 genomic DNA 1 μL(100 ng), 10 pmol의 Pro-F와 BAR-R primer 각각 1 μL, 멸균 수 17 μL를 Maxime PCR Premix Kit(i-star Taq) (iNtRON Biotechnology, Korea)에 첨가하여 최종 반응액이 20 μL가 되도록 하였다. PCR 조건 은 94°C에서 5분간/1회 처리한 후 95°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 30초 과정을 40회 반복하 고, 마지막으로 72°C에서 10분간/1회 반응하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% agarose gel 상에서 100 V, 30분간 전기영동한 후, ethidium bromide (EtBr) 로 염색하여 UV illuminator상에서 확인하였다. PCR 분석으로 확인된 T0담배 형질전환체들의 세대 진전 후 확보한 T1담배 형질전환체들을 동일한 PCR 분석 방법으로 선발하고 본 연구에 이용하였다. T1 담배 형질전환체들의 도입유전자 copy수를 확인하 기 위해 T-DNA 내 bar 유전자를 대상으로 Southern hybridization 분석을 수행하였다. 형질 전환체의 genomic DNA 30μg을 제한효소 EcoRI을 첨가하여 37°C에서 18시간 동안 반응시킨 후, 0.5 × TAE buffer로 제조한 1% agarose gel 상에서 30 V, 15시간 전기영동하였다. 이 gel을 0.25 N HCl에 10분, 0.4 N NaOH에 25분간 반응시킨 후, 절단된 DNA 단편들을 Hybond-N+ nylon membrane(AmershamBiosciences,UK)으로 옮겼다. 혼성화 단계부터는 Yu et al. (2012)에 보고된 방법 과 동일하게 진행하였다.

    2.5.RNA 추출 및 quantitative real-time RT PCR 분석

    T1담배 형질전환체에서 도입한 BrSOS3가 발현 되 고 있는지 또는 BrSOS3 단편의 double-stranded RNA(dsRNA)에 의해 NtSOS3의 발현이 억제되고 있는지를 확인하기 위해, Yu et al. (2012)에 보고 된 방법으로 형질전환 담배와 비형질전환 담배 (CON)의 잎에서 RNA를 추출하고, quantitative real-time RT PCR 분석을 수행하였다. Quantitative real-time RT PCR 분석에 사용한 primer set은 SOS3real-F: 5’-ATG GGC TGC TCT CTG TCG A-3’과 SOS3real-R: 5’-CAT CAA ATA CAT CAA ATA TCC GA-3’이었다.

    2.6.형질전환체의 염 저항성 분석

    Quantitative real-time RT PCR 분석을 통해 체내 SOS3가 과발현 되거나 발현억제된 것으로 확 인된 형질전환 담배와 대조군인 비형질전환 담배 (CON)를 대상으로 염 스트레스 발생 시 표현형의 변화를 관찰하였다. 염 스트레스는 선행연구결과를 근거로 바로커 상토(원예범용, 서울바이오)에서 실 생 담배의 SOS3 유전자의 발현이 높게 유지되는 10 일동안 200 mM NaCl의 지속처리 조건으로 담배 개체들의 본엽이 6~8매가 되었을 때 처리하였다(자 료 미제출). 실험은 표현형의 변화에 영향을 미칠 수 있는 생물적·비생물적 변수가 최대한 억제하기 위해 생육조건을 광도 250 μmol·m-2·sec-1,광주 기 16시간 명처리/8시간 암처리, 온도 25°C, 습도 30~50%로 조절하여 실시하였다.

    III.결과 및 고찰

    3.1.배추에서 SOS1, SOS2, SOS3 유전자 동정 및 관련 유전자 분석

    내혼계 배추(‘CT001’)의 RNA와 제작된 3쌍의 primer set(SOS1-F와 SOS1-R, SOS2-F와 SOS2-R, SOS3-F와 SOS3-R)을 이용하여 B. rapa SOS1(BrSOS1), SOS2(BrSOS2), SOS3 (BrSOS3)를 동정하였다. 그 결과, 각 유전자들은 BrSOS1 3,432bp, BrSOS2 1,341bp, BrSOS3 666bp의 open reading frame(ORF)으로 이루어져 있음을 확인하였다(Fig. 2). 획득한 염기서열 정보 와 현재까지 공개되어 있는 JWF3P genetic map 에서의 BAC clone 정보를 바탕으로 배추 게놈상 에서 BrSOS1BrSOS2의 위치는 확인할 수 있었 으나, BrSOS3의 위치정보는 아직 공개되어 있지 않았다(National Agricultural Biotechnology Information Center, nabic.rda.go.kr) (Table 1 ). Conserved domain 분석을 통해 BrSOS1은 K+이온 수송에 관여하는 KefB 도메인(Ness & Booth, 1999)이 존재함을 알 수 있었다. BrSOS2 는 생장·발달과 유전자발현 등을 조절하는 serine/ threonine protein kinase 관련 도메인인 STKc_PKA 도메인(Kim et al., 2006)을 지니고 있 었다. BrSOS3는 Ca2+이온과 결합하는 EF-hand 도메인(Ikura, 1996)을 보유하고 있었다. 이들 도 메인 정보를 이용하여 NCBI database의 BlastX 분석 방법으로 타작물의 SOS 유전자군과의 상동성 여부를 분석하였다. BrSOS1B. napus SOS1 mRNA (98%)와 A. thalianaSOS1 mRNA(85%), BrSOS2B. junceaSOS2 mRNA(97%)와 A. thalianaSOS2 mRNA(89%), BrSOS3A. thalianaSOS3 mRNA(87%)와 Glycine max calcineurin B-like protein(74%) 등 각각 높은 아미노산 상동성을 보였다(Fig. 3).

    애기장대 데이터베이스를 기반으로 BrSOS1, BrS OS2, BrSOS3와 관련된 유전자들을 분석한 결과, 총 18개의 유전자가 BrSOS 유전자군에 관여된 것으 로 확인되었으며, 이 중 calcineurin B-like (CB L) protein 그룹에 속하는 5개의 유전자[CBL2(AT 5G55990), CBL5(AT4G01420), CBL6(AT4G16350), CBL7(AT4G26560), CBL10(AT4G33000)]가 BrSOS 유전자군과 긴밀히 연관된 것으로 나타났다(GENEM ANIA, www.genemania.org) (Table 2). 한편, 애 기장대의 AtSOS1, AtSOS2, AtSOS3가 염 저항성 획득에 있어 필수적인 유전자라는 보고 이후 SOS 유전자군에 대한 연구가 다양한 식물체에서 지속적 으로 진행되고 있다[ Chakraborty et al., 2012(B. j uncea); Martínez-Atienza et al., 2007(Oryza sat iva); Núñez-Ramírez et al., 2012(A. thaliana); Tang et al., 2010(Populus trichocarpa)]. 본 연구 에서 동정한 BrSOS1 , BrSOS2, BrSOS3 역시 애 기장대 및 배추과 작물인 갓(B. juncea )나 유채(B. napus)에서 염 저항성과 관련된 해당 유전자들과 높은 상동성을 보였으므로, 동정된 유전자들 역시 염 저항성과 밀접한 관련이 있을 것으로 추측하였 다. 이 중 염 스트레스 환경에서 세포 내 Na+이온 유입 시 직접적인 Na+이온의 배출로 염 저항성 획 득 기작의 시발점이 되는 BrSOS3의 기능을 분석 해 보았다.

    3.2.BrSOS3 유전자 기능 분석

    제작된 pSO3 vector와 pSI3 vector를 이용하여 각각 담배에 형질전환을 실시하였고, T-DNA내 bar 유전자를 특이적으로 증폭하는 PCR검정을 수행해 형질전환이 확인된 pSO3 계통 5개체(pSO3-1, pSO3-2, pSO3-3, pSO3-4, pSO3-5), pSI3 계통 2개체(pSI3-1, pSI3-2)의 T0형질전환체들은 자가수 정을 통하여 T1세대로 세대진전을 하였다. 각각의 T1집단을 다수 파종한 후 각 계통 별로 건실한 2개 체씩을 임의로 선택하여 총 pSO3 계통 10개체 (pSO3-1-1, pSO3-1-2, pSO3-2-1, pSO3-2-2, pSO3-3-1, pSO3-3-2, pSO3-4-1, pSO3-4-2, pSO3-5-1, pSO3-5-2)와 pSI3 계통 4개체 (pSI3-1-1, pSI3-1-2, pSI3-2-1, pSI3-2-2)를 대상으로 bar 유전자 확인용 PCR을 수행하고 PCR product의 염기서열을 분석한 결과, pSO3 계통의 2 개체(pSO3-4-2, pSO3-5-2)를 제외하고는 모두 형질전환체로 확인되었다(Fig. 4A). 선발된 형질전 환체들을 대상으로 염 스트레스 발생 시 내부 SOS 유전자군의 발현 수준을 분석하기 위해 200mM NaCl을 처리한 후, quantitative real-time RT PCR 분석을 수행하였다. 연구의 결과, pSO3 계통 의 경우 체내 SOS3의 발현량이 대조계통(CON) 대 비 1.34~2.84배 증가한 것으로 분석되었다. 한편, BrSOS3의 dsRNA를 형성하는 pSI3 계통의 경우 체 내 SOS3의 발현이 대조계통에 비해 4배까지 감소한 것으로 나타났다(Fig. 4B). 이는 BrSOS3의 dsRNA 에 의해 생성된 small interfering RNAs(siRNAs) 에 인해 상보성이 있는 NtSOS3의 발현이 억제된 결과로 추측된다. Southern hybridization 분석으 로 발현이 크게 증가한 pSO3-3-1과 pSO3-5-1, 발현이 크게 감소한 pSI3-1-1과 pSI3-2-1 개체들 의 각각의 T-DNA 도입 수를 확인한 결과, 4개체 모두 각각의 T-DNA가 담배 게놈 상에 도입되었음 을 알 수 있었다(Fig. 4C).

    표현형 분석에서 BrSOS3가 도입된 것으로 확인 된 8개의 pSO3 개체들은 대조군(CON) 대비 염 스 트레스 환경에 저항성을 보였으며, BrSOS3의 dsRNA에 의해 NtSOS3의 발현이 억제된 것으로 추 측되는 4개의 pSI3 개체들은 대조군과 동일하게 염 스트레스에 저항성을 보이지 못하고, 대조군보다 일 찍 도복현상이 발생하였다(Fig. 4D). 위 결과들은 SOS 유전자군 중 SOS3의 과발현 유도가 식물체의 염 저항성을 1.34~2.84배 정도 향상시켜 염 집적 환경에서 생육이 가능하였다는 연구 보고들과 일치 하는 현상이다(Bertorello & Zhu, 2009; Gong et al., 2004; Quintero et al., 2002; Yang et al., 2009). 이에 따라 BrSOS3의 발현이 담배의 염 저 항성 향상에 기여한 것으로 판단된다. 3계통 모두 염 처리 전과 염 처리 후 5일까지의 엽색은 큰 차이 없이 진한 녹색을 보였으나, 처리 7일째가 되었을 때 pSI3 계통은 엽색이 연해지기 시작하였으며, 10 일째가 되었을 때는 잎의 위조현상이 다수 발생하기 시작하였다. 이는 Yang et al. (2009)에서 보고된 내용과 동일한 결과로 식물체가 염 스트레스를 받게 되면 잎 속의 엽록소가 급격히 감소하여 생장이 멈 추고 잎부터 말라 죽게 되는 현상이 확인 되었다. 이와는 대조적으로 pSO3 계통은 대조군 대비 염 스 트레스에 저항성을 보였다. 겨자(B. juncea)와 포플 러(P. trichocarpa) 연구에서 염 스트레스 시 SOS3 의 과발현은 대조군과 비교하여 형질전환체들의 엽 록소 감소율을 상대적으로 크게 억제하여 작물의 광 합성 효율을 유지함으로써, 정상적인 생육이 가능하 게 한 것으로 보고하였다(Chakraborty et al., 2012; Tang et al., 2010). 이와 유사하게 체내에서 BrSOS3가 추가 발현된 pSO3 계통도 염 스트레스 처리 동안 진한 엽색을 계속 유지함으로써 염 저항 성이 향상된 것으로 추측된다.

    표현형이 확인된 pSO3 계통 8개체와 pSI3 계 통 4개체의 형질전환체들을 대상으로 염 스트레 스 조건에서 계통별로 체내 SOS1 , SOS2 , SOS3 의 발현 수준의 평균값을 도출하고 이를 비교· 분석해 보았다. 연구의 결과, SOS3 의 발현이 2배 이상 증가한 pSO3 계통에서는 SOS1SOS2 의 발현 수준도 함께 증가하였지만, SOS3의 발현이 크게 감소한 pSI3 계통에서는 SOS1 의 발현은 감 소하였으나 SOS2 의 발현 수준은 대조군과 유사 하게 나타났다(Fig. 5). 식물체는 염 스트레스 발 생 시, SOS3 가 세포 내 증가한 Ca2+이온을 감지 하여 protein kinase인 SOS2와 결합하여 ion transporter인 SOS1 을 작동시켜 Na+이온을 세포 밖으로 배출하게 되는 염 저항성 기작도 있지만, SOS2가 “액포 Na+/H+역수송체”의 활성을 촉 진하여 세포 내 Na+이온을 액포로 이동·격리시 키는 기작을 통해 저항성을 향상시키는 것으로 알려져 있다(Bertorello & Zhu, 2009; Quintero et al ., 2002). 또한, SOS2는 Ca2+-SOS3복합체 에 의해 작동하여 Na+이온의 세포막 운송(SOS1 활성, 액포 Na+/H+역수송체 활성)에 관여하는 것 으로 보고되어 있다. 본 실험에서는 SOS3 의 발현 이 크게 감소한 pSI3 계통에서 SOS2 의 발현이 대조군 대비 크게 감소하지 않았다. 그 이유는 SOS2의 C-terminal 쪽의 SOS3와 결합하는 FISL 도메인의 활성이 아닌, N-terminal 쪽의 효모 sucrose non-fermenting 1(SNF1) 또는 동물 AMP-activated protein kinase(AMPK)와 유사한 촉매작용 부위를 가진 serine/threonine kinase 도 메인 때문인 것으로 추측된다. SNF1AMPK 는 세포의 에너지 균형 및 대사 조절에 관여하는 단 백질 인산화효소로서 식물체에는 SNF1-related protein kinase 3(SnRK3) 단백질들이 다양한 세 포막 운송에 관여함으로써 동일한 역할을 하는데, SOS2 가 바로 SnRK3 subfamily 중에 하나이다 (Hardie et al ., 1994; Hrabak et al ., 2003; Liu et al ., 2000). pSI3 계통에서 Na+및 Ca2+이 온의 증가가 SOS3를 작동시키는 것 외에 SnRK3 단백질들의 활성에도 영향을 미쳐 SOS2 의 발현 도 대조군 대비 크게 감소하지 않은 것으로 추정 해 볼 수는 있으나 이를 확인해 보기 위해서는 많은 연구들이 진행되어야 할 것이다.

    결론적으로, 타작물의 SOS 유전자군과의 상동 성 분석, 도메인 분석, 염 스트레스 조건에서 SOS 유전자군의 발현 분석 및 표현형 비교분석을 통해 내혼계 배추(‘CT001’)에서 동정된 BrSOS3의 기능을 유추한 결과, 타작물에서 보고 된 SOS3의 기능과 동일하게 SOS2SOS1으로 이어지는 작물의 염 저항성 기작에 있어 중요한 기능을 하는 것으로 판단된다.

    Figure

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    Vector constructions for tobacco transformation. (A) pSO3 vector containing BrSOS3 full length cDNA. (B) pSI3 vector for down-regulation of N. tabacumSOS3 using a 493 bp fragment of cDNA encoding BrSOS3. LB: left border; T-35S: cauliflower mosaic virus 35S terminator; bar: phosphinothricin resistance gene; P-35S: cauliflower mosaic virus 35S promoter; LacZ: bacterial β-galactosidase gene; T-NOS: nopaline synthase terminator; RB: right border.

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    Full length cDNAs of B. rapa Salt Overly Sensitive (SOS) genes. (A) BrSOS1 containing KefB domain (29~291 amino acid). (B) BrSOS2 containing STKc_PKA domain (11~265 amino acid). (C) BrSOS3 containing EF-hand domain (75~181 amino acid).

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    Phylogenic analyses of BrSOS1 (A), BrSOS2 (B), and BrSOS3 (C). The deduced amino acid sequences of three genes were compared with other organisms using CLC free workbench 3.2.3 program. The gray background indicates high conserved sequences.

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    Characterization of the BrSOS3 gene from pSO3 and pSI3 lines. (A) PCR analysis of transgenic tobacco plants with pSO3 and pSI3 vector. PC: phosphinothricin resistance gene; M: 1Kb size marker; NC: wild type; lane 1-10: transgenic plants of pSO3 line; lane 11-14: transgenic plants of pSI3 line. (B) Expression levels of NtSOS3 in the pSO3 and pSI3 lines compared with wild type using quantitative real-time RT PCR. CON: non-transgenic line; pSO3: BrSOS3 transferring line; pSI3: NtSOS3 down-regulation line. Values are mean ± SE, n=3. (C) Southern hybridization analysis of pSO3-3-1, pSO3-5-1 and pSI3-1-1, pSI3-2-1 transgenic tobaccos. M: DNA size marker. (D) Phenotypic analyses of pSO3 and pSI3 transgenic tobaccos and a non-transgenic tobacco (CON).

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    Comparison of expression levels of SOS1, SOS2, and SOS3 in pSO3 and pSI3 lines. CON: non-transgenic line; pSO3: BrSOS3 expression line; pSI3: NtSOS3 downregulation line. Each value is the mean of all transgenic plants in the same line.

    Table

    Locations of BrSOS1, BrSOS2, and BrSOS3 in B. rapa genome.

    zUntill now, information was not released.

    Eighteen genes linked with BrSOSs in A. thaliana analyzed by GENEMANIA.

    zEMBL-EBI, European Molecular Biology Laboratory - European Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk).

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