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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.48 No.2 pp.69-75
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2014.48.2.69

Paternity Identification Using the Multiplex PCR with Microsatellite Markers in Chicken

Sun-Ae Park, Lee-Kyung Kim, Chang-Min Park, Seung-Chang Kim, Gul-Won Jang, Yong-Min Cho, Mi-Na Park, Bong-Hwan Choi*
Division of Animal Genomics & Bioinformatics, National Institute of Animal Science, RDA, Suwon, 441-706, Republic of Korea
Corresponding author: Bong-Hwan Choi, Tel: +82-31-290-1592; Fax: +82-31-290-1602; E-mail: bhchoi@korea.kr
November 13, 2013 March 7, 2014 March 7, 2014

Abstract

Microsatellite (MS) markers have been a useful genetic marker in determining genetic diversity and individual identification of livestock. However, this study in poultry was not reported actively yet. In order to solve these problems, genetic information of microsatellite markers and more accurate and rapid methods of DNA identification in chicken were acquired. The objective of this study is to develop 12 MS markers consisted of one set that can describe allele frequency and heterozygosity of chicken. In resulting of this analysis using 96 chicken, we has average of 3.08 allele, and heterozygosity of 0.563 and Polymrphism information content(PIC) of 0.482 for 12 MS markers. These results would be provided with basic data for individual identification and paternity identification using chicken traceability in future.


초위성체 표지인자(MS markers)와 다중중합효소연쇄 반응(Multiplex PCR)기법을 이용한 닭의 친자감별

박 선애, 김 이경, 박 창민, 김 승창, 장 길원, 조 용민, 박 미나, 최 봉환*
농촌진흥청 국립축산과학원 동물유전체과

초록

초위성체 표지인자는 가축에서 유전자 다양성, 개체식별 연구를 위한 유전자 마커로 활용되고 있 지만 가축의 가금류에서는 이러한 연구가 미비한 실정이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 닭에서 의 초위성체 마커에 대한 유전정보를 확보하고 보다 정확하고 신속한 유전자 분석 방법의 개발이 필요하다. 본 연구의 목적은 12개의 초위성체 표지인자(MS Marker)를 1세트로 구성된 다중중합효 소연쇄반응(Multiplex PCR)을 이용하여 닭의 대립유전자와 대립유전자 빈도 및 이형접합도을 결 정하는 마커를 개발하는 것이다. 닭 96수를 이용하여 12개 MS marker를 분석한 결과, MS marker에 대한 대립유전자수는 평균 3.08개로 관찰되었다. 12개 초위성체 마커의 이형접합도은 평균 0.563이고 다형정보도(Polymrphism information content : PIC)는 0.482로 계산되었다. 이 결과는 전국적으로 닭의 유전자를 이용한 개체식별 및 친자감별에 이용하기 위한 기초자료 뿐만 아니라 닭 이력제를 정착시킬 수 있는 중요한 기술로 활용 될 수 있을 것이라 사료된다.


    Rural Development Administration
    PJ006711

    I.서론

    1980년대 이후 2013년 현재까지 국민 소득이 빠 르게 증가함에 따라 식생활 수준향상은 육류, 육제 품, 계란 등의 고단백 식품의 소비를 촉진하고, 축산 업이 빠르게 성장하고 있다. 또한 개량종 가축에서 생산되는 축산물보다 안전하고 우리 국민 기호성에 맞는 재래종 고급축산물을 선호하게 되었다. 닭고기 는 영양학적으로도 상당히 훌륭한 식품군에 속하며, 닭고기에는 다른 식물성 단백질에 비해 필수아미노 산의 비율이 높고, 특히 현대인들의 다이어트 식단 으로 큰 인기를 끌고 있다. 닭의 경우 외국 수입품 종에서 생산되는 값싼 닭고기보다는 지방이 적고 맛 이 있는 좋은 재래 닭고기를 찾는 소비층이 증가하 여 토종 재래닭 사육이 새로운 양계산업으로 발전하 기 시작하였다(Park et al., 2004).

    그에 따라 농촌진흥청 국립축산과학원에서는 전국 에서 수집된 토종닭을 바탕으로 토종닭 순수화 복원 및 순수계통 조성 사업을 15년에 걸쳐 시행하였으며, 외모특성 및 주요형질의 유전능력에 따른 선발과 유 전적 특성을 조사하여 2007년 토종닭 순계의 품종복 원을 완성하였다(Suh et al., 2013). 복원된 토종닭 순계를 바탕으로 종계로서의 이용가치를 높이기 위 해 산란능력이 좋고 육질이 우수한 겸용종과 성장이 빠르고 육질이 우수한 육용 토착종 순계 및 맛이 좋 은 재래종 순계를 3원 교배종 형태로 이용하여 맛이 좋고 성장이 빠른 실용 재래닭 ‘우리맛닭’을 개발 하였으며, 2011년 전국 11개의 종계장에 기술이전으 로 산업화하여 연간 500만수의 실용계를 생산하고 있다(NIAS, 2012).

    닭의 품종구별은 일반적으로 외형적 특징이 모색, 정강이색, 체형 등의 표현형을 기준으로 이루어지는 데 도계 후 육의 형태로 전환되면 표현형에 의한 품 종식별은 거의 불가능하게 된다. 이러한 문제점의 발생을 제거하기 위하여 닭의 품종 및 브랜드를 명 확히 구분할 수 있는 DNA 마커의 선정과 활용이 필 요한 실정이라 생각하여, MS marker를 개발하였지 만 소고기 이력시스템 및 돈육의 브랜드 식별, 원산 지 추적 등 (Lim et al., 2009a; Lim et al., 2009b; Lim et al., 2011)의 연구들에 비하면 아직 도 닭의 개체식별 및 친자감별 등에 대한 연구들이 다소 부족한 실정이라고 할 수 있다(Suh et al., 2013)는 여러 연구 결과들을 통해 닭의 유전자 감식 을 실시하였다.

    Simple sequence repeats(SSR)로도 불리는 microsatellite는 non-coding 부위에 존재하는 1-6 bp의 단순 염기서열이 반복되는 부분으로 유전체상 의 빈번한 분포, 높은 변별력 및 검출이 간편한 마 커로서 집단유전학, 유연관계 분석, 친자확인 및 개 체식별에 있어 유용한 DNA 마커로 알려져 있으며 (Tautz, 1998), 소고기 이력제와 개의 친자감별에서 는 이미 다중중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)을 통 해 활발한 동일성 검사가 이루어지고 있다.

    본 연구에서는 닭의 유전자 감식을 위한 초위성체 표지인자(Microsatellite Marker) 개발에 관한 것으 로 보다 자세하게는 초위성체 표지인자를 이용한 Multiplexing PCR을 통해 현재 국내에서 유통되고 있는 대표적인 토종닭 브랜드 ‘우리맛닭’을 대상 으로 12개 마커를 이용하여 기존의 기술보다는 신속 하고 경제적인 방법으로 유전자를 이용한 개체식별 및 친자감별의 사용에 이용하기 위한 기초자료를 제 시하고자 한다.

    II.재료 및 방법

    2.1.공시재료 및 MS marker

    본 연구에서 이용된 공시동물은 ‘우리맛닭’으로 96수를 이용하였으며, 혈액으로부터 genome DNA 추출 키트인 Wizard geonomic DNA purification kit(Promega; USA)를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. 닭의 유전자 개체식별을 위한 Multipex PCR 방법을 통한 유전자 감식방법으로서 선정된 초 위성체 유전자좌(Microsatellite Marker)는 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 의 Mapviewer 데이터베이스에 보고된 닭의 초위성 체 유전자좌들을 기초로 선정하였고, 세부적인 선발 조건인 대립유전형의 출현빈도(Allele Frequency), 프라이머의 어닐링 온도(Annealing Temp), 증폭산 물의 크기(Product Size), 형광물질(Dye) 등을 고려 하여 최종적으로 총 12개 1세트로 다중중합효소연쇄 반응(Multiplex PCR)이 가능하도록 조합하였다 (Table 1).

    2.2.PCR 및 대립유전자형 결정

    다중중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)은 주형 genomic DNA(50ng/μℓ) 6μℓ, 각각의 초위성체 조합 별 형광염색 프라이머(10pmole) 세트당 0.3μℓ-0.4μℓ, Hot start Taq DNA 중합효소(2U/μℓ) 2.6μℓ, 10X buffer 4μℓ, 2.5mM dNTP 3μℓ의 조성에 증류수를 채워 총 반응액은 25μℓ가 되도록 하였다. 상기 혼합 물은 Verti 96 well Thermal Cycler(Applied Biosystem, CA, USA)을 이용하여 95°C에서 15분간 의 첫 반응을 시작으로 94°C에서 40초간 변성, 61°C 에서 40초간 결합, 72°C에서 40초간 신장하여 5 cycle, 94°C에서 40초간 변성, 61°C에서 40초간 결 합, 72°C에서 40초간 신장하여 5cycle, 94°C에서 40 초간 변성 59°C에서 40초간 결합., 72°C에서 40초간 신장하여 25cycle을 실시한 후, 마지막으로 72°C에 서 20분간 최종 신장반응을 실시하였다. PCR 후의 증폭된 산물은 ABI-3730 DNA자동 염기서열 분석장 치(Applied Biosistems, USA)를 이용하여 크기 및 형광물질로 분류되도록 전기영동을 실시하고, GeneMapper version 4.0(Applied Biosustem, USA)을 이용하여 PCR 산물의 크기와 표지인자의 종류별로 분류하여 마이크로 소프트 엑셀(Microsoft Exce,l, USA) 프로그램으로 자료를 수집하였다.

    2.3.자료의 통계분석

    Genotyper Software에 의해 결정되어진 초위성체 표지인자(Microcatedlli Marker)별 대립 유전자들은 Cervus 3.0 program(version 3.0.3 The University of Edinbj)을 이용하여 분석 집단별 및 개체별로 정 리한 후 전체 집단에 대한 관측 이형접합률(observed heterozygosity), 대립유전자 빈도(allele frequency), 각 좌위별 대립유전자수 및 품종 집단별 대립유전자 를 산출하였다(Table 2). 또한 96마리에 대한 기대 및 관측 이형접합률과 PIC (polymorphic information content)값을 산출하여 ‘우리맛닭’에 대한 대립유 전자형의 다양성을 표현하였다(Table 3).

    III.결과 및 고찰

    토종닭 브랜드로 유통되고 있는 ‘우리맛닭’ 96 수를 대상으로 다중중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)로 분석한 결과, 토종닭 집단에서 특이적으로 나타나는 대립유전자 수를 Table 2에서 제시하였다. 본 연구에서 12개 MS marker를 분석한 결과, MS marker에 대한 대립유전자수는 평균 3.08개로 관찰 되었으며, 각각 2개 이상 5개 이하의 대립유전자수 가 관찰되었다. 가장 많은 대립 유전자를 보유한 MS marker는 MICW1330이며 5개의 대립유전자를 가지 고 있다. 최소 2개로 가장 적은 대립유전자를 보유 하고 있는 MS marker는 MICW0078, MICW0295, MICW0216으로 확인되었다. 이때, 발현되는 대립유 전자들이 2개부터 5개까지 보이는 것으로 보아 유전 자표지인 MS marker가 매우 유효하게 활용될 수 있는 것으로 판단된다.

    또한 본 연구에서 12개 MS marker에 대한 분석 결과를 통해 기대되는 이형 접합도(expected heterozygosity: Ex H), 그리고 관측된 이형 접합도 (observed heterozygosity: Ob H)과 PIC 값을 산출 하여 실용토종닭 브랜드에 대한 대립유전자형의 다 양성을 표현하였다(Table 3).

    Botstein et al.(1980)은 PIC≥0.50, Ex H≥0.60 이면 높은 다형정보량을 가지고 있는 마커라고 보고 하였는데, Table 3에서 보는 바와 같이 12개 마커의 다형성 지수 평균은 Ex H=0.563, Ob H=0.581, PIC=0.482로 산출되었다. 이 결과로 분석에 공시된 품종 및 분석된 마커에 비슷한 수준을 따르고 있으 므로, 대립유전자의 특성이 다양하게 나타남을 확인 할 수 있었다. 특히 MICW0330의 경우는 관측된 이 형 접합도가 0.771로 전체에서 가장 높게 나타났으 며, 기대되는 이형 접합도(0.732)와 PIC(0.68) 역시 가장 높은 값을 확인할 수 있었다. LEI0094의 경우 는 전반적으로 낮은 값이 기대되는 이형 접합도 (0.333), 관측이형 접합도(0.334) 그리고 PIC(0.289) 값을 나타내고 있다.

    다른 재래가축을 대상으로 한 유전적 다양성을 연 구한 보고에 의하면 (Chen et al., 2004; Cho and Cho, 2004; Jin et al., 2005; Osman et al., 2005) 재래 가축들의 유전적 변이가 상당한 오랜 기 간 동안 특정 경제형질을 목표로 하여 이를 바탕으 로 개량이 진행되어, 유전적 균일성이 검증된 외래 품종들에 비해 유전적 다양성이 상당히 높게 나타나 는 경향을 보이는 반면에, 특정 지역에서 오랫동안 제한된 종모축을 활용하여 축군이 유지된 경우에는 급격한 유전변이의 감소가 보인다고 언급하고 있다. 본 연구 결과, 한국 재래닭을 이용한 실용토종닭 집 단 내 유전변이가 비교적 낮게 추정된 것은 이러한 이유에서 기인한 것으로 사료된다. 결국 재래닭 집 단에서 보다 실용적인 산업화를 위한 개체 식별 또 는 동일성 검정 시스템의 확립을 위해서는 재래닭 집단 내에서 다양성을 확보하고 있는 MS marker의 발굴을 통해 누적 식별력에 대한 신뢰도를 높일 수 있는 최적의 marker set를 구성하여야 하며, 이를 기본으로 하여 좀 더 다양한 품종 및 집단을 공시하 여 토종닭 및 여러 브랜드 집단의 대립유전자 빈도 차이 및 특이성을 고려하여 마커를 다수 선별한다면 닭의 식별 가능성이 높아질 것으로 판단된다.

    이전까지의 연구들에서는 각각의 MS marker를 이용하여 분석함으로써 유전자 감식용으로 활용하기 에는 유용성 및 정확도가 많이 떨어지며 시간과 비 용이 많이 든다는 단점이 있었다. 이로 인해 육계 산업화를 위한 개체식별에는 한계점이 있었다. 또한 현재 다른 축종에서 개발된 일부의 MS marker들이 친자확인을 위한 용도로 한정하여 사용하고 있는 실 정이므로 좀 더 유용한 MS marker를 선발하고 다 중(Multiplex)으로 이용하므로 닭의 개체 식별과 원 산지 검증의 유효성을 높였다고 판단된다.

    또한 닭고기 유통 시장에서 원산지로부터의 유통 체계 관리와 동일 개체 여부에 대한 검증뿐만 아니 라 현재 활발히 이용되고 있는 소고기 이력 추적제, 개체식별, 개의 친자감별 등과 연계시키는 수단으로 서의 확보는 물론 육계에 대한 안정성 여부를 추적 시키는 검증수단으로서 효과를 얻을 수 있을 것으로 보여진다.

    이에 따라, 본 연구에서 분석된 Multiplexing PCR 시스템을 기반으로 여러 품종에 대한 MS marker 추가적으로 조합하여 효율성이 우수한 Multiplexing PCR을 확립하고 그를 검증하는 연구 가 진행된다면, 각 브랜드 별 차별화 전략을 세우는 데 있어 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대한 다. 또한 실제 국내 토종닭 산업에 적용할 수 있는 토종닭 브랜드 식별 및 생산 이력시스템에 활용이 가능하게 됨으로써 국내 토종닭 브랜드육의 차별화 에 이바지 할 것으로 사료된다.

    IV.결론

    경제성이 향상된 신품종 실용토종닭과 일반 육계 의 유통과정에서 발생하는 유사제품의 판매방지를 위해 신품종 실용토종닭 관련 마커의 개발이 요구 되어졌다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 실용토종 닭의 유전 정보를 확보하고 체계적인 추적시스템을 구축할 필요가 있다. 따라서 본 연구는 12개 Microsatellite Marker(MS marker)를 이용한 다 중중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)을 사용하여 유전정보와 체계적인 추적시스템을 구축하였다. 닭 의 품종에서 나타날 수 있는 여러 대립유전자들을 분석하여 보다 신속하고 정확하며 경제적인 방법으 로 개체 식별 및 친자감별에 활용하여 이력 추적제 의 과학적 근거 마련에 매우 유용하게 사용할 수 있다. 본 연구에서 12개 MS marker를 분석한 결 과를 평균 대립유전자수, 기대되는 이형 접합도 (expected heterozygosity: Ex H), 그리고 관측된 이형 접합도(observed heterozygosity: Ob H)를 제 시하였다. 분석된 결과, MS marker에 대한 대립유 전자수는 평균 3.08개로 관찰되었으며, 각각 2개 이 상 5개 이하의 대립유전자수가 관찰되었다.

    ‘우리맛닭’ 96수에 대한 기대 및 관측 이형접합 율과 PIC 값을 산출하여 실용토종닭 브랜드에 대한 대립유전자형의 다양성을 표현하였다. 12개 마커의 다형성 지수의 평균은 Ex H=0.563, Ob H=0.581, PIC=0.482로 산출되었다. 이 결과로 분석에 공시된 품종 및 분석된 마커에 비슷한 수준을 따르고 있으 므로, 대립유전자의 특성이 다양하게 나타남을 확인 할 수 있었다.

    본 연구에서 분석된 Multiplexing PCR 시스템을 기반으로 개체식별 및 친자감별이 가능할 것으로 사 료된다.

    Figure

    Table

    Primer set for chicken microsatellite markers

    Number of alleles for chicken microsatellite markers

    Expected and observed heterozygosity and PIC value at 12 microsatellite in chicken

    Ex H: Expected Heterozygosity, Ob H: Objectived Heterozygosity, PIC: polymorphic information content

    Reference

    1. Botstein D , White R. L , Skolnik M , Davis R. W (1980) Construction of Genetic Linkage Map in Man Using Restriction Fragment Length Polymorphisms , Am. J. Hum. Genet, Vol.32 (3) ; pp.314-331
    2. Chen G. H , Wu X. S , Wang D. Q , Qin J , Wu S. L , Zhou Q , Xie F , Cheng R , Xu Q , Liu B , Zhang X. Y , Olowofeso O (2004) Cluster analysis of 12 Chinese Native Chicken populations using microsatellite markers , Asian-Aust. J. Anim. Sci, Vol.17 (8) ; pp.1047-1052
    3. Cho G. J , Cho B. W (2004) Microsatellite DNA typing using 16 markers for parentage verification of the Korean Native Horse , Asian-Aust. J. Anim. Sci, Vol.17; pp.750-754
    4. Jin H. G , Wang Y. M , Zhou G. L (2005) Analysis of microsatellite DNA polymorphisms in five China Native Cattle breeds and application to population genetics studies , Asian-Aust. J. Anim. Sci, Vol.18; pp.1696-1700
    5. Lim H. T , Seo B. Y , Jung E. J , Yoo C. K , Yoon D. H , Jeon J. T (2009a) A Comprarison of Discriminating powers Between 14 Microsatellite markers and 60 SNP Markers Applicable to the Cattle Identification Test , J. Anim. Sci. & Technol, Vol.51 (5) ; pp.353-360
    6. Lim H. T , Seo B. Y , Jung E. J , Yoo C. K , Zhong T , Cho I. C , Yoon D. H , Lee J. G , Jeon J. T (2009b) Establishment of a Microsatellite Marker Set for Individual, Pork Brand and Product Origin Identification in Pigs , J. Anim. Sci. & Technol, Vol.51 (3) ; pp.201-206
    7. Lim H. T , Kim B. W , Cho I. C , Yoo C. K , Park M. S , Park H. B , Lee J. B , Lee J. G , Jeon J. T (2011) An Empirical Study on Verifying the Estimated Discrimination and Parentage Test Powers of the 13 Traceability Microsatellite Markers for Commercial Pigs Produced by a Three-was Cross , J. Anim. Sci. & Technol, Vol.53 (1) ; pp.29-34
    8. Osman S. A. M , Sekino M , Nishibori M , Yamamoto Y , Tsudzuki M (2005) Genetic variability and relationships of native Japanese chickens assessed by microsatellite DNA profiling-focusing on the breeds established in Kochi Prefecture Japan , Asian-Aust. J. Anim. Sci, Vol.18; pp.755-761
    9. Tautz D (1989) Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers , Nucleic Acides Research, Vol.17 (16) ; pp.6463-6447
    10. Park M. H , Oh J. D , Jeon G. J , Kong H. S , Sang B. D , Choi C. H , Yeon S. H , Cho B. W , Lee H. K (2004) Method Discrimination for Product Traceability and Identification of Korean Native Chicken using Microsatellite DNA , Korean J. Organic Agriculture, Vol.12 (4) ; pp.451-461
    11. Suh S. W , Cho C. Y , Kim J. H , Choi S. B , Kim Y. S , Kim H , Seong H. H , Lim H. T , Cho J. H , Ko Y. G (2013) Analysis of Genetic Characteristics and Probability of Individual Discrimination in Korean Indigenous Chicken Brands by Microsatellite Marker , J. Anim. Sci. & Technol, Vol.55 (3) ; pp.185-194
    12. Kim K. W , Oh J. D , Lee J. A , Cho K. H , Nam I. S , Lee J. H , Seo O. S , Jeon G. J , Lee H. K , Kong H. S (2010) Estimation of Genetic Characteristic and Cumulative Power of Discrimination using the Microsatellite Markers in Korean Native Chicken , Korean J. Poult. Sci, Vol.37 (1) ; pp.81-87
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