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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.48 No.2 pp.59-67
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2014.48.2.59

Characterization of Muscle Satellite Cells In vitro

Sungkwon Park*, Yongdae Jeong
Animal Nutrition and Physiology Team, National Institute of Animal Science, Suwon 441-706, Korea
Corresponding author: Sungkwon Park, Tel: +82-31-290-1657; Fax: +82-31-290-1660; E-mail: maiky@korea.kr
August 6, 2013 November 5, 2013 February 6, 2014

Abstract

Muscle satellite cells (SCs), also known as muscle stem cells, have critical roles in growth, development and repair of skeletal muscle. This study was performed to characterize the growth and differentiation performance and phenotypic adaptation of SCs cultured in vitro. To this end, we isolated red and white portion of semitendinosus (ST) muscles and analyzed proliferation and differentiation rate, and myosin heavy chain (MyHC) isoform expression. Cell yield of RST was higher (P < 0.01) than that of WST. SCs from RST showed faster (P < 0.05) doubling time compared with those from WST. At 24 h differentiation, WST showed higher fusion index than RST but there was no difference in fusion index between WST and RST after 48 h differentiation. SCs from RST expressed mostly type I MyHC expression but those from WST expressed mostly type IIB and IIA MyHC. These results indicate that SCs cultured in vitro may remember the phenotype of their muscle of origin or destined to develop into a specific phenotype.


In vitro 방법에 의한 근육줄기세포 (muscle satellite cells)의 형질 변화 연구

박 성권*, 정 용대
국립축산과학원 영양생리팀

초록

근육의 줄기세포라고 알려진 근육위성세포(satellite cells, SCs)는 근육의 성장과 발달 및 구조적, 대 사적 형질 형성에 중요한 역할을 한다. 본 연구는 근육에서 추출한 SCs의 in vitro분화 성상과 형질을 분석함으로써 SCs가 근육의 성장 및 재생시 형질 형성에 미치는 영향을 구명하기 위해 수행되었다. 6주 령 자돈의 Semitendinosus(ST) 근육의 적색근(red semitendinosus; RST)과 백색근(white semitendinosus; WST)에서 SCs를 추출한 후 in vitro 상에서 배양하여 SCs의 증식율, 분화율, 근육 구 조단백질인 myosin heavy chain (MyHC) isoforms의 발현 성상을 분석하였다. 추출된 SCs의 숫자는 WST(63 ± 2 × 103 cells/g)보다 RST(79 ± 2 × 103 cells/g)에서 높게 (P<0.01) 나타났다. Cell doubling time은 RST에서 추출된 SCs가 WST보다 낮았고, 분화도 빨라 WST보다 먼저 근섬유를 형성하 였으나, 분화 24h 후에는 WST 유래 SCs의 분화율이 RST보다 높게 나타났다(P<0.05). 하지만, 분화 48h 후 RST와 WST의 SCs간 분화율은 차이가 없는 것으로 나타났다. MyHC type I isoform의 발현은 RST 유래 SCs에서 WST에 비해 높았으나 (P<0.01), type II isoform은 WST 유래 SCs에서 높게 나타났 다 (P<0.05). 이 결과는 in vitro에서 배양된 SCs 에서 분화한 근섬유의 성장패턴 및 형질이 유래 근육 의 형질을 그대로 반영한다는 것을 보여주는데, 이는 근육 내에 존재하는 SCs는 유래 근육의 형질을 기 억하고 있거나, 특정 형질로만 분화되도록 정해져 있다는 것을 의미한다.


    National Institute of Animal Science

    I.서론

    골격근 섬유는 대사적, 구조적, 생화학적 특성과 myosin heavy chain (MyHC) isoform 종류에 따라 type I, IIA, IIB, IIX로 분류되며, 근육의 수축 속 도와 기능은 근육을 이루고 있는 근섬유의 대사와 밀접한 관계가 있다(Schiaffino & regginai, 2011). 각각의 근섬유는 서로 다른 생리적 신호나 신체의 자극에 따라 수축 및 이완 작용이 조절되고, 근육의 움직임에 필요한 에너지의 양이나 생성 속도에 따라 빠르게 또는 느리게 수축하는 근육으로 나뉜다 (Westerblad et al., 2010). 느리게 수축하는 근육은 MyHC type I의 발현비율이 높고, 미토콘드리아에 의한 산화적 대사를 통해 ATP가 생성되기 때문에 비교적 오랜 시간 수축할 수 있다. 이러한 대사적 특성으로 myoglobin함량이 많아 붉은색을 띈다. 이 와는 반대로, 빠르게 수축하는 근육은 MyHC type IIX와 IIB의 발현이 많고, 해당과정을 통해 신속한 ATP 공급은 가능하지만 수축이 오래 지속되지는 못 하며 백색을 띈다(Ordway & Garry, 2004). 빠르게 수축하는 근육이 느린 근육에 비해 성장속도가 빠른 것으로 알려져 있는데, 이에 관한 정확한 메커니즘 은 구명되지 않았다. MyHC type IIA 근섬유는 빠르 게 수축하지만 에너지 대사 측면에서는 산화적 대사 가 높은 것이 특징이다(Baldwin et al., 1972).

    근육의 줄기세포라 불리는 위성세포(satellite cells, SCs)는 새로운 근육생성시에 nucleus의 공급 원으로써 근육의 성장 및 발달에 중요한 역할을 한 다. 근육 SCs는 근섬유막(sarcolemma)과 기저막 (basal lamina) 사이에 존재하며, 1961년 Alex Mauro의해 발견되었다(Mauro, 1961; Bischoff & Heintz, 1994) 평소 비활성상태이다가 외상과 같은 자극에 의해 활성화되어 새로운 근육으로 분화하거 나, 기존의 근섬유에 융합하여 근육을 재생한다 (Montarras et al., 2013). SCs의 대사적, 구조적 형질은 유래된 근육의 형질에 따라 다양하게 나타난 다(DiMario et al., 1993). Type I MyHC의 발현이 많고, 느리게 수축하는 근육에서 추출된 SCs가 분화 하여 형성한 근섬유에서는 type I 및 II MyHC 모두 발현되는 반면에, 빠르게 수축하는 근육에서는 type II MyHC만이 발현되었다(Feldman & Stockdale, 1991). 근육에서 추출된 SCs의 in vitro 배양에서 세 포수율, doubling time 및 분화율 또한 유래근육의 종류에 따라 성상이 다르게 나타났다(Dü sterhö ft & Pette, 1993; Rosenblatt et al., 1996). 근육 재 생에 중요한 역할을 하는 SCs는 그 성상에 따라, 분 화 후 근육의 근육성장 속도와 형질이 결정된다. 이 러한 점을 고려할 때 SCs의 분화 후 형성된 새로운 근섬유의 표현형은 근육의 성장과 대사에 많은 영향 을 줄 것으로 예상된다. 따라서, 본 연구는 돼지 semitendinosus(ST) 근육의 적색근(RST)과 백색근 (WST)으로부터 SCs를 분리, in vitro 상에서 배양 한 후, 그들의 성장 및 분화 성상을 포함한 표현형 이 유래 근육과 어떠한 차이가 나는지를 분석하기 위해 실시되었다.

    II.재료 및 방법

    2.1.Porcine Satellite Cell Isolation and Cell Culture

    6주령 자돈의 Semitendinosus(ST) 근육을 적출하 여 뼈와 근접해 있는 적색부위(red semitendinosus; RST)와 피부와 접해있는 백색부위(white semitendinosus; WST)를 분리하여 petri-dish에서 세절하였다. 세절시 지방, 혈관 및 결체조직을 제거 한 후, 근육 5g을 채취하여 protease(0.8mg/mL PBS, Sigma, USA) 용액 37 °C에서 30분간 배양하 였다. 배양기간 동안 10분 간격으로 세 번의 vortex 를 하였다. 배양 후 1,200×g에서 15분간 원심분리 하였다. 펠렛은 다시 Minimum Essential Medium (MEM, Sigma, USA)에 현탁하여 300×g에서 10 분 간 원심분리 후 상등액을 100 및 53 mm nylon mesh로 여과한 후, 1200×g에서 15분 동안 원심 분 리하였다. 분리된 근육 satellite cells(SCs)은 10% FBS가 포함된 MEM(growth media, GM)에 혼합 후 Matrigel(Gibco, USA)-coated 6 well-plate에 분 주하고 37 °C, 5% CO2에서 배양하였다. GM은 48 시간 마다 교체해 주었다. SCs가 약 80% confluent되었을 때 2% horse serum이 첨가된 MEM(differentiation media, DM)으로 교체하여 분화를 유도 하였다. DM은 24시간 마다 교체해 주 었다.

    2.2.Cell yield

    세포 분리 후 6 well-plate에서 24시간 배양 후, haemocytometer를 사용하여 세포수를 확인하였다. 세포수율은 근육 무게(g)당 분리된 세포수로 나타내 었다. 근육 무게는 enzymatic digestion 전 생시료 무게를 사용하였다.

    2.3.Cell proliferation and myogenic differentiation

    위성세포증식은 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit(Promega, USA)을 사용하여 4일 동안 24 시간 간격으로 확인하였다. RST 및 WST내 위성세 포(1×104 cells per cm2)를 Matrigel-coated 96-well plates에 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 15 μℓ dye solution을 첨가하였다. 4 시간 뒤, 100 mL stop/solubilization solution 주입 후 12시간 동안 배양하고 570 nm에서 optical density값을 측정하 였다.

    SCs fusion rate(%)는 총 핵 수를 분화된 근섬유 내 핵 수로 나눈 값으로 나타내었다. 임의로 3개의 plates를 선택하여 PBS를 이용해 rinsing 하고 100% 메탄올로 고정한 후 Giemsa solution(Gibco, USA) 으로 핵을 염색하였다.

    2.4.Cell doubling time

    RST와 WST에서 유래한 SCs를 Matrigel-coated 24-well plate에 1×104 cells per cm2씩 분주하고, 24h 후 배양액을 교체하였다. 이 시점을 0h하여 총 48h동안 0, 12, 24, 36, 48h 총 5회에 걸쳐 임의로 3개의 well을 선택하여 세포수 변화를 분석하였다. Population doubling time (PDT)은 Roth (2006)의 PDT calculating software를 활용하여 계산하였다.

    2.5.Myosin Heavy Chain Isoform Expression

    SCs의 분화가 완료되면(분화 처리 3일 후) 세포에 1ml TRIzol reagent(Invitrogen, USA) 첨가하여 total RNA를 추출하였다. 분리된 RNA는 random hexanucleotide-primed cDNA synthesis를 이용해 First-strand cDNA를 합성하였다. 10 ml의 PCR 반응액은 200 ng cDNA, 10 pmol primers 및 ABI Power SYBR Master Mix 로 구성되어 있으며 사용 된 primer는 Table 1과 같다.

    2.6.Statistics

    수집된 데이터는 SAS program(SAS, USA)을 이 용해 통계분석을 수행하였으며 처리구간 유의성 P<0.05 수준으로 하였고 Student’s T test 법으로 검증하였다. 모든 결과치는 LS means ± SE로 나 타내었고 Least square means을 계산하기 위해 LSMEANS과 Tukey’s adjustment사용하였다.

    III.결과

    3.1.Cell yield

    RST와 WST에서 추출된 SCs는 유래 근육의 형질에 따라 다르게 나타났다. RST에서 추출된 SCs 숫자는 1g 당 79±2×103, WST의 수율은 63±2×103 로 RST에서 유의적으로 높게 나타났다 (P<0.01; Fig. 1).

    3.2.Satellite cells proliferation rate and fusion index

    RST와 WST에서 추출하여 배양된 SCs의 doubling time은 각각 18 h, 21.5 h로 RST 유래 SCs가 WST 유래 ST에 비해 더 빨리 증식하는 것으 로 나타났다(P>0.01, Fig. 2). SCs의 증식율은 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit (Promega, USA)을 사용하여 세포를 염색한 후 optical density를 측정하여 분석하였는데, 세포배 양 시작 후 48h 까지는 차이가 없다가 72, 96h 에는 RST에서 증식율이 높게 나타났다(P<0.05, Fig. 2).

    근육에서 분리한 SCs의 분화정도(fusion index)를 분석하기 위해 SCs를 2.5×104 cells/cm2 농도로 6-well plates에 분주하고 분화를 유도했다. RST 유래 SCs는 24 h 경과까지 분화가 느리다가 36 h 후 분화율이 55%에 달했고, 48 h에는 60%의 분화 율을 나타내었다(Fig. 3). WST 유래 SCs는 첫 12 h 부터 분화가 활발하여 꾸준한 증가추세를 보이며 24 h에 46%, 36 h에 53%, 48 h에 62.3%의 분화율을 보였다. WST 유래 SCs는 첫 24 h까지 RST 유래 SCs보다 빠른 속도로 분화를 하였으나(P<0.05), 48 시간 뒤 RST 및 WST에서 유래한 SCs의 분화율은 유사하게 나타났다.

    3.3.Muscle fiber typing based on myosin heavy chain isoform expression

    근육의 형질을 분석하기 위해 myosin heavy chain(MyHC) isoform (Table 1.)의 발현을 real-time PCR로 분석한 결과, Semitendinosus 근육 중 느리게 수축하는 적색부위(red semitendinosus: RST)는 백색부위(WST)에 비해 type I MyHC의 발현량이 약 5배 증가하였다(P<0.01, Fig. 4). 반면에, type IIB MyHC의 발현량은WST에서 RST보다 현저히 많이 발현되었다(P<0.01).

    근육의 MyHC isoform 발현 패턴과 마찬가지로, RST와 WST에서 추출된 satellite cells(SCs)의 in vitro 상에서 분화된 myotubes에서도 적색근 유래 SCs(SCs-RST)에서 type I MyHC의 발현이 많고 type IIB의 발현은 낮게 나타났다(Fig. 5). MyHC type I의 발현은 SCs-RST에 비해 WST에서 낮았고 (P<0.01), type IIB는 SCs-WST에서 높게 나타났다 (P<0.05).

    IV.고찰

    성체 줄기세포로도 일컬어지는 근육의 satellite cells(SCs)는 평소에는 비활성 상태로 있으며 근섬유 내 basal lamina와 sarcolemma 사이에 존재한다. 근육이 성장이나 재생 신호 자극을 받거나 상처를 받으면 SCs는 활성화 되어 myotube 표면에서 proliferation 하고 근섬유 내로 이동하여 이미 존재 하는 근섬유내 nuclei를 더하거나, 새로운 근섬유를 만드는 역할을 한다(Bischoff & Heintz, 1994). 따 라서, 이번 연구에서는 새로운 근육의 형질 형성에 있어 근섬유 표면에 존재하고 있는 SCs의 역할을 구 명하기 위하여, 에너지 대사 및 수축 속도가 서로 다른 근육에서 추출된 SCs를 in vitro 상에서 배양 하여 분화된 근섬유의 형질을 분석하였다.

    선행연구들에서 느리게 또는 빠르게 수축하는 근 육 내 SCs를 추출·배양하여 형질을 분석한 결과, 설치류의 빠른 근육에서 유래된 SCs culture에서는 myosin heavy chain(MyHC) type II만 발현이 된 반면, 느린 근육에서는 type I과 II 모두 발현되는 것으로 나타났다(Matsuda et al., 1983; Düsterhöft, & Pette, 1993; Barjot et al., 1995; Rosenblatt et al., 1996). 하지만 이번 연구에서는 느리게 수축하는 적색근에서는 MyHC type I가 많이 발현되고, 빠르게 수축하는 백색근에서는 type IIB 가 지배적으로 발현되었다. 이러한 차이는 근육 SCs 배양 조건 또는 동물 종의 상이성 등에서 나타난 것 일 수도 있지만, 근육에서 추출된 SCs가 in vitro 상에서 배양되는 동안 형질이 변화되었을 가능성도 배제할 수는 없을 것이다.

    근섬유 형질 변화를 유도하기 위해 신경세포 및 전기자극 처리로 innervations 또는 devervation을 통하여 근섬유의 형질을 변화시키는 연구가 수행되 어졌다. 느리게 수축하는 근육의 신경을 제거 (denervation) 했을 경우 근육의 형질이 빠르게 수 축하는 근육의 형질로 변화되었다(Gambke et al., 1983). 서로 다른 근육의 신경을 서로 교차연결 시 에도 신경의 종류에 따라 근육 형질도 변화되는 결 과를 보였다(Thomas & Rantunga, 1993). 이러한 결과들은 근육의 형질결정 또는 변화에 있어 신경의 중요성을 나타내는 것이다. 근육에 있어 신경의 역 할은 근육에 전기자극을 전달하는 것으로 근 수축을 유도한다. 근육의 조직배양에서 전기자극의 형태에 따라 근섬유 형질이 다르게 발현되었다(Pette & Vrbová , 1999; Lømo, 2003; Huang et al., 2006). 전기자극이 근육 형질을 전적으로 변화시키 지는 않았지만 이러한 자극들이 근육의 형질을 변화 시킬 수 있다는 가능성을 시사한다는 점에서 의미가 있다.

    본 연구에서는 근육의 종류에 따라 잠재된 SCs 의 형질을 분석하기 위해 형질이 상이한 red semitendinosus(RST)와 white semitendinosus (WST) 근육에서 SCs를 분리·배양한 후 MyHC 발 현을 분석하였다. RST에서 SCs가 현저히 많이 추출 되었는데, 이는 다른 연구의 결과들과 일치하는 것 으로(Kelly, 1978; Gibson & Schultz, 1982), 그 이 유는 protein turnover에 있을 가능성이 크다. 비록 입증되지는 않았지만, 오랜 기간 근수축이 지속됨에 따라 protein turnover가 증가하고(Dadoune et al., 1978), 결과적으로 더 많은 근수축인자의 mRNA발 현을 보인다(Campbell et al., 2001). 이는 손상된 근육의 보수를 위해 높은 전사수준을 유지하기 위한 것으로 사료되며, 많은 수의 SCs 또한 구조단백질 등의 근수축 인자의 빠른 교체를 위해 필요할 것 이다.

    근육에서 추출하여 in vitro에서 배양된 SCs의 형 질과 유래근육의 형질간 비교연구는 다음과 같다. 일부는 MyHC 발현 성상에서 차이를 보였고(Wehrle et al., 1994), 다른 연구에서는 MyHC 발현이 일치 하였다(Düsterhöft et al., 1990; Barjot et al., 1998). 본 연구에서는 돼지의 RST 및 WST에서 분 리한 SCs의 in vitro 에서 분화된 근섬유내 MyHC 발현 성상이 유래 근육의 형질과 유사하게 나타났다. 이 결과는 in vitro상 MyHC발현양상은 임신초기 근 섬유형성에 관여하는 cell lineage에 의해 미리 결정 또는 제한되었을 가능성을 시사한다. 흥미롭게도, 설 치류 및 가금류와는 달리 돼지의 RST 및 WST내 SCs cultures는 type I과 type II의 co-express 뿐 만 아니라, 결과에는 나타내지 않았지만 embryonic MyHC isoform도 발현이 되었다.

    이러한 연구 결과들의 차이는 첫째로, in vitro 배양에서 신경자극의 부재일 가능성이 있다. Petridish에서 배양된 myotube가 자발적으로 수 축은 가능하지만 이는 innervation에 의한 결과는 아니다. 언급한 바와 같이, innervations은 유전자 조절을 직접 조절하거나 (Crow & Stockdale, 1986; Spangenburg & Booth, 2003), 칼슘 신호 를 통해 간접적으로 바꿀 수 있다 (Jordan et al., 2004, 2005). 그 예로, 칼슘농도조절 역할을 하는 ryanodine receptor에 문제가 생긴 halothane 양 성 돼지의 경우 MyHC isoform 발현에 큰 변화가 발생한다 (Park et al ., 2009). 둘째, SCs의 in vitro 배양에서는 in vivo의 two-dementional 환 경이 구현되기 힘들다. 또한 in vitro에서 SCs는 분 화 후 매우 짧은 기간(약 3일) 동안만 생존할 수 있 었는데, 이러한 in vitro 배양에서의 제한적인 환경 은 adult contractile 단백질 발현을 제한하는 요소 들일 것이다.

    본 연구에서는 근육의 SCs를 추출하여 배양한 결 과, SCs 분화 근섬유의 형질은, 특히 MyHC 발현은 유래된 근육의 형질에 미리 결정되어 있다는 결과를 얻었다. 향후 신경조직과의 동시 배양 및 3D matrix 구축을 통해 in vivo 환경에 조금 더 부합하는 여건 에서 근육 SCs 배양을 실시할 계획이다.

    Figure

    JALS-48-59_F1.gif

    Satellite cell (SC) number per gram muscle isolated from red semitendinosus (SCs-RST) and white ST (SCs-WST). P<0.05, significantly different from another group.

    JALS-48-59_F2.gif

    Proliferation rates of satellite cells (SCs) from red semitendinosus (SCs-RST) and white ST (SCs-WST). Data were generated at 0, 24, 48, 72 and 96 h. Results are means ± SE. *P< 0.05 vs. another group within each time point.

    JALS-48-59_F3.gif

    Fusion index of satellite cells (SCs) isolated from red semitendinosus (SCs-RST) and white ST (SCs-WST). Giemsa stained differentiated SCs which fused within one cell (A). Cell fusion index was calculated as the number of nuclei in myotubes divided by the total number of nuclei (B). Means with different letters differ (P<0.05) at each time point.

    JALS-48-59_F4.gif

    Real time PCR determination of type I and type IIB myosin heavy chain (MyHC) isoform mRNA expression of red semitendinosus (RST) and white semitendinosus (WST) muscles. *P< 0.05vs.anothergroup.

    JALS-48-59_F5.gif

    Real time PCR determination of type I and type B myosin heavy chain (MyHC) isoform mRNA expression of fully differentiated satellite cells (SCs) from red semitendinosus (SCs-RST) and white semitendinosus (SCs-WST) muscles. *P<0.05 vs. another group.

    Table

    Nucleotide sequences of the primers used for quantitative reverse transcription-PCR

    da Costa et al., 2002.

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