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ISSN : 1598-5504(Print)
ISSN : 2383-8272(Online)
Journal of Agriculture & Life Science Vol.48 No.6 pp.351-364
DOI : https://doi.org/10.14397/jals.2014.48.6.351

Immunoaffinity-HPLC/DAD Assay and Validation for Vitamin B12 in Snacks and Cereals

Da-Eun Jang1, Myoung-Gun Choung2, Jiyeon Chun1*
1Department of Food Science & Technology, Sunchon National University, Jeonnam 540-742, Korea
2Department of Herbal Medicine Resource, Dogye Campus, Kangwon National University, Hwangjori #3, Dogye-up, Samcheok 245-907, Korea
Corresponding Author : Jiyeon Chun Tel: +82-61-750-3258 Fax: +82-61-750-3208cjyfall@sunchon.ac.kr
November 20, 2014 November 26, 2014 December 4, 2014

Abstract

Naturally occurring vitamin B12 include hydroxycobalamin, adenosylcobalamin and methylcobalamin. Cyanocobalamin is a synthetic form observed in fortified food. Because vitamin B12 exists at very low concentration in food, concentration and clean-up are the crucial steps for accurate quantification. In this study, vitamin B12 assay using enzyme and heating extraction under acidic condition with cyanide and immunoaffinity-HPLC/DAD was validated and applied for vitamin B12 determination(μg cyanocobalamin/100 g) in confectionery and cereals. Accuracy and precision were good enough to meet the AOAC guidelines. Limit of detection and quantification were 0.01 and 0.03 μg/100 g, respectively. The z-score of the vitamin B12 assay in a FAPAS Proficiency test was less than 2, assuring reliability of analytical performance. The validated method was applied for determining vitamin B12 from confectionery and cereals: 0.02-0.26 and 0.03-2.67 μg/100 g, respectively. All analysis was under the control based on quality control chart of vitamin B12. This study shows that the IAC-HPLC/DAD is acceptable for the construction of reliable database on vitamin B12 for carbohydrate products.


Immunoaffinity-HPLC/DAD법을 이용한 과자류와 시리얼류의 비타민 B12 분석 및 검증

장 다은1, 정 명근2, 천 지연1*
1순천대학교 식품공학과
2강원대학교 생약자원개발학과

초록

식품에 존재하는 주요 비타민 B12는 hydroxycobalamin, adenosylcobalamin, methylcobalamin이며 cyanocobalamin은 시리얼과 같은 강화식품에 사용되는 합성형이다. 비타민 B12는 식품 중에 낮은 농도 로 존재하기 때문에 추출 및 농축과정이 매우 중요하다. 본 연구에서는 과자와 시리얼 같은 탄수화물 식품 중의 비타민 B12 추출을 위해 α-amylase처리와 산성조건과 cyanide 존재시 열처리, immunoaffinity column(IAC)로 농축과 세척, HPLC/DAD로 분리 검출하였다. 분석법 수행특성지표들을 측정함으로 분 석법을 검증하였다. 정확성과 정밀성은 AOAC 가이드라인을 충족시켰고, LOD 0.01 µg/100g과 LOQ 0.03 µg/100 g을 얻었다. 국제정도관리 시험에서 z-score 1.4로 분석수행이 우수함을 확인하였고 QC chart를 이용한 분석품질관리로 모든 분석이 관리하에 있음을 확인하였다. 검증된 분석법으로 과자류 12종과 시리얼 11종의 비타민 B12 함량을 분석하여 각각 0.02-0.26과 0.03-2.67 µg/100 g 범위를 얻었 고 이는 신뢰도높은 데이터로 식품성분표에 활용 가능할 것이며 IAC-HPLC/DAD법이 탄수화물 식품의 비타민 B12 데이터베이스 구축에 활용될 수 있을 것으로 보인다.


    Rural Development Administration
    PJ00959302

    I.서론

    최근 평균수명의 증가로 인한 급속한 고령화와 더 불어 증가하고 있는 심혈관질환, 위암, 골다공증, 인지기능저하, 치매 및 우울증과 같은 증상과 비타 민 B12의 체내 수준과의 연광성에 대한 연구들 (Bryan et al., 2002; Johnson et al., 2003; Engelborghs et al., 2004)이 보고되면서 식품 중 의 비타민 B12 함량에 대한 정확한 정보 요구가 증 가하고 있다. 현재 농진청에서 발간하고 있는 국내 식품성분표는 국가 식품수급계획 수립, 국민건강 영 양조사, 국가 영양정책 수립 뿐만 아니라 임상연구, 역학연구, 식이요법 등의 질병 관련 연구, 식품개발 등 전반에 미치는 파급 효과가 매우 크므로 데이터 의 정확성과 신뢰도를 확보하는 것이 매우 중요하다. 하지만, 식품의 비타민 B12 함량은 식품성분표 제 2 개정판부터 최근의 제 8개정판까지 수록되어 왔으나 여전히 상당수가 미국이나 일본 등의 외국데이터를 인용한 자료이고, 국내 자료도 분석법에 대한 검증 이 없이 산발적으로 이루어진 데이터의 취합이 대부 분으로 국민 건강 증진을 위한 기초자료로 활용하기 에는 많은 한계점을 보이고 있다. 따라서, 보다 효 율적인 식품성분표 개정을 위해서는 무엇보다도 데 이터 생산에 이용되는 분석법 검증과 분석품질관리 가 보증될 수 있는 분석 시스템을 구축하여 국내에 서 소비되고 있는 식품들에 대한 비타민 B12를 분석 하여 데이터를 생산하는 것이 필요하다.

    비타민 B12는 식품 중 함량이 매우 낮은 수용성 비타민으로 지용성 성분과는 달리 농축과 clean-up에 한계가 있기 때문에 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantification, LOQ)가 낮고 특이성(specificity)이 좋은 분석법을 이용하는 것이 바람직하다. 비타민 B12 분석법은 spectrophotometry(Karsilayan, 1996; Morelli, 1996), 미생물학적 분석법(Kelleher & Broin, 1991; Kwak et al., 2012; Watanabe, 2007; Watanabe et al., 2014), 그리고 HPLC법(Heudi et al., 2006) 등이 주로 이용되어 왔다. Lactobacillus leichmannii가 비타민 B12 농도에 의존하여 성장하 는 정도를 측정하는 미생물학적 분석법은 민감도 (sensitivity)가 좋아 국내외적으로 오래전부터 널 리 이용되어 왔으나 균주의 보존, 표준선 변동, 30시간 이상의 배양 시간 등에 따른 시간과 노동 력이 소요되고 숙련도가 부족한 경우 재현성이 낮 은 단점으로 인하여 최근에는 다양한 방법과 연결 된 HPLC 분석법이 널리 적용되고 있다 (Chassaigne & Lobinski, 1998; Choi et al., 2008; Szterk et al., 2012; Guggisberg et al., 2012). 이외에도 radioisotopic assay(Lau et al., 1965), chemiluminescence assay(Kumudha et al., 2015), fluorimetric assay(Pakin et al., 2005), capillary electrophoresis(Baker & Miller- Ihli, 2000), matrix-assisted laser desorption/ ionization(MALDI), time-of-flight mass spectrometry, atomic absorption spectrometry(Vinas et al., 1996), biosensor assay(Gao et al., 2008) 등의 다양한 분석법들이 이용되고 있으며 식품 매트릭스 에 따라 이들 분석법의 장단점들이 보고되고 있다.

    최근 농진청 주관으로 식품성분표 제 9개정판 개 정을 위하여 국내 소비되는 식품들을 샘플링하여 영 양성분을 분석하고, 적용된 분석법의 검증과 분석을 담당하는 실험실의 분석품질관리와 숙련도를 평가함 으로써 데이터의 신뢰도를 확보하는 영양성분 구축 사업이 시작되었다. 본 연구는 이러한 과제의 일환 으로 탄수화물 함량이 높은 식품의 비타민 B12 분석 을 위해 α-amylase 효소처리와 열처리 추출, IAC 를 이용한 정제 및 농축, HPLC/DAD 분리 및 검 출을 적용한 분석법을 검증하고, 이를 이용하여 과 자류와 시리얼류의 비타민 B12 함량 분석, 내부 및 외부 분석품질관리를 수행하여 분석 데이터의 신뢰 도를 확보하여 국내 식품성분표 개정을 위한 기초자 료를 제공하고자 한다.

    II.재료 및 방법

    2.1.시약

    본 연구에 사용된 시약은 특급 및 HPLC급 시약 을 사용하였다. 비타민 B12 표준품cyanocobalamin (purity 96.0-102.0%), α-amylase(from Aspergillus oryzae, ≥150 units/mg protein (biuret), sodium cyanide는 Sigma Aldrich사(St. Louis, MO, USA) 에서 구입하여 사용하였다. 분석에 사용되는 물 (HPLC certified solvent, Burdick & Jackson, MI, USA)과 용매는 HPLC급을 사용하였으며 완충 용액 제조를 위한 sodium acetate trihydrate는 Wako Pure Chemical Industries 제품(Japan)을 사용하였다. 분석법 검증에 사용된 표준참고물질 (Stanradard Reference Material, SRM) 1849a (infant formula)는 NIST(National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였고, 내부 분석품질관리를 위 한 시료는 상업적으로 시판되는 영아 분유(infant formula, Premium with mom, Pasteur, Korea)중 낱개로 소포장 되어 있는 형태를 구입하여 냉장 보 관하며 사용하였다.

    2.2.시료 준비

    국내에서 널리 소비되는 과자류와 시리얼 제품을 농촌진흥청에서 선정하여 대형마트에서 구입한 다음 시료를 균질화시킨 후 밀폐용기에 약 60 g 씩 소포 장하고 드라이아이스와 함께 다시 포장하여 분석실 험실로 배송되었다. 본 연구를 위하여 수집된 시료 들은 2013년 농촌진흥청이 국가 표준 식품성분표 제 9개정판을 발간하기 위한 연구사업의 일환으로 선정된 시료들이다.

    2.3.비타민 B12 추출

    비타민의 추출은 균질화된 검체(약 5 g, 분말의 경우 1~2 g)를 뚜껑이 있는 50 mL 부피의 시험관 에 정확히 칭량한 후 증류수 25 mL 을 가한 후 초 음파기(Cole-Parmer 8893, Chicago, IL, USA)를 이용하여 10분간 추출하였다. α-amylase를 약 0.05 g을 가한 후 뚜껑을 닫은 후 반응용기를 37°C shaking incubator(HB-201SF, Han-baek Scientific Co., Korea)에서 30분간 동안 진탕 반응시켰다. 실 온으로 냉각한 다음 0.2 M sodium acetate buffer (pH 4) 24.5 mL과 1% sodium cyanide 0.5 mL을 차례로 가한 후 100°C 수욕(WB-20M, JEIO TECH. Korea)에서 30분 동안 반응시켰다. 단백질 함량이 높은 시료의 100°C 에서 반응시키기 이전에 pepsin 약 1 g을 넣고 37°C에서 30분을 더 반응시 킨 다음 100°C추출액은 실온으로 냉각한 다음 여과 지(Whatman No.1, GE Healthcare, Amersham Place, UK)로 여과하였다.

    2.4.비타민 B12 농축 및 정제

    냉장보관된 IAC(Easi-Extract Vitamin B12, r-Biopharm, Glasgow, UK)는 구입시 제공된 매뉴 얼을 기준으로 변형하여 사용하였다. 실온에 30분 방치하여 컬럼 내부의 완충액을 제거한 후, 증류수 3 mL을 컬럼에 주입하여 컬럼을 활성화시킨다. 시 료 추출액 9 mL을 컬럼에 3 mL 씩 세 번에 나누 어 loading하여 추출액 중의 cyanocobalamin을 컬럼에 흡착시키고 잔여 추출액이 빠져 나오도록 하였다. 약 9 mL의 물을 주입하여 불순물을 세척 한 후 주사기를 이용하여 40 mL 용량의 공기를 주 입하면서 컬럼내의 수분을 제거하였다. 다음으로 흡 착된 cyanocobalamin을 용출시키기 위하여 methanol 3 mL을 컬럼에 주입하여 비타민 B12 추 출액을 시험관에 수거하였다. 메탄올추출액은 질소 농축기(EYELA MG-2200, Tokyo Rikakikai Co., Japan)를 이용하여 약 60-70°C 온도에서 전량 휘 발시킨 후 물(HPLC 이동상) 0.5 mL에 재용해시켰 다. 시험액은 0.45 µm membrane filter(cellulose acetate, Adventec®, DISMIC®-13CP, Japan)로 여 과하여 갈색 vial에 넣어 HPLC/DAD로 분석하였다. Table 2

    2.5.HPLC/PDA 분석

    HPLC 분석을 위한 비타민 B12 표준용액은 다음과 같이 제조하였다. Cyanocobalamin 표준품 10 mg 을 정확히 잰 후 물 10 mL에 녹여 1 mg/mL 농도 의 stock solution을 제조한 후 -18°C이하의 암소 에서 보관하며 사용하였다. Stock solution은 시료 중의 비타민 B12 농도 수준에 따라 0.005~10 μg /mL의 범위가 되도록 물로 희석하여 사용하였다. 비타민 B12 분석에 사용된 HPLC 분석조건과 이동상 용매의 gradient 조건은 각각 Table 1과 2와 같으 며 물로 사용된 이동상은 HPLC certified water를 사용하였다. 검출기를 이용하여 비타민 B12를 361 nm에서 분석하였다. 점성분석은 표준용액과 시료의 크로마토그램상에서 검출되는 피크(peak)의 머무름 시간(retention time)을 이용하였고 피크 면적을 이 용하여 정량분석한 결과를 μg/100 g으로 나타내었 다.

    2.6.분석법 검증

    분석법 검증은 단일 실험실을 위한 AOAC(2002) 와 ICH(1994)의 실험실 분석법 검증 가이드라인에 준하여 검증하였으며 검증방법은 다음과 같다. 즉, 분석법의 특이성은 표준용액 cyanocobalmin과 표 준참고물질 SRM 1849a(infant formula)를 비타민 B12 분석법에 따라 준비된 비타민 B12 시험액을 HPLC로 분석시 DAD 검출기를 이용하여 200-600 nm 범위에서의 흡광패턴 측정한다. Agilent HPLC system의 soft program을 이용하여 두 시료의 HPLC 크로마토그램에서 확인된 비타민 B12 피크의 스펙트럼을 비교하고 peak purity를 확인하였다. 직선성의 검증은 검체 중의 cyanocobalamin의 농 도를 7가지로 희석 제조하고 각 농도에서 3회 반복 측정한 평균값과 농도와의 관계를 작성하여 직선적 상관성을 확인하였다. 농도의 범위는 일반적으로 식품 중의 비타민 B12 수준을 포함하는 수준으로 결 정하였으며 여기에 농도수준 0은 포함시키지 않았 다. 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 HPLC법의 LOD와 LOQ를 구하는 방법을 이용하여 blank 시험 액을 HPLC로 분석시 얻어지는 크로마토그램의 signal-to-noise값의 평균값과 표준편차를 구하고, 이 평균값에 표준편차에 각각 3과 10을 곱한 값을 더하여 LOD와 LOQ를 구하여 최종 μg/100 g으로 나타내었다. 정확성의 검증은 인증값이 제시된 표 준참고물질 SRM 1849a의 비타민 B12 함량을 분석 한 분석치와 NIST에서 제시한 인증값을 비교하여 정확성을 계산하였다. 정확성 검증은 SRM 1849a를 분석한 분석치와 NIST에서 제시한 인증값과의 일 치하는 정도를 계산하여 회수율(%)로 나타내었다. 정밀성 검증은 QC 시료(commercial infant formula)를 이용하여 하루에 독립적으로 5회 3반복 으로 실험을 수행하여 repeatability(inter-day precision)를 계산하였고, 5일 동안 하루에 1회씩 3 반복 실험하여 이들 간 결과의 일치성을 계산하여 reproducibility(intra-day precision)로 나타내었다.

    2.7.내부 및 외부 분석품질 관리

    분석품질관리는 AOAC guideline(2002)에 따라 QC chart를 작성하여 관리하였다. 초기 관리 수 준을 결정하기 위해 시판되는 QC 시료인 영아용 분유를 최소 10회 이상 분석하여 상대표준편차가 5% 이내에 들어가는 10개 분석치를 얻고 이것을 기준으로 하여 관리 상·하한선과 조치 상·하한 선의 기준을 설정하였다. QC chart의 기준값 설 정 이후 검체를 분석할 때마다 QC 시료를 함께 분석하여 그 값을 QC chart에 기록하여 분석의 품질을 관리하였다. 외부 분석품질보증은 영국의 환경식품농림부가 주관한 국제정도관리 능력시험 프로그램인 FAPAS (Food Analysis Performance Assessment Scheme) test 2185에 참여하여 결 과를 비교분석하였다.

    III.결과 및 고찰

    3.1.분석법의 특이성(Specificity) 검증

    분석법의 특이성 검증은 표준참고물질을 분석하여 HPLC로 분리된 비타민 B12 성분의 순도를 확인하는 방법을 이용하였다(Huber, 1948). SRM 1849a에 서 비타민 B12를 추출한 시험액과 cyanocobalamin 표준용액을 HPLC로 분석한 크로마토그램과 cyanocobalamin 피크의 200-600 nm 범위에서의 얻어진 DAD 스펙트럼은 Fig 1과 같다. HPLC 분리 조건에서 표준용액의 비타민 B12 피크는 약 29.6분 에 용출되었으며 시료 크로마토그램과의 머무름 시 간을 비교하여 비타민 B12 피크를 동정하였다. Fig 1의 (C)는 두 시료 (A)와 (B)의 HPLC 크로마토그 램상의 비타민 B12 피크의 DAD 스펙트럼을 함께 비교한 것으로 200-600 nm의 전범위에서 흡광하 는 패턴이 거의 일치하는 것을 볼 수 있으며 Agilent HPLC soft program에서 측정한 비타민 B12 피크는 순도(purity) 99% 이상인 것으로 나타나 IAC를 이용시 불순물 제거에 효과적이고 HPLC/ DAD가 cyanocobalamin에 대하여 특이적으로 분리 검출하는데 효과적인 방법임을 확인하였다.

    3.2.분석법의 직선성(Linearity), 검출한계(LOD), 정량한계(LOQ)

    직선성은 검체 중에 함유되어있는 비타민 B12의 농도에 대하여 측정 반응이 직선적인 비례관계를 보 이는 정도를 나타내는 것으로 농도의 범위와 직선성 상관계수로 분석하게 된다. Cyanocobalamin 표준 품의 농도를 0.156, 0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 μg/mL의 7개 농도 수준으로 희석하여 제조하고 이를 각각 3회 측정한 평균값으로 검량선을 작성한 후 얻어진 관계식은 Table 3과 같다. 비타민 B12의 농도(x축)와 HPLC로 분석한 반응치(y축)의 상관식 은 y=2245.7x - 243.65로 나타났으며 상관계수 R2 값으로 0.9998을 얻어 고도의 직선성을 나타내는 분석법임을 확인하였다. 이는 일반적으로 식품 중에 존재하는 비타민 B12 함량을 IAC-HPLC/DAD를 이 용하여 분석시 처리하게 되는 농도 수준을 포함하는 범위로 식품 중 비교적 낮은 함량으로 존재하는 비 타민 B12의 분석에서 넓은 범위에서 고도의 직선성 을 적용하여 정량할 수 있을 것으로 보여진다.

    HPLC법의 LOD와 LOQ를 계산하는데 이용되는 신호잡음비(signal-to-noise)는 크로마토그램의 baseline에 대한 noise와 검출되는 peak의 상대 비로써 그 값이 낮을수록 해당 표준물질이 주어진 조건에서 잘 검출된다는 것을 가리킨다(Morrison, 1980). ICH(1994)에서 제시하는 방법에 따라 blank 시료를 이용하여 측정한 LOD와 LOQ는 각 각 0.01 μg/100 g과 0.03 μg/100 g이었다(Table 3). IAC를 이용한 분석법은 추출액을 컬럼상에서 농축할 때 추출액을 주입하여 cyanocobalamin을 흡착시킨 후 물을 이용하여 수용성 불순물을 제거 하게 되는데 이 때 충분한 양의 물을 사용하는 것 이 필요하며 이는 비타민 B12 이외에 361 nm에서 흡광할 수 있는 수용성 성분들을 제거하는데 매우 효과적인 것을 확인하였다(data not shown). 이 러한 clean-up 단계는 HPLC 상에서 baseline을 낮추고 noise를 제거하는 효과를 얻을 수 있어서 복잡한 매트릭스를 가진 시료를 분석시 비타민 B12 주변의 baseline을 깨끗하게 만들 수 있으므 로 LOQ 수준의 작은 피크를 정량하는 경우에 신 뢰할 수 있는 수준의 정확성과 재현성을 부여해 줄 수 있다. 다양한 HPLC를 이용한 비타민 B12 분석법의 LOD를 Table 4에 요약하였다. Table 4에서 보여주듯이 IAC나 solid phase extraction (SPE) 등을 적용하여 HPLC-DAD로 분석하는 경 우 LOD가 약 0.02~0.3 µg/100 g의 범위를 나타 내는 것을 볼 수 있는데 이러한 과정이 없이 HPLC 육방밸브전환 시스템에서 농축, 세척, 분리 및 검츨을 한 번에 수행하는 Kim et al . (2002) 의 분석법에서는 LOD가 다른 분석법에 비하여 다 소 높은 1 µg/100 g 인 것을 볼 수 있다. 이는 IAC나 SPE와 같이 HPLC 분석이전에 불순물을 효과적으로 제거하는 clean-up 방법을 효과적으 로 처리함으로 LOD를 낮출 수 있는 것으로 보여 진다. 최근, Yang et al. (2014)과 같이 HPLC와 MS 검출기를 연결하여 분석하는 방법들이 자주 시도되고 있는데 이러한 분석법은 0.0014 µg/100 g 수준까지 검출할 수 있어 비타민 B12가 미량으로 존재하는 시료를 처리하는데 효과적인 방법이다.

    3.3.정밀성(Precision)과 정확성(Accuracy) 검증

    표준참고물질 SRM 1849a(infant formula, reference value=4.82 ± 0.85 μg/100 g)와 QC 시료인 시판 분유를 이용하여 측정한 분석법의 정밀성과 정확성을 Table 3과 4에 나타내었다. IAC-HPLC/DAD로 분석한 SRM 1849a의 비타민 B12 분석값은 4.36 ± 0.18 μg/100 g이었으며 이 는 NIST가 제시한 참고값인 4.82 ± 0.85 μg/100 g과 비교할 때 90% 이상의 정확성(회수율)을 보이 는 것을 의미한다. 또한, 시판 분유로 측정한 inter-day precision(repeatability)과 intra- day precision(reproducibility)은 CV(coefficient variation) 가 각각 0.92%와 1.30%으로 낮게 나타나 분석법의 정밀성이 좋은 것으로 나타났다. 이러한 분석법의 정확성과 정밀성은 분석법의 종류와 시료 중에 존재 하는 분석 성분의 농도에 크게 영향을 받는다. 이런 특성으로 인하여 AOAC guideline(2002)은 정확성을 나타내는 지표인 회수율(recovery)에 대하여 수용가 능한 범위를 분석하고자 하는 성분의 농도가 100%, 1%, 0.01%일 경우에 따라 각각 98-101%, 92-105%, 85-110%를 충족시켜야 한다고 제시하고 있다. 본 연구에서 사용된 SRM 1849a 중의 비타민 B12 함량이 약 0.01% 농도 수준 이하라는 것을 감안 해 볼 때 수용가능한 회수율은 85-110%이며 본 연 구의 정확성 분석으로 얻어진 90.5% 회수율은 AOAC guideline 기준을 충족시키는 수준임을 알 수 있다. 또한, AOAC guideline (2002)이 제시하는 수용가능한 repeatability는 목적성분의 농도가 1%, 0.1%, 0.01%로 낮아질수록 CV%가 각각 2%, 3%, 4%로 증가하며, 10 ppb 수준의 경우 15%의 높은 CV%를 수용가능한 수준으로 제시하고 있다. 또한, 서로 다른 분석일에 분석된 결과들이 서로 일치하는 정도를 나타내는 intra-day precision (reproducibility) 에서도 목적성분의 농도가 1%, 0.1%, 0.01%에서의 수용가능한 CV값을 각각 4%, 6%, 8%로 농도가 낮아질수록 허용범위가 커지고 있으며 10 ppb 수 준에서는 32%라는 CV값을 수용가능한 범위로 인 정하고 있다. 이러한 기준과 비교해 볼 때 본 연 구에서 이용한 IAC-HPLD/DAD법으로 측정한 repeatability와 reproducibility값은 각각 0.92% 와 1.30%로 AOAC 기준인 4%와 8%에 각각 못미 치는 낮은 값으로 분석법의 재현성이 뛰어난 것 을 보여준다. Table 5

    한편, Li & Chen (2001)은 mutivitamin tablet 으로부터 12가지의 수용성 및 지용성 비타민을 추 출하여 HPLC/DAD법으로 비타민 B12를 분석하여 94.7%의 회수율을 얻었는데 이는 복잡한 매트릭스 를 가지는 식품과는 달리 비교적 단순한 매트닉스 로 인하여 높은 회수율을 얻을 수 있었던 것으로 보여진다. Kim et al. (2002)은 미생물학적 분석법 과 HPLC법을 비교하는 연구를 수행하였는데 HPLC -UV 검출시 비타민 B12의 최대 흡광도 파장인 361 nm에서 흡광할 수 있는 불순물의 간섭을 피하기 위해 검출파장을 550 nm로 선택하여 분석함으로 분유와 영양보조제로부터 78.6-107.5%의 비타민 B12 회수율을 얻었고 미생물 분석법과의 상관관계가 매우 높아 기울기가 1에 가까운 관계를 보였음을 보고하였다. Table 6

    이 외에도 Guggisberg et al. (2012)은 immunoaffinity column을 사용하여 정제와 농축 후 HPLC/UV로 분석시 육제품 중의 비타민 B12 회수율이 약 79.61~108.8% 정도였으며 Hampel et al.(2014)은 chemiluminescent enzyme immunoassay방법을 이용하여 비타민 B12를 분석하여 회수율 85.3~ 94.4%와 정밀성 4.6~7.4%를 얻었다고 보고하였 다. 이러한 분석법들의 정확성 및 정밀성에 대한 결과들은 모두 AOAC guideline (2002)이 제시하 는 기준을 충족하는 수준으로 HPLC/UV 분석법이 비타민 B12 분석에 효과적인 방법이 됨을 보여준 다. 다만 361 nm에서 비타민 B12를 검출시 불순물 을 어떻게 효과적으로 제거하는지의 clean-up 단 계가 중요하다고 보여진다.

    3.4.과자류 및 시리얼류의 비타민 B12 함량 분석

    검증된 분석법을 이용하여 과자류와 시리얼류의 비타민 B12 함량을 분석하였다. 시료는 농진청에서 수거한 국내 시판되는 과자류 12종과 시리얼류 11종 으로 비타민 B12 함량을 분석한 결과는 Table 7과 같다. 비스킷, 쿠키, 크래커, 모나카, 만주, 파이, 유과 등을 포함한 총 12종의 과자류의 비타민 B12 함량은 0.02~0.26 μg/100 g로 나타났으며, 총 11종 의 시리얼 제품은 0.03~2.67 μg/100 g의 함량 분 포를 보였다. 일일 비타민 B12 체내 필요량(RDA)이 성인은 2.4 μg이고 9-13세의 어린이는 1.8 μg인 것 으로 볼 때(KNS, 2010) 이러한 과자류의 섭취로 비 타민 B12 하루 필요량의 약 0.8%~ 10.8%, 시리얼류 의 섭취로 종류에 따라 1.3%~111% 수준까지 비타민 B12를 섭취할 수 있는 것으로 보여진다. 비타민 B12 가 주로 동물성 식품에 존재하는 것으로 알려져 있 는데 이렇게 과자류와 시리얼 제품에서도 함량이 검 출되는 이유는 과자류 제조시 밀이나 곡물 원재료 이외에 사용되는 우유, 버터, 달걀과 같은 동물성 재료들이 사용되었기 때문이며 시리얼의 경우는 합 성형인 cyanocobalamin을 하루 섭취 권장량의 100%에 해당하는 2.4 μg 정도 수준으로 첨가하기 때문이다. 하지만 과자류 중에서도 밀가루를 반죽하 여 제조하는 방식이 아니라 생감자나 고구마 등의 식물성 재료를 굽거나 튀기는 potato chip, sweet potato ship과 같은 제품에는 비타민 B12 가 존재하 지 않는 것으로 보고된다(USDA nutrient database, 2014). 시판되는 시리얼류의 경우 영양성분표시에 하루 섭취 권장량의 100%에 해당하는 2.4 μg의 비 타민 B12 가 함유되어 있다고 라벨링이 되어있는 시 료의 경우도 분석시 그 함량 수준에 미치지 못하는 제품이 상당수였다. 한편, Heudi et al. (2006)과 Campos-Gimenez et al. (2012)도 시리얼 제품의 비타민 B12 함량을 측정하였는데 추출시 α-amylase 를 사용하여 free형(cyanocobalamin)과 total cobalamins을 각각 추출한 후 immunoaffinity- HPLC/UV법으로 측정하여 약 0.87~1.2 μg/100 g의 수준의 비타민 B12가 함유되어 있다고 보고하였다. USDA nutrient database (2014)는 Kellogg's frosted flakes, Weetabix whole wheat cereal, Post, Quaker 등에서 공급하는 시리얼 및 스낵에서 비타민 B12 함량이 0.00에서부터 6.33 μg/100 g에 이르기까지 다양한 수준을 보고하고 있다. 한편, Campos-Gimenez et al. (2012)의 연구에서 우유 가 없는 영유아 시리얼에서는 비타민 B12가 검출되 지 않았다고 보고하였다. 비타민 B12의 하루 체내 필요량은 2.4 μg/100 g으로 매우 소량이어서 일반 적인 식사만으로도 하루 필요량을 충분히 섭취할 수 있으나 비타민 B12가 주로 동물성 식품에 존재하기 때문에 채식주의자의 경우 비타민 B12의 보충이 필 요하다. 또한, 위장절제환자나 노인들의 경우 비타 민 B12 흡수율이 매우 낮기 때문에 비타민 B12의 결 핍이 쉽게 나타날 수 있어 식품이나 보충제를 통한 비타민 B12의 섭취가 필요하다.

    3.5.내부 분석품질관리(internal analytical quality control)

    검증된 분석법이라 하더라도 중장기 기간동안 분 석을 지속적으로 수행하는데 있어서 다양한 변수들 의 변화(환경요인, 기기, 실험 중 사용 물질 등)가 발생할 수 있으며 이에 따라 분석 결과치가 변화될 수 있는데 이러한 반응의 정도를 확인하고 관리하기 위하여 널리 사용되는 것이 QC chart이다(AOAC, 2002). 초기 QC chart 기준값을 정하기 위해 QC 시료를 최소 10회 이상 반복 분석하여 CV가 5% 이하인 분석값 10개의 평균값인 8.43 ± 0.10 μg /100 g을 얻었으며 이것을 기준값으로 하여 평균 ± 2×표준편차와 평균 ± 3×표준편차를 각각 관리 상한선 및 하한선(upper and lower control line, UCL & LCL)과 조치상한선 및 하한선(upper and lower action line, UAL & LAL)으로 정하여 분석 품질관리를 시작하였다(Fig. 2). QC 시료는 검체를 분석할 때마다 함께 1회 이상 분석하고 이를 QC chart에 표시하여 관리 수준하에 있는지를 검토하고 0UAL과 LAL을 넘는 수준의 값을 얻은 경우 원인을 파악하여 관리수준에 들어올 수 있도록 분석 시스템 의 재정비와 함께 검체시료를 재분석하였다. 시료의 분석은 농진청의 시료 배송 계획에 따라 약 7개월간 지속되었으며 이 기간 동안 작성된 QC chart는 Fig. 2과 같았고 모든 분석 데이터가 LCL과 UCL의 범위 안에 있어 시료 분석이 이루어진 약 7개월 동 안 분석이 관리하에 진행되었음을 확인할 수 있었 다. 이러한 QC chart의 관리는 산업체에서 제품 생 산시 품질을 관리하기 위해 사용되는 방법으로 성분 을 분석하여 생산되는 분석데이터의 품질 관리에도 매우 유용한 방법으로 이용되는 방법이다. 약 7개월 동안 관리된 QC chart는 본 연구에서 분석한 시료 들의 비타민 B12 함량이 관리하에 생산된 데이터임 을 보여주는 결과로 신뢰도를 보증할 수 있는 자료 라 할 수 있다.

    3.6.외부 분석품질관리(external analytical quality control)

    분석의 품질을 관리하기 위해서는 내부적으로 QC chart를 이용하여 관리하는 것이 유용하나 국가 영 0양성분 데이터 생산에 대한 신뢰도를 실험실 외부로 부터 보증받기 위해서는 제 3의 기관으로부터의 분석품질에 관한 자료 제시가 요구된다. 국제정도 관리를 위해 분석의 숙련도를 시험하는 FAPAS Proficiency Test는 이러한 외부 분석품질관리를 위 해 이용할 수 있는 방법으로 다양한 분석법을 가진 여러 실험실에서 특정 기관이 제공하는 시험에 공동 으로 참여하고 그 결과를 비교할 수 있다. 본 연구 자들은 2013년 영국 FAPAS 2185 powdered baby food를 시료로 비타민 B12 분석한 결과, 분석값 1.82 μg/100 g과 Z-score 1.4를 얻었다. 일반적으 로 Z ≤ ±2의 범위 값을 얻는 경우 신뢰도 있는 분석이 수행되었음을 나타내는데(AOAC, 2002) 이 는 본 연구자들이 사용한 immunoaffinity-HPLC/ DAD법을 이용하여 분말형 유아 식품 매트릭스와 같 은 시료 분석시 신뢰도 있는 분석 수행이 가능함을 보여준다 하겠다.

    IV.결론

    식품은 매우 복잡한 매트릭스를 가지고 있는데 반 하여 식품 중에 존재하는 비타민 B12의 함량은 매우 낮아 이를 분리 및 검출하는데 많은 제한 요소가 따 른다. 수용성 비타민 B12는 자체적으로 형광성이 없 기 때문에 보통 UV로 검출하게 되는데 이때 최대 흡광을 보이는 361 nm에서 흡광을 보이는 수용성 물질들이 식품 중에 많이 존재하여 분석의 정확성을 낮추는 요소가 되고 있다. 본 연구에서는 비타민 B12 분석에 있어서 불순물로 작용하는 이러한 물질 들을 효과적으로 제거하면서도 농도가 낮아 검출이 어려운 비타민 B12를 농축할 수 있는 방법으로 IAC 를 선택하고 탄수화물 식품으로부터 효과적으로 비 타민 B12를 추출하기 위해 α-amaylse 효소와 산성 조건에서의 열처리를 병행하였으며, 최종적으로 정 성 및 정량 분석을 위해 고용량을 주입할 수 있는 HPLC/DAD 시스템을 적용하였다. 분석법의 검증은 cyanocobalamin 표준용액, SRM 1849a 참고물질, QC 시료를 사용하여 특이성, 직선성, 정확성, 정밀 성, LOD, LOQ 등을 포함하는 분석수행특성 지표들 을 측정하였고 각 해당 지표들이 모두 AOAC와 ICH 에서 제시하는 단일실험실의 기준을 충족시켜 탄수 화물 식품 중의 비타민 B12 분석을 위해 적용 가능 한 신뢰도가 확보된 분석법임을 확인하였다. 이를 이용하여 국가 영양성분표 개정에 필요한 과자류와 시리얼류 23종 중의 비타민 B12 함량을 분석하고 연 구하는 총 기간동안 QC chart를 이용하여 내부 분 석품질관리를 수행함으로 데이터가 생산되는 기간동 안 모든 분석이 관리하에서 진행되었음을 확인하였 다. 또한, FAPAS Proficiency Test에 참여하여 분 석품질의 우수함을 보증받음으로 생산된 분석데이터 의 신뢰성을 확보하였다. 본 연구에서 생산된 식품 중의 비타민 B12 데이터는 분석법 검증과 분석품질 관리를 기반으로 하여 생산된 데이터로 내부 및 외 부적으로 신뢰도가 확보된 결과로서 국내 식품영양성 분표를 개정하는데 활용될 수 있을것이라 사료된다.

    Figure

    JALS-48-351_F1.gif

    HPLC chromatograms of cyanocobalamin standard(A) and SRM 1849a(B) at 361 nm and their DAD spectrums(C) of vitamin B12 at the range of 200-600 nm

    JALS-48-351_F2.gif

    Quality control chart of immunoaffinity-HPLC/ DAD assay for vitamin B12

    Table

    Gradient condition of mobile phases for vitamin B12 analysis

    HPLC analysis condition for vitamin B12 analysis

    Measurement of LOD, LOQ and linearity of immunoaffinity-HPLC/DAD assay for vitamin B12

    1)The x and y variables indicate the concentration and the HPLC peak area of vitamin B12.
    2)Correlation coefficient between x and y variables
    3)LOD: limit of detection
    4)LOQ: limit of quantification

    The LOD for HPLC vitamin B12 assay in the previous studies

    1)DAD: diode array detector; ESI: electrospray mass spectrometer; FLD: fluorescence detector; IAC: Immunoaffinity column; ICP: inductively coupled plasma; MS: mass spectrometry; SPE: Solid Phase Extraction

    Accuracy of immunoaffinity-HPLC/DAD assay for vitamin B12

    1)Reference value is the true value provided by NIST.
    2)Analysis value is the experimental value obtained by immunoaffinity-HPLC/DAD assay for vitamin B12
    3)Accuracy is a measure of the closeness of the analytical result to the true value evaluated by analysing a spiked sample.

    Precision of immunoaffinity-HPLC/DAD assay for vitamin B12

    1)Standard deviation
    2)Coefficient of variation = 100×SD/mean)
    3)Repeatability refers to the results of 5 independent determinations carried out on a sample by analysing 5 replicates of the sample on the same day.
    4)Reproducibility refers to the results of 5 independent determinations carried out on a sample by analyzing 5 replicates of the sample at different periods of time.

    Vitamin B12 content in snacks and cereals

    1)RNI% = Recommended Nutrient Intake

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